一种甜高粱组织培养快速育苗的方法与流程

本发明涉及一种植物组织培养技术领域，特别是涉及能源植物甜高粱的组织培养技术。

背景技术：
甜高粱(英文名SweetSorghum，拉丁名SorghumbicolorL.Moench)是起源于非洲热带大陆的高杆一年生C4草本植物，，因其生长迅速、抗逆性强、糖分积累快、生物学产量高、乙醇产量高、乙醇转化率高等特点，成为一种优良的饲料作物、糖料作物和可再生的能源作物，有着“沙漠中的骆驼”的美誉，被认为是最具开发潜力的能源植物之一。在石油资源面临枯竭的严峻形势下，甜高粱作为能源作物已受到全世界的广泛重视，近些年投入大量的人力和物力进行研究开发。现代基因工程技术尤其是转基因技术在农业上的应用取得了新突破。甜高粱作为世界上第五大农作物，同时又是适应性较强的能源作物，逐渐成为现代农业基因转化的目标能源植物之一。其中，采用转基因技术对甜高粱品种进行营养改良、抗病虫、低木质素含量及高乙醇产率等，这些研究已成为目前的研究热点并展示出良好的应用前景。然而，与大多数禾本科植物的组织培养不同，甜高粱在人工诱导愈伤组织方面存在着很多困难，被认为是最难进行组织培养的品种之一。因而，加强对甜高粱愈伤组织诱导及再生植株的体外繁殖的研究就很有必要，这将对甜高粱新品种的培育起到很大的推动作用。

技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述现有甜高粱体外繁殖技术存在的缺陷和不足，提供一种甜高粱的体外繁殖方法，以拓宽甜高粱组织培养和遗传转化的基因型范围，以实现利用转基因技术对能源植物进行遗传改良，进而实现现代基因工程技术在农业领域应用的新突破。一种采用甜高粱种子组织培养快速育苗方法，按照下述步骤进行：(1)种子处理a、将甜高粱种子在10％(v/v)NaClO中浸泡2h，期间不停搅拌；b、用蒸馏水清洗3遍后，于暗处静置过夜；c、用10％(v/v)NaClO浸泡20min；d、在超净工作台中，用无菌水清洗3～5遍，将其接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养。(2)愈伤组织诱导将接种的培养基转移至培养箱，每天光照16h，光照强度1400-1500lux(勒克斯)，温度25℃±1℃，无菌条件下培养3～5d后，种子开始萌动，1周后开始有愈伤形成，并伴随有新芽或者新叶的形成，诱导愈伤选用培养基为MS基础培养基，补充2,4-D1～3mg/L，6-BA1～3mg/L，蔗糖30g/L，脯氨酸0.7～1g/L,KH2PO41～2g/L,CuSO41～3μM,pH为5.8。(3)生芽生根培养4周后，在无菌条件下将新长成的愈伤组织转移至生根培养基上，温度25℃±1℃，光照16h，光强1500～2000lux，7～10d后开始生根，且速度较快，2周后，可将生根的甜高粱苗进行过渡栽培。其中，步骤(3)生根培养基选用MS基础培养基，补充IAA1～3mg/L，蔗糖30g/L，脯氨酸0.7～1g/L,KH2PO41～2g/L,CuSO41～3μM,pH为5.8。通过具体的实验对本发明的研究方法进行了描述，与现有技术相比具有如下的优点及结果：本发明采用甜高粱种子组织培育方法，既可繁殖优良品种，又可从种子实生苗中选取优异的株苗用作遗传转化实验，避免花费大量金钱和精力。本发明方法可行，操作简单，可以为人们进行杂交育种及遗传转化实验，提供了一种有效的途径。缩短了甜高粱的培养周期，利用正交实验，摸索出能诱导甜高粱愈伤组织形成的最适激素配比，能在较大程度上促进愈伤及生芽、生根的形成，缩短甜高粱的培养周期。附图说明附图1-7为实施例一中的实验效果图。图1培养3d后种子萌动；图2培养2周后愈伤组织；图3愈伤组织切块2周后；图4愈伤增殖3周后；图5丛生芽的产生；图6根的产生；图7成苗；其中A为无菌苗转移至营养土中培养1周，B为大花盆中培养2周。具体实施方式：下面结合实例和附图详细说明6-BA6-b苄氨基嘌吟(6-BenzylaminoPurine)NAAα-萘乙酸(1-NaPhthylaceticacid)2,4-D2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid)MS基础培养基配方如下:实施例一：本发明选择甜高粱种子为外植体，在MS培养基上添加不同的激素配比，诱导愈伤组织，分化及生根诱导。具体操作过程为：选取外植体选取成熟饱满的甜高粱种子100颗。愈伤诱导及芽分化将种子置于培养皿中，采用10ml10％进行表面消毒2h，期间置于摇床上不停搅拌；弃去次氯酸钠，清洗干净，用蒸馏水浸泡过夜；用10ml10％(v/v)的NaClO消毒20min，无菌条件下放入愈伤诱导培养基中。培养基配方为MS基础培养基上添加2,4-D1mg/L，6-BA2mg/L，蔗糖30g/L，脯氨酸0.7～1g/L,KH2PO41～2g/L,CuSO41～3μM,pH为5.824℃，在光照培养箱中培养10～15d诱导获得愈伤组织，继续培养30～40d时，可从愈伤组织中再生出大量的丛生芽，具体实验效果见图1，图2，图3，图4和图5。经过统计，100颗甜高粱成熟种子诱导芽分化率可达到90％以上。丛生芽生根培养转移分化成芽的愈伤组织至生根培养基上进行生根诱导培养，25℃，光照条件下培养15～20d，诱导生根，得到再生植株(图6)。其中，生根培养基配方为MS基础培养基上添加IAA1.5mg/L，蔗糖30g/L，脯氨酸0.7～1g/L,KH2PO41～2g/L,CuSO40.15～0.3mg/L，pH为5.8。移栽至温室打开培养瓶封口，将再生植株炼苗4～6d，移栽至温室即可(图7)。实施例二：本发明选择甜高粱种子为外植体，在MS培养基上添加不同的激素配比及营养物质，诱导愈伤组织，分化及生根诱导。具体生产过程为：(1)选取外植体选取成熟饱满的甜高粱种子100颗。(2)愈伤诱导及芽分化将种子置于培养皿中，采用10ml10％(v/v)的NaClO表面消毒2h，期间置于摇床上不停搅拌；弃去次氯酸钠，清洗干净，用蒸馏水浸泡过夜；用10ml10％质量分数次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗3～5遍，无菌条件下接种到愈伤诱导培养基中。培养基配方为MS基础培养基上添加2,4-D3mg/L，6-BA1.0mg/L，蔗糖30g/L，脯氨酸0.7～1g/L,KH2PO41～2g/L,CuSO41～3μM,pH为5.8。25℃，在光照培养箱中培养15～20d诱导获得愈伤组织；分化培养，30～40d时，可从愈伤组织中再生出大量的丛生芽。经过统计，100颗甜高粱成熟种子诱导芽分化率只能达到65％左右。(3)丛生芽生根培养转移分化成芽的愈伤组织至生根培养基上进行生根诱导培养，25℃，光照条件下培养20～30d，诱导生根，得到再生植株。其中，生根培养基配方为MS基础培养基上添加IAA2.0mg/L，蔗糖30g/L，脯氨酸0.7～1g/L,KH2PO41～2g/L,CuSO40.15～0.3mg/L，pH为5.8。(4)移栽至温室打开培养瓶封口，将再生植株炼苗4～6d，移栽至温室即可。