一种慈姑组培苗快速繁殖方法及培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种慈姑组培苗快速繁殖方法及培养 基。
【背景技术】
[0002] 慈姑（SagittariatrifoliaL.)属泽泻科慈姑属多年生水生草本植物，以其球莖 供食用，为冬春蔬菜供应淡季的主要水生蔬菜之一。慈姑具有较高的药用和保健价值，性 味苦甘、微寒、无毒，有凉血、止血、解毒、消肿之功效。产品主要出口销往东南亚国家，近几 年国内外市场销量大增，产品供不应求，种植慈姑已成为农民增收有效途径之一。
[0003]目前慈姑生产上多采用可食用球茎无性繁殖，用种量大，成本高，且球茎不耐储 存。慈姑组织培养仅有初步的研究报道，目前主要采用传统的固体培养基培养，操作过程中 需要大量的手工劳动，而且由于慈姑的内生菌污染十分严重，继代培养2?3次后仍不断 出现污染，增殖率低，不利于慈姑的快速繁殖。可见，降低慈姑内生菌污染是一个亟待解决 的难题。
[0004] 间歇浸没式生物反应器主要是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对 植物组培苗进行间歇式的浸没培养，这种培养方式减少培养环节，同时减少人工耗费，降低 生产成本，基于这种优势，国内外利用间歇浸没式生物反应器进行研究的植物种类不断增 多，但是目前尚未有使用间歇浸没式生物反应器进行慈姑组织培养的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述技术问题，本发明的发明人经过创造性的劳动，发明了一种慈姑组培苗 快速繁殖方法及培养基，该方法利用间歇浸没式生物反应器及相应的培养基配方进行慈姑 的组织培养，污染率低，增殖率高。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种慈姑组培苗快速繁殖方法，该方法使用间歇 浸没式生物反应器进行慈姑的组织培养，包括以下步骤：
[0007] (1)取慈姑外植体，经脱毒后在固体培养基中培养3周，再接种入间歇浸没式生物 反应器中；
[0008] (2)利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对慈姑组培苗进行培养；其 中，所述液体继代培养基的配方为：MS+NAA0? 3?LOmg/L+6-BAL0?2. 5mg/L，pH值为 5. 0 ?5. 4〇
[0009] 优选地，步骤（1)中所述的慈姑外植体为慈姑匍匐茎茎尖，长度为1?2cm。 [0010] 优选地，步骤（1)中所述的慈姑外植体的脱毒方法为：将慈姑外植体浸没于含洗 衣粉水中，冲洗30min,晾干后，用75%乙醇30s,0. 1 %升萊IOmin消毒,后用无菌水冲洗 3?5次。
[0011]优选地，步骤（1)中所述的固体培养基配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0. 5mg/L，固 体培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂3. 8g/L，pH值为5. 8?6. 2;脱毒后的慈姑外植体在固 体培养基中的培养条件为：培养温度25?28°C，光照10h/d，黑暗14h/d，光照强度1000? 15001x。
[0012] 优选地，在步骤（1)中，将脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中培养3周后，接入 间歇浸没式生物反应器中，接种密度是8?15株/L。
[0013] 优选地，在步骤（2)中所述的液体继代培养基的配方为：MS+NAA0? 5mg/L+6-BA 2. 5mg/L，pH值为 5. 0 ?5. 4。
[0014] 优选地，在步骤（2)中，间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸 没的同时保持持续输入过滤空气，连续培养6周。
[0015] 优选地，在步骤（2)中，间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度18001x，光照 20h/d，黑暗4h/d，充气泵气压0. 05?0. 08Mpa，温度28±2°C。
[0016] 本发明还提供了一种慈姑组培苗间歇浸没式培养的液体继代培养基，该液体继代 培养基的配方为：MS+NAA0? 3?LOmg/L+6-BAI. 0 ?2. 5mg/L，pH值为 5. 0 ?5. 4 ;进一 步地，所述液体继代培养基的配方优选为：MS+NAA0. 5mg/L+6-BA2. 5mg/L，pH值为5. 0? 5. 4。
[0017] 本发明通过以上技术方案，实现了以下有益效果：
[0018] (1)本发明的液体继代培养基不添加糖，并将pH值调整至5. 0?5. 4 ;相比添加糖 的传统培养基，本发明的培养基降低了污染率，同时由于PH值相比传统的培养基偏酸性， 有利于抑制细菌的生长，但不影响植株的生长；本发明减少了人工操作，降低了人工操作过 程中的人为污染；通过以上方式，使慈姑组培苗污染率降低至16%，大大低于传统组培方 法的慈姑组培苗污染率60% ;
[0019] (2)使用适合慈姑特点的培养条件、培养环境和培养基，改变光照温度等环境因 子，将光照时间由传统光照的每天16h提高至20h，温度提高到28±2°C，通过提高植株光 合作用，自身积累更多养分，保证植株正常生长；利用间歇浸没的方法使植株充分接触营养 液，吸收效果好，液体的不断搅动防止有害物质的积累及次生代谢产物积累的危害，提高了 慈姑组培苗的增殖率，增殖系数达18. 4,高于传统的组培方式其增殖系数4. 3。本发明大大 提高了慈姑组培苗的增殖率；
[0020] (3)本发明方法采用慈姑匍匐茎无性繁殖，节约用种，采集保存方便且污染率低， 可在短时间内获得大量组培苗，使生产周期缩短，效率更高，更适于工厂化生产。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0022] 实施例1
[0023] 取长度为Icm的慈姑匍匐茎茎尖，浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用 75%乙醇30s，0. 1 %升汞IOmin消毒，后用无菌水冲洗3次；将脱毒后的慈姑外植体接种入 固体培养基中培养3周，其中，固体培养基的配方为：MS+6-BA2.Omg/L+NAA0. 5mg/L，蔗糖 浓度为30g/L，琼脂3. 8g/L，pH值为5. 8 ;脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中的培养条件 为：培养温度25°C，光照10h/d，黑暗14h/d，光照强度IOOOIx;再将慈姑组培苗接种入间 歇浸没式生物反应器中，接种密度是8株/L;利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养 基对慈姑外植体进行培养，其中，液体继代培养基的配方为：MS+NAAO. 3mg/L+6-BAI.Omg/L，pH值为5.0 ;间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸没的同时保持持续 输入过滤空气，连续培养6周；间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度18001x，光照20h/ d，黑暗4h/d，充气泵气压0. 05Mpa，温度26°C。
[0024] 实施例2
[0025] 取长度为2cm的慈姑匍匐茎茎尖，浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用 75%乙醇30s，0. 1%升汞IOmin消毒，后用无菌水冲洗5次；将脱毒后的慈姑外植体接种 入固体培养基中培养3