专利名称：制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法
技术领域：
本发明涉及制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方法，其中所述缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。
背景技术：
随着更有效地靶向并杀灭癌细胞的药物开发，癌症治疗取得显著的进步。为了这个目的，研究人员利用癌细胞选择性表达的细胞表面受体和抗原，来开发基于抗体的药物，所述抗体与肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原结合。在这点上，已将细胞毒性分子例如细菌和植物毒素、放射性核素和某些化学治疗药物与单克隆抗体化学连接，所述单克隆抗体与肿 瘤特异性或肿瘤相关性抗原结合(参见，例如，国际专利申请WO 00/02587、WO 02/060955和WO 02/092127，美国专利5，475,092,6, 340，701和6，171，586，美国专利申请公布号2003/0004210A1，和 Ghetie 等，J.1mmunol. Methods, 112:267-277 (1988))。通常将这类化合物分别称为毒素、放射性核素和药物“缀合物”。常常也将它们称作免疫缀合物、放射免疫缀合物和免疫毒素。在药物缀合物与肿瘤细胞结合并释放药物或/和激活药物的细胞毒活性时，发生肿瘤细胞杀灭。药物缀合物所提供的选择性使对正常细胞的毒性降到最低，因此提高了药物在患者中的耐受性。先前已经描述了将抗体与含巯基的细胞毒性剂例如美登木素生物碱缀合的方法(参见，例如，美国专利5，208，020、5，416，064和6，441，163)。例如，美国专利5，208，020和5，416，064公开了制备抗体-美登木素生物碱缀合物的方法，其中首先用异双功能试剂(例如美国专利4，149,003,4, 563，304和美国专利申请公布号2004/0241174A1中所述的)修饰抗体。美国专利5，208，020和5，416，064进一步描述了经修饰的抗体与过量的含巯基的细胞毒性剂在PH 7的缀合，随后经S印hadex G25色谱柱纯化。也描述了用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化抗体一药物缀合物(参见,例如，Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci(USA)，93:8618-8623(1996)和 Chari 等，Cancer Research, 52:127-131 (1992))。先前描述用于制备抗体一药物缀合物的方法是复杂的，因为它们被用于执行或生产免疫缀合物的累赘步骤所阻碍，与最佳期望的相比，所述免疫缀合物纯度更低或更不稳定。例如，在pH为6. O 6. 5之间的缀合对于生产纯净和稳定的缀合物来说不是最佳的。此外，在这些条件下的缀合反应通常是缓慢和无效率的，导致需要应用过度的时间和材料。改变或消除一个或多个制备步骤，而不损害产物质量例如纯度和/或稳定性，将是理想的。进一步理想的是，具有除迄今为止所述的那些之外的另外的纯化选择，因为一些使用细胞结合剂、连接体和药物的某些组合的选择比使用其它的将更有效。鉴于前文所述，在本领域中存在如下需求开发改进的制备具有相当高纯度和同时具有更大稳定性的细胞结合剂-药物缀合物组合物的方法。本发明提供这样的方法。根据本文提供的本发明的说明，本发明的这些和其它优点以及另外的发明特征将是明显的。
发明内容
发明简要概述本发明提供一种制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方法，该缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。该方法包括(a)用双功能交联试剂与细胞结合剂接触，以使连接体与细胞结合剂共价连接，从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的细胞结合剂，(b)使第一混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，从而制备纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的第一混合物，(c)通过在pH为大约4至大约9的溶液中将其上结合了连接体的细胞结合剂与药物起反应，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂、(ii)游离药物和(iii)反应副产物，来使药物与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的细胞结合剂缀合，以及(d) 使第二混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂，从而制备纯化的第二混合物。发明详述本发明提供一种制备相当高纯度和稳定性的细胞结合剂-药物缀合物的方法。这样的组合物因为该缀合物的高纯度和稳定性可用于治疗疾病。包含细胞结合剂例如与药物如美登木素生物碱化学偶联的抗体的组合物描述于例如美国专利申请公布号2004/0241174A1中。在本上下文中，相当高纯度被认为是(a)大于90%，优选大于95%的缀合物种类为单体，和/或(b)缀合物制备物中游离药物水平小于2%(相对于总药物)。在这方面，本发明的方法包括(a)用双功能交联试剂修饰细胞结合剂，以使连接体与细胞结合剂共价连接，从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的细胞结合剂，(b)使第一混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以从第一混合物的其它成分中纯化其上结合了连接体的细胞结合剂，从而制备纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的第一混合物，(c)通过在pH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的细胞结合剂与药物起反应，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂、(ii)游离药物和(iii)反应副产物，来使药物与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的细胞结合剂缀合，和(d)使第二混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以除去非缀合的药物、反应物和副产物以及获得相当纯化的细胞结合剂-药物缀合物。优选地，在纯化步骤中利用切向流过滤(TFF，也称为交叉流过滤、超滤和渗滤)和/或吸附色谱法树脂。然而，当TFF用于第一个纯化步骤(步骤b)中，在(步骤c)中缀合应用的PH为6. 0-6. 5，并且于第二个纯化步骤(步骤d)中应用吸附色谱法树脂时，优选吸附色谱法树脂为非离子交换树脂。在另一个优选的实施方案中，TFF用于两个纯化步骤中，或吸附色谱法树脂用于两个纯化步骤中。替代选择地，吸附色谱法树脂用于第一个纯化步骤中，和TFF用于第二个纯化步骤中。TFF和吸附色谱法树脂的组合也可用于第一个和/或第二个纯化步骤中。可以利用任何适合的TFF系统,包括Pellicon型系统(Mi 11 ipore, Billerica, MA)、Sartocon Cassette 系统(Sartorius AG, Edgewood, NY)和Centrasette 型系统(Pall Corp. , East Hills, NY)。可以利用任何适合的吸附色谱法树脂。优选的吸附色谱法树脂包括用于羟磷灰石色谱法、疏水电荷诱导色谱法(HCIC)、疏水作用色谱法(HIC)、离子交换色谱法、混合式离子交换色谱法、固定化金属离子亲和色谱法(IMAC)、染料配体色谱法、亲和色谱法、反相色谱法及其组合的树脂。适用的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷轻憐灰石(I 型和 II 型 CHT, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)> HA Ultrogel羟磷灰石(Pall Corp. , East Hills, NY)和陶瓷氟磷灰石(I型和II型CFT，Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)。适用的 HCIC 树脂的实例为 MEPHypercel 树月旨(Pall Corp. , East Hills, NY)。适用的 HIC 树脂的实例包括 Butyl-Sepharose、Hexyl-Sepaharose、Phenyl-Sepharose 和 Octyl Sepharose 树脂(均来自 GE
Healthcare, Piscataway, NJ)以及 Macro-prep Methyl 和 Macro-Prep t-Butyl 树脂(Biorad Laboratories, Hercules, CA)。适用的离子交换树脂的实例包括 SP-Sepharose、CM-Sepharose 和 Q-Sepharose 树脂(均来自 GE Healthcare, Piscataway, NJ)和Unosphere S 树脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。适合的混合式离子交换树脂的实例包括 Bakerbond ABx 树脂(JTBaker, Phillipsburg NJ)。适用 IMAC 树脂的实例包括 Chelating Sepharose 树脂(GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 ProfinityIMAC树脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。适用染料配体树脂的实例包括Blue Sepharose 树脂(GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Aff1-gelBlue 树脂(Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)。适合的亲和树脂的实例包含Protein A Sepharose树脂(例如，MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ)，其中细胞结合剂为抗体，和凝集素亲和树脂例如 Lentil Lectin Sepharose树脂(GE Healthcare, Piscataway, NJ),其中细胞结合剂携带适当的凝集素结合部位。替代选择地，可应用对细胞结合剂特异的抗体。这样的抗体可以固定在，例如，Sepharose 4Fast Flow 树月旨(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上。适合的反相树脂的实例包括C4、C8和C18树脂(Grace Vydac, Hesperia, CA)。根据本发明的方法，制备第一混合物，其包括其上结合了连接体的细胞结合剂，以及反应物和其它的副产物。通过使第一混合物经受纯化方法，从反应物和副产物中纯化修饰的细胞结合剂。在这点上，可应用切向流过滤(TFF)例如基于膜的切向流过滤方法、吸附色谱法、吸附过滤或选择性沉淀或任何其它适用的纯化方法、以及它们的组合来纯化第一混合物。该第一个纯化步骤提供纯化的第一混合物，换言之，与根据本发明纯化前的第一混合物相比，增加了其上结合了连接体的细胞结合剂的浓度和降低了未结合的双功能交联试剂的量。在纯化第一混合物以获得纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的第一混合物后，通过在PH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的细胞结合剂与药物起反应，因此制备第二混合物，其包含(i)通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂、(ii)游离药物和(iii)反应副产物，来使药物与第一纯化的混合物中其上结合了连接体的细胞结合剂缀合。尽管缀合反应在大约PH 4至大约pH 9进行，但反应优选在pH为大约6或更低或在pH为大约6. 5或更大进行,最优选在pH为大约4至大约6或在pH为大约6. 5至大约9,尤其在pH为4至小于6或在pH大于6. 5至9。当缀合步骤在pH为大约6. 5或更大进行时，一些含巯基的药物通过二硫键形成可倾向于二聚化。在该情形下，考虑到高效率的反应，可能需要从反应混合物中除去痕量金属和/或氧，以及任选添加抗氧化剂或使用具有更反应性离去基团的连接体，或添加超过一等分量的药物。任选地，可省略修饰的细胞结合剂的纯化。在如此情形下，药物可与交联试剂同时或在稍后时间点例如在加入交联试剂后1、2、3或更多小时加入到细胞结合剂中。本发明方法可任选包括向本发明方法中所用的缀合步骤中添加蔗糖，以增加细胞结合剂-药物缀合物的溶解度和回收率。期望地，蔗糖加入的浓度为大约O. l%(w/v)至大约20%(w/v)(例如大约 O. l%(w/v) >l%(w/v)、5%(w/v) > 10%(w/v) > 15%(w/v)或 20%(w/v))。优选地，鹿糖加入的浓度为大约l%(w/v)至大约10%(w/v)(例如大约2%(w/v)、大约4%(w/v)、大约6%(w/v)或大约8%(w/v))。另外,缀合反应也可包括添加缓冲剂。可应用本领域已知的任何适用的缓冲剂。适用的缓冲剂包括例如柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。缀合步骤后，使第二混合物经受纯化步骤。在这点上，第二混合物可应用切向流 过滤(TFF)例如基于膜的切向流过滤方法、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或任何其它适用的纯化方法、以及它们的组合进行纯化，这些都在本文中提及。该第二个纯化步骤提供纯化的第二混合物，换言之，与根据本发明纯化前的第二混合物相比，增加了通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂的浓度和降低了第二混合物中的一种或多种其它成分的量。细胞结合剂可为与细胞结合的任何适合的物质，所述细胞一般和优选为动物细胞(例如人细胞)。细胞结合剂优选为肽或多肽。适用的细胞结合剂包括例如抗体(例如，单克隆抗体和其片断)、淋巴因子、激素、生长因子、营养运输分子(例如转铁蛋白)和特异性结合细胞表面上靶分子的任何其它物质或分子。本文所用的术语“抗体”是指任何免疫球蛋白，任何免疫球蛋白片断例如Fab、F(ab’)2、dsFV、sFV、双抗体和三链抗体，或免疫球蛋白嵌合体，它们可与细胞表面上的抗原结合(例如，它们含有互补决定区(CDR))。任何适用的抗体可用作细胞结合剂。本领域普通技术人员将理解，适当抗体的选择将取决于要被靶向的细胞群。在这点上，在特定细胞群(一般和优选为病态细胞群)中选择性表达的细胞表面分子(即抗原)的类型和数目将决定用于本发明组合物中的适当抗体的选择。对于广泛多种的细胞类型(包括肿瘤细胞类型)，细胞表面表达特性是已知的，或者如果不知道，可应用常规分子生物学和组织化学技术来测定。抗体可为多克隆或单克隆抗体，但最优选为单克隆抗体。本文所用的“多克隆”抗体是指异质群体的抗体分子，一般包含在免疫动物的血清中。“单克隆”抗体是指均质群体的抗体分子，其对特定抗原为特异性的。单克隆抗体一般是通过B淋巴细胞(“B细胞”)单个克隆产生的。应用本领域技术人员已知的各种技术包括标准杂交瘤技术，可获得单克隆抗体(参见，例如,KohIcrfB Milstein, Eur. J. Tmmunol , 5:511-519 (1976)，Harlow 和Lane (编辑)，Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988),和 C. A. Janeway 等(编辑)，Immunobiology,第五版，Garland Publishing, New York, NY (2001)) 简要地，生产单克隆抗体的杂交瘤方法一般包括给任何适用的动物(一般和优选为小鼠)注射抗原(即“免疫原”)。随后处死动物，将从其脾脏分离出的B细胞与人骨髓瘤细胞融合。产生杂交细胞(即“杂交瘤”)，其在体外无限地增生和连续地分泌具有期望特异性的高滴度抗体。本领域已知的任何适当的方法可用于鉴定产生具有期望特异性的抗体的杂交瘤细胞。这样的方法包括例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白印迹分析和放射性免疫测定法。筛选杂交瘤群体以分离各个克隆，每个克隆分泌针对抗原的单一抗体种类。因为每个杂交瘤为由与单一 B细胞融合产生的克隆，其产生的所有抗体分子在结构上是相同的，包括它们的抗原结合部位和同种型。也可应用其它合适的技术生产单克隆抗体，包括EBV-杂交瘤技术(参见，例如,Haskard 和 Archer, J.1mmunol. Methods, 74 (2) : 361-67 (1984),和Roder 等,Methods Enzymol, 121:140-67 (1986))、卩遼菌体载体表达系统(参见，例如,Huse等，Science, 246:1275-81 (1989))或包含抗体片断如Fab和scFv (单链可变区)的噬菌体展示文库(参见，例如，美国专利5，885，793和5，969，108，和国际专利申请WO 92/01047和 WO 99/06587)。单克隆抗体可从任何适合的动物中分离或在其中产生，但是优选在哺乳动物中，更优选在小鼠或人中，和最优选在人中产生。在小鼠中产生抗体的方法对本领域技术人员来说是众所周知的，并被描述在本文中。至于人抗体，本领域普通技术人员将理解，多克隆 抗体可从用适当抗原接种或免疫过的受试人的血清中分离出来。替代选择地，通过适应性改变在非人类动物例如小鼠中产生人抗体的已知技术可产生人抗体(参见，例如，美国专利 5，545，806,5, 569，825 和 5，714，352，以及美国专利申请公布号 2002/0197266A1)。虽然是人类治疗应用的理想选择，人抗体，尤其人单克隆抗体，通常比小鼠单克隆抗体更难以产生。然而，小鼠单克隆抗体当给人施用时，引起快速宿主抗体应答，这可减少抗体药物缀合物的治疗或诊断潜能。为了防止发生这些并发症，优选单克隆抗体不被人免疫系统认为是“外来物”。为了这个目的，噬菌体展示可用于产生这种抗体。在这点上，应用标准分子生物学和重组DNA技术，可产生编码抗体的抗原结合可变(V)域的噬菌体文库(参见，例如，Sambrook 等(编辑)，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第三版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York(2001))。为了特异性结合期望的抗原，选择编码具有期望特异性的可变区的噬菌体，并重新构建包含所选可变域的完全人抗体。将编码重构抗体的核酸序列引入适当的细胞系如用于杂交瘤生产的骨髓瘤细胞中，使得具有单克隆抗体特性的人抗体由该细胞分泌(参见，例如，Janeway等，上文，Huse等,上文和美国专利6，265，150)。替代选择地，单克隆抗体可由对特异性人重和轻链免疫球蛋白基因是转基因的小鼠生产。这样的方法是本领域已知的，并被描述于例如美国专利5，545，806和5, 569, 825以及Janeway等，上文中。最优选地，抗体是人源化抗体。本文所用的“人源化”抗体是其中小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR)(其形成抗体的抗原结合环)嫁接在人抗体分子的框架上的抗体。由于小鼠和人抗体框架的相似性，本领域中公认这种方法产生的单克隆抗体与人抗体是抗原相同的，但能与产生CDR序列的小鼠单克隆抗体结合相同的抗原。生产人源化抗体的方法是本领域中众所周知的，并被详细地描述在例如Janeway等,上文，美国专利5，225，539、5，585，089和5，693，761，欧洲专利号0239400B1，和英国专利号2188638中。也可应用美国专利 5，639，641 和 Pedersen 等，J. Mol Biol，235:959-973 (1994)中所述的抗体表面再建技术，产生人源化抗体。尽管本发明组合物的缀合物中所用的抗体最优选为人源化单克隆抗体，但如上所述的人单克隆抗体和小鼠单克隆抗体也在本发明的范围内。
具有至少一个抗原结合部位并因此识别和结合位于靶细胞表面上的至少一个抗原或受体的抗体片断，也在本发明的范围内。在此方面，完整抗体分子的蛋白酶剪切可产生多种抗体片断，所述抗体片断保留识别和结合抗原的能力。例如用木瓜蛋白酶有限消化抗体分子一般产生三个片断，其中两个是相同的且称作Fab片断，因为它们保留母体抗体分子的抗原结合活性。用胃蛋白酶裂解抗体分子正常产生两种抗体片断，其中一种保留了该抗体分子的两个抗原结合臂，因此称作F(ab’)2片断。用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab’)2片断产生称作Fab’片断的片断。应用常规重组DNA技术，可产生单链可变区片断(sFv)抗体片断,它由截短的Fab片断组成,所述Fab片断包含经合成肽与抗体轻链的V域连接的抗体重链的可变(V)域(参见，例如，Janeway等，上文)。类似地，通过重组DNA技术,可制备二硫化物稳定的可变区片断(dsFv)(参见,例如，Reiter等，ProteinEngineering, 7 :697-704 (1994))。然而,本发明上下文中的抗体片断不限于这些抗体片断的示例类型。可应用任何适合的能识别和结合期望细胞表面受体或抗原的抗体片断。抗体片断进一步描述在例如 Parham, J.1mmunol, 131:2895-2902 (1983), Spring 等 J. Tmmunol,113:470-478 (1974)，和 Nisonoff 等 Arch. Biochem. Biophys.，89:230-244 (1960)。应用本·领域已知的任何适用方法例如放射性免疫测定法(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀法和竞争性抑制测定法，可以测定抗体-抗原结合(参见，例如，Janeway等，上文，和美国专利申请公布号2002/0197266A1)。此外，所述抗体可为嵌合的抗体或其抗原结合片段。“嵌合的”是指抗体包含至少两个获自或产生自至少两种不同种类的免疫球蛋白或其片断(例如，两种不同的免疫球蛋白，如与鼠免疫球蛋白可变区组合的人免疫球蛋白恒定区)。抗体也可为结构域抗体(dAb)或其抗原结合片段,例如，骆骑化(camelid)抗体(参见，例如，Desmyter等，Nature Struct. Biol, 3:752，(1996)),或藍鱼抗体，例如，新抗原受体(IgNAR)(参见，例如，Greenberg 等，Nature,374:168 (1995)和 Stanfield 等，Science,305:1770-1773(2004))。任何适用的抗体可用于本发明的上下文中。例如单克隆抗体J5为鼠IgG2a抗体，其对常见急性淋巴细胞性白血病抗原(CALLA)有特异性(Ritz等，Nature,283:583-585 (1980))，可用于靶向表达CALLA的细胞(例如，急性淋巴细胞性白血病细胞)。单克隆抗体MY9为鼠IgGl抗体，其特异性结合CD33抗原(Griff in等，LeukemiaRes. ,8:521(1984)),可靶向作用于表达⑶33的细胞(例如，急性髓性白血病(AML)细胞)。类似地，单克隆抗体抗_B4(也指作B4)为鼠IgGl抗体，其结合B细胞上的⑶19抗原(Nadler等，J.1mmunol.，131:244-250 (1983))，可用于靶向表达CD19的B细胞或病态细胞(例如，非何杰金淋巴瘤细胞和慢性淋巴性白血病细胞)。_01为鼠单克隆抗体，其结合神经内分泌起源的细胞包括小细胞肺肿瘤上发现的CD56(神经细胞粘附分子)抗原，它可用于缀合物中使药物靶向于神经内分泌起源的细胞。J5、MY9和B4抗体在它们用作缀合物的一部分之前，优选被表面重建或人源化。抗体的表面重建或人源化描述于例如，Roguska等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 91:969-73 (1994)。此外，单克隆抗体C242结合CanAg抗原(参见例如，美国专利5，552，293)，可用于使缀合物靶向于表达CanAg的肿瘤，例如结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌。HuC242为单克隆抗体C242的人源化形式(参见例如，美国专利5，552，293)。生产HuC242的杂交瘤保藏于ECACC，鉴别号为90012601。应用CDR嫁接方法学(参见，例如，美国专利5，585，089,5, 693，761和5，693，762)或表面再建技术(参见，例如，美国专利5，639，641)，可制备HuC242。HuC242可用于使缀合物靶向于表达CanAg抗原的肿瘤细胞，例如，结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌细胞。为了靶向于卵巢癌和前列腺癌细胞，抗MUCl抗体可用作缀合物中的细胞结合剂。抗 MUCl 抗体包括例如，抗 HMFG-2 (参见，例如，Taylor-Papadimitriou 等，Int. J. Cancer,28:17-21 (1981))、hCTM01 (参见，例如，van Hof 等，Cancer Res.，56:5179-5185 (1996))和DS6。通过应用抗-前列腺特异性膜抗原(PSMA)作为细胞结合剂如J591，前列腺癌细胞也可被缀合物靶向(参见，例如，Liu等，Cancer Res.，57 :3629-3634(1997))。另外，应用抗体曲妥珠单抗，可以靶向表达Her2抗原的癌细胞例如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。与胰岛素样生长因子受体结合的抗IGF-1R抗体也可用于缀合物。尤其优选的抗体为人源化单克隆抗体，其实例包括huN901、huMy9_6、huB4、 huC242、曲妥单抗、比伐单抗、西罗珠单抗和利妥昔单抗(参见，例如，美国专利5，639，641和5，665，357，美国临时专利申请号60/424，332 (其相关于美国专利专利公开号 2005/0118183A1),国际专利申请 WO 02/16401，Pedersen 等，上文，Roguska 等，上文，Liu 等，上文，Nadler 等，上文，Colomer 等，Cancer Invest. , 19:49-56 (2001), Heider等,Eur. J. Cancer,31A:2385-2391 (1995), Welt 等,J. Clin. Oncol,12:1193-1203 (1994),和Maloney等，Blood，90:2188-2195 (1997))。最优选地，抗体为huN901人源化单克隆抗体或huMy9-6人源化单克隆抗体。其它优选的抗体包括CNT095、huDS6、huB4和huC242。其它人源化单克隆抗体是本领域已知的，可结合本发明使用。虽然细胞结合剂优选为抗体，但细胞结合剂也可为非抗体分子。适用的非抗体分子包括例如，干扰素(例如，α、β或γ干扰素)、淋巴因子(例如，白细胞介素2(IL-2)、IL-3、IL-4或IL-6)、激素(例如胰岛素)、生长因子(例如，EGF、TGF-a、FGF和 VEGF)、集落刺激因子(例如，G-CSF、M-CSF 和 GM-CSF (参见，例如 Burgess, ImmunologyToday, 5:155-158 (1984))、生长抑素和转铁蛋白(参见，例如，O’Keefe等，JBiol.Chem.，260:932-937 (1985))。例如，与髓样细胞结合的GM-CSF可用作细胞结合剂靶向于急性髓细胞白血病细胞。此外，与活化T细胞结合的IL-2可用于预防移植嫁植物排斥，用于治疗和预防移植物抗宿主病，和用于治疗急性T细胞白血病。表皮生长因子(EGF)可靶向于鳞癌如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向成神经瘤细胞和其它肿瘤细胞类型。缀合物可包含任何适合的药物，一般为细胞毒性剂。本文所用的“细胞毒性剂”是指导致细胞死亡、引诱细胞死亡或减少细胞生存力的任何化合物。适用的细胞毒性剂包括例如，美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物、紫杉烷类(taxoids)、CC-1065和CC-1065类似物和多拉司他汀和多拉司他汀类似物。在本发明优选的实施方案中，细胞毒性剂为美登木素生物碱，包括美坦西醇和美坦西醇类似物。美登木素生物碱为抑制微管形成的化合物，对哺乳动物细胞具有强毒性。适合的美坦西醇类似物的实例包括具有修饰的芳环的那些和在其它位置具有修饰的那些。这样的美登木素生物碱被描述在例如，美国专利 4，256，746,4, 294，757,4, 307，016,4, 313，946,4, 315，929,4, 322，348,4, 331，598、4，361，650,4, 362，663,4, 364，866,4, 424，219,4, 371，533,4, 450，254,5, 475，092、5，585，499,5, 846，545 和 6，333，410 中。具有经修饰的芳环的美坦西醇类似物的实例包括(1)C-19-去氯(美国专利4，256，746)(通过LAH还原安丝菌素(ansamytocin) P2制得)，(2) C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利4，361，650和4，307，016)(通过应用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)脱甲基或应用LAH脱氯而制得)和(3)C_20_去甲氧基、C-20-酰氧基(-0C0R)、+/-去氯(美国专利4，294，757)(通过应用酰基氯酰化而制得)。在除芳环以外的位置具有修饰的美坦西醇类似物的实例包括(1)C-9_SH(美国专利4，424，219)(通过用H2S或P2S5与美坦西醇反应制得)，(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利4，331,598)，(3) C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美 国专利4，450，254)(由诺卡氏菌(Nocardia)制得)，(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4，364，866)(通过用链霉菌转换美坦西醇而制得)，(5) C-15-甲氧基(美国专利4，313，946和4，315，929)(从滑桃树(Trewia nudiflora)中分离出的)(6) C-18-N-去甲基(美国专利4，362，663和4，322，348)(通过用链霉菌将美坦西醇脱甲基而制得)和(7)4，5-脱氧(美国专利4，371，533)(通过三氯化钛/LAH还原美坦西醇而制得)。本发明优选的实施方案中，缀合物应用含有硫醇的美登木素生物碱DM1，也称为N2/ -脱乙酰-N2' -(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，作为细胞毒性剂。DMl的结构由式(I)表示
I O
oQY^n^^sh
I!OH
MeO ,
m在本发明另一个优选的实施方案中，缀合物应用含有硫醇的美登木素生物碱DM4，也称为N2'-脱乙酰-N2' -(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素，作为细胞毒性剂。DM4的结构由式(II)表示
权利要求
1.制备抗体-细胞毒性剂缀合物的方法，该方法包括下列步骤(a)用双功能交联试剂接触抗体，以使连接体与抗体共价连接，从而制备第一混合物， 该混合物包含其上结合了连接体的抗体，(b)通过在pH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的抗体与细胞毒性剂起反应，使细胞毒性剂与第一混合物中其上结合了连接体的抗体缀合，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，(ii)游离细胞毒性剂和(iii) 步骤(b)期间产生的反应副产物，以及(c)使第二混合物经受切向流过滤、选择性沉淀、吸附过滤、吸附色谱法或其组合，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，从而制备纯化的通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体的第二混合物；其中所述第一混合物不经受纯化。
2.权利要求1的方法，其中所述的吸附色谱法选自羟磷灰石色谱法、疏水电荷诱导色谱法、疏水作用色谱法、离子交换色谱法、混合式离子交换色谱法、固定化金属离子亲和色谱法、染料配体色谱法、亲和色谱法、反相色谱法及其组合。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的溶液的pH为大约4至大约6.O。
4.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的溶液的pH为大约6.5至大约9。
5.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的溶液包含蔗糖。
6.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的溶液包含缓冲剂，其选自柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。
7.制备抗体-细胞毒性剂缀合物的方法，该方法包括下列步骤(a)用双功能交联试剂接触抗体，以使连接体与抗体共价连接，从而制备第一混合物， 该混合物包含其上结合了连接体的抗体，(b)使第一混合物经受选择性沉淀、吸附过滤或吸附色谱法，从而制备纯化的其上结合了连接体的抗体的第一混合物，(c)通过在PH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的抗体与细胞毒性剂起反应，使细胞毒性剂与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的抗体缀合，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，(ii)游离细胞毒性剂和(iii)反应副产物，以及(d)使第二混合物经受切向流过滤、选择性沉淀、吸附过滤或吸附色谱法，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，从而制备纯化的通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体的第二混合物。
8.权利要求7的方法，其中在步骤(d)中使用切向流过滤。
9.权利要求7的方法，其中在步骤(b)中使用吸附色谱法，并在步骤(d)中使用切向流过滤。
10.制备抗体-细胞毒性剂缀合物的方法，该方法包括下列步骤(a)用双功能交联试剂接触抗体，以使连接体与抗体共价连接，从而制备第一混合物， 该混合物包含其上结合了连接体的抗体，(b)使第一混合物经受切向流过滤、选择性沉淀、吸附过滤或吸附色谱法，从而制备纯化的其上结合了连接体的抗体的第一混合物，(C)通过在PH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的抗体与细胞毒性剂起反应，使细胞毒性剂与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的抗体缀合，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体、(ii)游离细胞毒性剂和(iii)反应副产物，以及(d)使第二混合物经受选择性沉淀、吸附过滤或吸附色谱法，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，从而制备纯化的通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体的第二混合物，条件是，如果在步骤(b)中所述第一混合物经受切向流过滤，那么在步骤(d)中所述第二混合物不经受吸附色谱法。
11.权利要求10的方法，其中在步骤(b)和(d)中使用吸附色谱法。
12.权利要求7 11任何一项的方法，其中所述的吸附色谱法选自羟磷灰石色谱法、疏水电荷诱导色谱法、疏水作用色谱法、离子交换色谱法、混合式离子交换色谱法、固定化金属离子亲和色谱法、染料配体色谱法、亲和色谱法、反相色谱法及其组合。
13.权利要求7 11任何一项的方法，其中步骤(c)中的溶液的pH为大约4至6.O。
14.权利要求7 11任何一项的方法，其中步骤(c)中的溶液的pH为6.5至大约9。
15.权利要求7 11任何一项的方法，其中步骤(c)中的溶液包含蔗糖。
16.权利要求7 11任何一项的方法，其中步骤(c)中的溶液包含缓冲剂，其选自柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。
17.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的抗体为单克隆抗体。
18.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的抗体为人源化单克隆抗体。
19.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的抗体为嵌合抗体。
20.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的抗体选自huN901、huMy9_6、huB4、 huC242、曲妥单抗、比伐单抗、西罗珠单抗、CNT095、huDS6和利妥昔单抗。
21.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的细胞毒性剂选自美登木素生物碱、紫杉烷类和CC1065。
22.权利要求21的方法，其中所述的细胞毒性剂为美登木素生物碱。
23.权利要求22的方法，其中所述的美登木素生物碱包含硫醇基。
24.权利要求23的方法，其中所述的美登木素生物碱为-脱乙酰-N -(3-巯基_1_氧代丙基)-美登素。
25.权利要求23的方法，其中所述的美登木素生物碱为N2'-脱乙酰-N2'-(4-甲基_4_疏基-1-氧代戍基)-美登素。
26.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的抗体经化学键与所述的细胞毒性剂化学偶联，所述的化学键选自二硫键、对酸不稳定的键、对光不稳定的键、对肽酶不稳定的键、硫醚键和对酯酶不稳定的键。
27.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的双功能交联试剂选自3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯、4-(2-吡啶二硫基)丁酸N-琥珀酰亚氨基酯、4-(2-吡啶二硫基)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯、4-(马来酰亚氨基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚氨基酯、N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)、 K -马来酰亚氨基i^一酸N-琥珀酰亚氨基酯、 -马来酰亚氨基丁酸N-琥珀酰亚氨基酯、ε -马来酰亚氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、Ν-(α -马来酰亚氨基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚氨基-6-( β -马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸酯、4-(对-马来酰亚氨基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚氨基酯、N-(对-马来酰亚氨基苯基)_异氰酸酯、N-琥珀酰亚氨基-4-(碘代乙酰基)_氨基苯甲酸酯、碘醋酸 N-琥珀酰亚氨基酯、溴乙酸N-琥珀酰亚氨基酯和3-(溴乙酰氨基)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯。
28.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的双功能交联试剂是4-(2-吡啶二硫基)丁酸N-琥珀酰亚氨基酯。
29.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的双功能交联试剂是4-(2-吡啶二硫基)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯。
30.权利要求1 11任何一项的方法，其中所述的双功能交联试剂是4-(马来酰亚氨基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚氨基酯。
全文摘要
本发明涉及一种制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法。本发明提供的制备与细胞毒性剂化学偶联的抗体的方法包括使连接体与抗体共价连接、纯化步骤、使细胞毒性剂与抗体缀合和随后的纯化步骤。
文档编号A61P35/00GK102989000SQ201210308200
公开日2013年3月27日 申请日期2006年8月14日 优先权日2005年8月24日
发明者戴勇, 王勇, 晋圣瑾, D·H·梅舒拉姆, G·W·阿姆弗莱特 申请人:伊缪诺金公司