一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

农业害虫是限制农作物高产、稳产的重要因素。每年被害虫侵吞的粮食约占总产量的1/4。长期以来，人们寄希望于化学农药，但是单一地使用化学农药，面临着环境污染、残毒上升、人畜中毒等问题，害虫抗药性也直线上升，用药浓度不断提高，防治费用不断增加。在防治害虫的同时，也杀害了天敌，破坏了生态平衡。由此，作为一种防治农林害虫的新技术手段，微生物农药在世界范围内受到广泛重视，其主导产品就是以苏云金杆菌(bt)为代表的一系列微生物农药制剂。

苏云金杆菌(bacillusthuringiensis，简称bt)是世界上使用最广、产量最大的生物杀虫剂，但商品bt制剂在生产上应用也存在速效性差、药效不稳定、田间持效性短等缺点，已成为影响bt实际用于推广的主要制约因素。

苏云金芽孢杆菌是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌,其突出特征是在芽孢形成过程中，可产生伴孢晶体蛋白。伴孢晶体蛋白由一种或多种蛋白组成,具有高度特异杀虫活性，这种蛋白通常被称为杀虫晶体蛋白。伴孢晶体蛋白以原毒素的状态存在，当它进入敏感昆虫的消化道后，在碱性环境中溶解并被蛋白酶激活成毒性多肽，活化的毒性多肽与昆虫中肠道的纹缘膜上的受体相结合，并且在细胞膜上形成孔道，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞裂解，最终导致幼虫的死亡。

目前，市售的bt杀虫剂，主要是将bt发酵液中的发酵产物进行富集，然后制成制剂，混杂了bt孢子、伴孢晶体和营养体等各种成分，其中伴孢晶体含量低、稳定性差，田间使用时，易因紫外线辐射、雨水冲刷等问题，导致bt制剂药效不稳定、持效期短，影响了这类生物农药的推广和使用。

因此，上述技术问题的解决，将为农业生产提供杀虫效果更稳定、活性更高的bt制剂，促进此类生物农药的推广使用，从而更好的保护生态环境。

技术实现要素：

本发明针对bt晶体蛋白无法直接用于制备杀虫剂的问题，提供了一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用，该制备方法制得伴孢晶体蛋白的外表面均匀的包覆了一层脂肪酸薄膜，不仅没有影响伴孢晶体蛋白活性，对二化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的毒性没有降低，而且还具有更强的耐雨水冲刷能力和抗紫外线照射能力，为保障晶体蛋白在田间环境条件下的生物有效性和持效性提供了新的技术支持。

具体技术方案如下：

一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将固体脂肪酸溶解于有机溶剂中，得到脂肪酸溶液；

(2)将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白加入至脂肪酸溶液中，在35℃～40℃下以1000～1500转/分钟的转速进行剪切，使伴孢晶体蛋白与脂肪酸发生交联反应，离心，收集沉淀，烘干，得到表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

本发明中，苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体通过上述覆膜，抗紫外线辐射的能力和耐雨水冲刷的性能得到了提高。

进一步地，步骤(1)中，所述的固体脂肪酸为硬脂酸、软脂酸和月桂酸中的一种或两种以上的混合物。

硬脂酸，即十八烷酸，结构简式为ch3(ch2)16cooh；软脂酸，为十六烷酸，又名棕榈酸，结构简式为ch3(ch2)14cooh。二者均为饱和高级脂肪酸，不溶于水，易溶于有机溶剂，是一类阴离子表面活性剂，其分子的一端为长链烃基，与有机物和聚合物有一定的相容性，另一端为极性羧基，与蛋白晶体表面的羟基能够发生化学键合。

进一步地，步骤(1)中，所述的有机溶剂为正丁醇、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳和乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合物。

作为优选，硬脂酸宜用正丁醇进行溶解，软脂酸宜用乙醇进行溶解，月桂酸宜用甲醇进行溶解。

伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比会影响晶体表面覆膜的完整性。进一步地，步骤(2)中，所述伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比为1：0.1～10。

作为优选，所述伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比为1：1～6。

剪切的转速和时间会影响晶体的完整性和覆膜的连续性，剪切速度过慢，晶体无法在脂肪酸的溶液中均匀分散，从而导致晶体聚集部位无法覆膜，剪切速度过快，则有可能打碎晶体，影响晶体蛋白活性；加热温度过高则易使晶体蛋白丧失活性，温度过低则不易发生化学键合反应，从而导致晶体蛋白无法覆膜。

进一步地，步骤(2)中，所述剪切的时间为20～40min。

进一步地，所述离心的速度为3000～5000转/分钟，时间为5～6分钟。

本发明提供了一种如上述制备方法制得的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

本发明还提供了所述的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白在制备生物杀虫剂中的应用，其中，所述生物杀虫剂的制剂不受限制，主要包括悬浮剂、可分散粒剂、干悬浮剂、种衣剂、油悬浮剂和水乳剂等；可用于有效防治如水稻、小麦、玉米、大豆、蔬菜、果树、棉花和园林花卉树木等农作物和林业上的鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目和同翅目等害虫。

本发明还提供了一种生物杀虫剂，为油悬浮剂，以质量百分数计，包括以下组分：

其余为油酸甲酯；

其中，所述表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的数量为5×10¹⁰～8×10¹¹个，由表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法制得。

本发明还提供了该生物杀虫剂的制备方法，包括：

(a)采用表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法制得的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白；

(b)将所述表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白与乳化分散剂、嵌段聚醚、有机膨润土和油酸甲酯混合后，剪切、磨碎后，得到生物杀虫剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法通过在苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的外表面均匀包覆一层脂肪酸薄膜，实现伴孢晶体蛋白的表面覆膜工艺，获得的产物，不仅没有影响伴孢晶体蛋白的活性，对二化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的毒性没有降低，而且还具有更强的耐雨水冲刷能力和抗紫外线照射能力，为保障晶体蛋白在田间环境条件下的生物有效性和持效性提供了新的技术支持。

(2)本发明制备表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的方法简单，覆膜后的晶体蛋白抗逆性强，在植物叶片上的附着性更好，防治害虫效果佳；对环境污染少，对人和牲畜安全。

附图说明

图1为实施例1中表面覆膜前后的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的扫描电镜图；

其中，a为表面覆膜前的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白；b为表面覆膜后的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

具体实施方式

下述实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不脱离以下公开的本发明精神和范围的情况下可以做出许多其它可能的修改方案和变化方案。另外，说明书仅用于举例说明的目的，所使用的术语在性质上为描述性的而非限制性的，因此，本发明可以以具体描述之外的方式实施。

本发明所采用的脂肪酸(包括硬脂酸(c18h36o2)、软脂酸(c16h32o2)、月桂酸(c12h34o2)和有机溶剂均为市售产品。

实施例1表面覆膜的苏芸金杆菌伴孢晶体蛋白的制备

1、苏芸金杆菌伴孢晶体蛋白的分离

取1g苏芸金杆菌发酵后的固体不溶物，150ml、质量分数为40％的peg-4000，150ml、质量分数为40％的k2hpo4-kh2po4(3:1)和200ml的水；将上述各成分均置于分液漏斗中，震荡混合，静置至分层；其中，上层为芽孢，中间层为伴孢晶体蛋白，下层为营养体。

2、利用硬脂酸对苏芸金杆菌伴孢晶体蛋白的表面覆膜

称取3g硬脂酸，溶于50ml正丁醇中，将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白10g，投入硬脂酸-正丁醇溶液中，40℃条件下，用剪切机以1500转/分钟剪切30分钟；5000rpm/min离心，收集沉淀，用乙醇清洗沉淀，洗掉多余的硬脂酸；再次离心，收集沉淀，35℃温度下烘干备用。

通过扫描电镜对覆膜前后的bt伴孢晶体蛋白进行表征，结果如图1所示。从图片中可以看出，改性前的bt伴孢晶体蛋白表面较平滑，晶角及各棱边尖锐；改性后的bt伴孢晶体蛋白的表面均匀的包覆了一层脂肪酸，晶角及棱边钝化。

实施例2覆膜改性后的bt伴孢晶体蛋白的耐雨水冲刷效果

取新鲜的青菜叶片，用全自动喷雾装置在叶片上分别均匀喷上覆膜前后的伴孢晶体蛋白，静置晾干；然后，用人工降雨模拟装置，分别冲淋叶片；冲淋10次和20次后分别取样，静置晾干。

将叶片裁剪成大小相同、直径约5.5cm的圆形；将8mlph为10.0的碱性溶液加入6cm的培养皿中，每处理取5片叶片，将喷过晶体蛋白的一面朝下，依次漂浮于水面上，60转/分钟旋转震荡，每片叶片清洗5分钟，将叶片上的晶体蛋白充分溶解于碱液中。

以未冲淋叶片为对照，测量每个处理溶解下来的蛋白含量，比较叶片上的伴孢晶体蛋白的残留量。

试验结果见表1：

表1.人工降雨冲淋叶片后残留的bt伴孢晶体蛋白的浓度

从表1中的数据可以看出：覆膜前，叶片上残留的bt伴孢晶体蛋白量随雨水冲淋次数增加而迅速下降，在冲淋20次后，叶片上的蛋白减少了71.3％，已经被冲淋掉了大部分晶体蛋白；而覆膜后，叶片上残留的bt伴孢晶体蛋白量下降速度要减缓很多，在冲淋20次后，叶片上的晶体蛋白为冲淋前的67.4％，依然保存了大部分的bt伴孢晶体蛋白。

实施例3紫外线照射覆膜前后的bt伴孢晶体蛋白对稻纵卷叶螟幼虫的毒力

将覆膜前后的bt伴孢晶体蛋白分别置于培养皿中，紫外灯照射，每隔2、4、6、8、16、24小时取样。

将取出的样品配制成3×10⁷个/ml的浓度。选取室内培养的健壮一致的4叶期水稻苗，洗净，晾至表面无水痕，待用；将准备好的稻苗在配制好的溶液中浸渍30s，取出晾干，用脱脂棉包住根部保湿，置于大号试管中；每个试管挑取10头三龄期稻纵卷叶螟幼虫，管口用黑色棉布罩住。处理后的试虫置于温度为25±1℃、相对湿度为70％～80％、光照周期为l：d＝(16:8)h条件下饲养和观察。

每处理设3个重复，并以不含晶体蛋白的制剂作为空白对照。72小时后检查稻纵卷叶螟幼虫的死亡率(见表2)。

表2覆膜改性前后的bt伴孢晶体蛋白对稻纵卷叶螟致死效果对比

实施例4紫外线照射覆膜前后的bt伴孢晶体蛋白对二化螟幼虫的毒力

将覆膜前后的bt伴孢晶体蛋白分别置于培养皿中，紫外灯照射，每隔2、4、6、8、16、24小时取样。

将取出的样品配制成3×10⁷个/ml的浓度。选取室内培养的健壮一致的分蘖期水稻苗，洗净，剪成10cm长的带根稻茎，晾至表面无水痕，待用；将准备好的稻苗在配制好的溶液中浸渍30s，取出晾干，用脱脂棉包住根部保湿，置于大号试管中；每个试管挑取10头三龄期二化螟幼虫，管口用黑色棉布罩住。处理后的试虫置于温度为25±1℃、相对湿度为70％～80％、光照周期为l：d＝(16:8)h条件下饲养和观察。

每处理设3个重复，并以不含晶体蛋白的制剂作为空白对照。72小时后检查二化螟幼虫的死亡率(见表3)。

表3.覆膜改性前后的bt伴孢晶体蛋白对二化螟致死效果对比

从表3中的数据可以看出，覆膜前的bt伴孢晶体蛋白，在经紫外线照射4小时后，对二化螟的杀虫活性开始下降，紫外线照射24小时后，杀虫活性下降了近三分之一。而覆膜后的bt伴孢晶体蛋白，在紫外线照射24小时后，仍保留了84.9％的杀虫活性。

这是因为bt伴孢晶体蛋白经覆膜改性后，其表面的脂肪酸膜阻挡了紫外线对晶体蛋白活性的伤害，从而延长了晶体蛋白对紫外线的抗逆性。

实施例5表面覆膜的bt伴孢晶体蛋白油悬浮剂(od)的配制

本实施例制备的表面覆膜的bt伴孢晶体蛋白油悬浮剂，由以下质量百分比的成分组成：

bt伴孢晶体蛋白5％(约8×10¹¹个)；

乳化分散剂of-346210％；

乳化分散剂of-34733％；

嵌段聚醚55003％；

有机膨润土2％；

油酸甲酯补足至100％。

其中，bt伴孢晶体蛋白为实施例1制得的表面覆膜的bt伴孢晶体蛋白。

具体制备方法为：将以上各组分混合后，上剪切机剪切30min，剪切机转速为3000～5000转/分钟，然后用砂磨机沙磨1h，过滤，即得到表面覆膜的bt伴孢晶体蛋白油悬浮剂的成品，供田间药效试验使用。

实施例6表面覆膜的bt伴孢晶体蛋白防治稻纵卷叶螟的田间药效试验效果

本实施例选取实施例1和实施例5制得的覆膜的bt晶体蛋白，制成1亿/ml的油悬浮剂(od)进行田间药效实验，以常用的化学杀虫剂氯虫苯甲酰胺悬浮剂(sc)和市售bt可湿性粉剂(wp)作为对照药剂，清水作为空白处理(ck)，采用无人机飞防喷雾法进行。调查药后8天和15天的防治效果，每处理查4点，每点5×0.11平方。采下所有虫苞，剥查活虫数。

结果统计见表4和表5。

表4覆膜后bt伴孢晶体蛋白防治田间稻纵卷叶螟的杀虫效果(浙江嘉兴，2018)

注：大区试验，每处理1.25亩；调查时大区分方向取4个小区，每小区5点，每点0.11m²。表5覆膜后bt伴孢晶体蛋白防治田间稻纵卷叶螟的保叶效果(浙江嘉兴，2018)

注：大区试验，每处理1.25亩；调查时大区分方向取4个小区，每小区5点，每点0.11m²。

从表4和表5中的数据可以看出：覆膜后的bt伴孢晶体蛋白无论是在杀虫效果上，还是在保叶效果上，均与化学药剂20％氯虫苯甲酰胺悬浮剂20ml/亩处理的效果接近，二者无显著性差异；且明显优于市售32000iu/gbt可湿性粉剂100g/亩的处理结果。

实施例7覆膜bt伴孢晶体蛋白防治二化螟的田间试验效果

本实施例选取实施例1和实施例4制得的覆膜bt晶体蛋白，制成1亿/ml的油悬浮剂(od)进行田间药效实验，在二化螟1～2龄幼虫发生高峰期，以常用的化学杀虫剂氯虫苯甲酰胺悬浮剂(sc)和市售bt可湿性粉剂(wp)作为对照药剂，，清水作为空白处理，采用无人机飞防喷雾法进行。

调查药后21天的防治效果，采用五点取样法，每点调查10丛水稻，统计10丛水稻内总枯心株数，同时全田调查50丛分蘖数，计算枯心率、防治效果。结果统计见表6。

表6.改性后bt伴孢晶体蛋白防治田间二化螟的杀虫效果(浙江温岭，2018)

注：每处理4个重复，每小区采用5点取样法调查，每点10丛。

从表6中可以看出，改性后的1亿晶体/毫升bt油悬浮剂100亿/亩处理对二化螟的防效为76.6％，明显优于市售32000iu/gbt可湿性粉剂100g/亩，与化学药剂20％氯虫苯甲酰胺悬浮剂20ml/亩处理的效果接近，二者无显著性差异。