专利名称：试管慈姑组织培养快速繁殖的方法
技术领域：
本发明属于农业育种领域，具体地指一种试管慈姑组织培养快速繁殖的方法。
背景技术：
慈姑为多年生水生草本植物，以其球茎供食用，我国是慈姑原产地之一，长江流域及其以南各省普遍栽培，太湖沿岸及珠江三角洲为主产区，北方少量栽培。慈姑主要以慈姑球茎或球茎顶芽作种进行无性繁殖，繁殖系数低，一年只繁殖一代，用种量大，限制了慈姑新优品种的推广速度。因此，通过组织培养快速繁殖进行试管慈姑的生产是解决上述问题的有效途径之一。现阶段，慈姑的组织培养研究工作主要由国内研究人员进行，而国外对其研究较少。贵州师范大学等开展了一些研究工作，但只得到慈姑试管苗和匍匐茎。慈姑试管苗和匍匐茎不利于远距离运输和忙存。
发明内容
本发明的目的是针对无性繁殖的慈姑的种球带病和种性退化问题，提供一种试管慈姑组织培养快速繁殖的方法，提高慈姑的品质。本发明试管慈姑组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤:I)外植体的消毒处理:选取无病虫危害的慈姑球茎，清洗干净后，切取球茎顶芽为外植体，流水冲洗20 35min，滤干后剥去最外面I 2层鳞片进行消毒处理，先用质量分数为72%硫酸链霉素处理10 30min，再用质量分数为70%乙醇表面消毒20 40s，最后用质量分数为0.l%HgCl2溶液处理2 5min ；
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2)茎尖分化:消毒处理后的慈姑用无菌水冲洗4 5次，剥去2 3层鳞片，切取茎尖接种于启动培养基上，所述启动培养基为1/2MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0 2.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1 0.5mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为O
0.5%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度25°C 28°C，光照强度1000 1500 lx，每天光照时间10h，直至长成再生小植株；3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所述增殖培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0 3.0 mg/L、萘乙酸(NAA)
0.1 0.3mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为O 0.5%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度251: 281:，光照强度1000 1500 lx，每天光照时间10h，直至萌发形成分株的慈姑试管苗；4)诱导试管慈姑:将慈姑试管苗转接到诱导培养基上，所述诱导培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0 3.0mg/L、萘乙酸(NAA)O 0.3mg/L、活性炭(AC)0.5
1.0g/L、质量分数为3.0% 8.0%的蔗糖和质量分数为O 0.5%的琼脂，pH值为5.8
6.0，在培养温度14°C 22°C，每天光照时间O 12h的条件下诱导形成试管慈姑。本发明在外植体的消毒处理中，延长了质量分数为72%硫酸链霉素的处理时间，相应缩短了 0.1%升汞的处理时间。因为升汞(HgCl2)的毒性很大，在对外植体进行消毒的同时，也对外植体造成很大的伤害，重则导致材料死亡，所以在对消毒处理步骤优化后，可以将慈姑茎尖成活率提高了 5 10个百分点。本发明在茎尖分化阶段中，选择慈姑茎尖分化启动培养基中的基本培养基为1/2MS培养基，将MS的大量元素进行减半。这样，由于降低了无机盐的浓度更加有利于根的分化，从而将慈姑茎尖分化率提高了 2 3个百分点，同时也降低了培养基的成本。本发明在继代增殖阶段中，由于6-BA浓度高易导致组培试管苗分化过多，苗小，生长慢，有畸形苗，且6-BA的累积易引起组培试管苗玻璃化，造成组培试管苗死亡率高，且性状难以稳定。因此，通过优化增殖培养基中6-BA的浓度，在降低增殖培养基中6-BA的浓度的同时又能提高组培试管苗的成活率。本发明在诱导试管慈姑阶段中，在诱导培养基中添加了活性炭AC。AC的添加不仅给试管慈姑提供了更加适于诱导的暗环境，还可吸附离体培养中的抑制物，同时AC对高质量浓度的6-BA和NAA等也产生一定的吸附作用，有利于诱导出更多、更大且整齐度高的试管慈姑。本发明通过组织培养进行试管慈姑的繁殖，具有以下优点:第一，繁殖系数高，繁殖周期短，且整个繁殖过程均在人工控制的条件下进行，不受外界环境影响，可以进行周年生产，一年可繁殖6 8代；而慈姑常规生产用种一年只可繁殖一代。本发明极大提高了慈姑的繁殖速度，有利于优新慈姑品种的推广应用。第二，试管慈姑因其体积小、重量轻，既便于远程运输，又减少了用种的损耗率节约了运输费用，解决了慈姑试管苗不利于远程运输和贮存的问题。常规慈姑单个重25 40g,传统生产方式每亩用种量为100kg,而单个试管慈姑仅重0.1 0.3g,每亩用种量
0.4 1.2kg，可节约运输费 用80%以上，减少用种损耗率20%以上。第三，试管慈姑不带病，解决了慈姑常规用种易带病的问题。通过茎尖组培快繁得到的试管慈姑不带病，田间生长抗病能力强，表现为植株高大，叶色浓绿，茎杆粗壮，生长势强。第四，试管慈姑的诱导将为球茎膨大机理的研究工作提供一个可操作的简单系统。第五，作为离体休眠器官，还可以进行慈姑种质资源离体室内保存研究，且有利于国际间种质资源的活体交换。综上所述，本发明为慈姑产业的发展提供了一种快速、方便、有效的繁殖方法。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例1以江苏地方品种宝应紫圆慈姑(俗称“刮老乌”)的顶芽为外植体，经过外植体的消毒处理、茎尖分化、继代增殖、诱导形成试管慈姑，包括如下步骤:I)外植体的消毒处理:选取无病虫危害的慈姑球茎，清洗干净后，切取球茎顶芽为外植体，流水冲洗约30min，滤干后置超净工作台上剥去最外面2层鳞片进行消毒处理，即先用质量分数为72%硫酸链霉素处理30min，再用质量分数为70%乙醇表面消毒30s，最后用质量分数为0.l%HgCl2溶液处理3min ；2)茎尖分化:消毒处理后的慈姑用无菌水冲洗5次，用解剖刀剥去3层鳞片，将茎尖剥离至仅剩2个叶原基，切取茎尖0.5cm接种于启动培养基上。所用启动培养基为1/2MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)l.0mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖，PH值为6.0，在温度为28°C，光照强度为1000 Ix下，每天光照10h，30d即可长成具有4叶的再生小植株；3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所用增殖培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 2.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖，pH值为6.0，在温度为28°C，光照强度为1200 Ix下，每天光照10h，40d萌发形成分株的慈姑试管苗；4)诱导试管慈姑:将慈姑试管苗转接到诱导培养基上，所用诱导培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)l.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.lmg/L、活性炭(AC)1.0g/L、质量分数为6.0%的蔗糖，pH值为6.0，在温度22°C，全黑暗条件下，60d以后诱导形成试管慈姑。实施例2以江苏地方品种宝应紫圆慈姑(俗称“刮老乌”)的顶芽为外植体，经过外植体的消毒处理、茎尖分化、继代增殖、诱导形成试管慈姑，包括如下步骤:I)外植体的消毒处理:选取无病虫危害的慈姑球茎，清洗干净后，切取球茎顶芽为外植体，流水冲洗约25min，滤干后置超净工作台上剥去最外面2层鳞片进行消毒处理，即先用质量分数为72%硫酸链霉素处理20min，再用质量分数为70%乙醇表面消毒40s，最后用质量分数为0.l%HgCl2溶液处理5min ；2)茎尖分化:消毒处理后的慈姑用无菌水冲洗5次，用解剖刀剥去3层鳞片，将茎尖剥离至仅剩2个叶原基，切取茎尖0.5cm接种于启动培养基上。所用启动培养基为1/2MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)l.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.4mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5%的琼脂，pH值为5.8，在温度为25°C°C，光照强度为1000 Ix下，每天光照10h，32d即可长成具有7叶的再生小植株；3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所用增殖培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.2mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.2%的琼脂，pH值为5.8，在温度为25°C，光照强度为1500 Ix下，每天光照10h，35d萌发形成分株的慈姑试管苗；4)诱导试管慈姑:将慈姑试管苗转接到诱导培养基上，所用诱导培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.lmg/L、活性炭(AC)1.0g/L、质量分数为7.0%的蔗糖和质量分数为0.3%的琼脂，pH值为5.8，在温度20°C，每天光照时间4h的条件下，55d以后诱导形成试管慈姑。实施例3以江苏地方品种宝应紫圆慈姑(俗称“刮老乌”)的顶芽为外植体，经过外植体的消毒处理、茎尖分化、继代增殖、诱导形成试管慈姑，包括如下步骤:I)外植体的消毒处理:选取无病虫危害的慈姑球茎，清洗干净后，切取球茎顶芽为外植体，流水冲洗约35min ，滤干后置超净工作台上剥去最外面I层鳞片进行消毒处理，即先用质量分数为72%硫酸链霉素处理lOmin，再用质量分数为70%乙醇表面消毒30s，最后用质量分数为0.l%HgCl2溶液处理2min ；2)茎尖分化:消毒处理后的慈姑用无菌水冲洗5次，用解剖刀剥去3层鳞片，将茎尖剥离至仅剩I个叶原基，切取茎尖0.5cm接种于启动培养基上。所用启动培养基为1/2MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.4mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.2%的琼脂，pH值为6.0，在温度为28°C，光照强度为1200 Ix下，每天光照10h，35d即可长成具有4叶的再生小植株；3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所用增殖培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)3.0 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.2mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.4%的琼脂，pH值为5.8 6.0，在温度为25°C°C，光照强度为1500 Ix下，每天光照10h，40d萌发形成分株的慈姑试管苗；4)诱导试管慈姑:将慈 姑试管苗转接到诱导培养基上，所用诱导培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 3mg/L、活性炭(AC) 0.5g/L、质量分数为8.0%的蔗糖和质量分数为0.3%的琼脂，pH值为6.0，在温度20°C，每天光照时间8h的条件下，55d以后诱导形成试管慈姑。实施例4以江苏地方品种宝应紫圆慈姑(俗称“刮老乌”)的顶芽为外植体，经过外植体的消毒处理、茎尖分化、继代增殖、诱导形成试管慈姑，包括如下步骤:I)外植体的消毒处理:选取无病虫危害的慈姑球茎，清洗干净后，切取球茎顶芽为外植体，流水冲洗约30min，滤干后置超净工作台上剥去最外面I层鳞片进行消毒处理，即先用质量分数为72%硫酸链霉素处理15min，再用质量分数为70%乙醇表面消毒25s，最后用质量分数为0.l%HgCl2溶液处理4min ；2)茎尖分化:消毒处理后的慈姑用无菌水冲洗4次，用解剖刀剥去3层鳞片，将茎尖剥离至仅剩2个叶原基，切取茎尖0.5cm接种于启动培养基上。所用启动培养基为1/2MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.7mg/L、萘乙酸(NAA) 0.3mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖，pH值为6.0，在温度为25°C，光照强度为1300 Ix下，每天光照10h，35d即可长成具有6叶的再生小植株；3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所用增殖培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 2.2 mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.1%的琼脂，pH值为6.0，在温度为25°C，光照强度为1400 Ix下，每天光照10h，40d萌发形成分株的慈姑试管苗；4)诱导试管慈姑:将慈姑试管苗转接到诱导培养基上，所用诱导培养基为MS培养基、添加萘乙酸(NAA) 0.3mg/L、活性炭(AC) 0.8g/L、质量分数为5.0%的蔗糖，pH值为6.0，在温度14°C，每天光照时间12h的条件下，60d以后诱导形成试管慈姑。
权利要求
1.一种试管慈姑组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)外植体的消毒处理:选取无病虫危害的慈姑球茎，清洗干净后，切取球茎顶芽为外植体，流水冲洗20 35min，滤干后剥去最外面I 2层鳞片进行消毒处理，先用质量分数为72%硫酸链霉素处理10 30min，再用质量分数为70%乙醇表面消毒20 40s，最后用质量分数为0.l%HgCl2溶液处理2 5min ； 2)茎尖分化:消毒处理后的慈姑用无菌水冲洗4 5次，剥去2 3层鳞片，切取茎尖接种于启动培养基上，所述启动培养基为1/2MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤1.0 2.0mg/L、萘乙酸0.1 0.5mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为O 0.5%的琼脂，pH值为.5.8 6.0，培养温度25°C 28°C，光照强度1000 1500 lx，每天光照时间10h，直至长成再生小植株； 3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所述增殖培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤1.0 3.0 mg/L、萘乙酸0.1 0.3mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为O 0.5%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度25°C 28°C，光照强度1000 1500 lx，每天光照时间10h，直至萌发形成分株的慈姑试管苗； 4)诱导试管慈姑:将慈姑试管苗转接到诱导培养基上，所述诱导培养基为MS培养基、添加6-苄氨基嘌呤O 3.0mg/L、萘乙酸O 0.3mg/L、活性炭0.5 1.0g/L、质量分数为.3.0% 8.0%的蔗糖和质量分数为O 0.5%的琼脂，pH值为5.8 6.0，在培养温度14°C 22°C，每天光照时 间 O 12h的条件下诱导形成试管慈姑。
全文摘要
本发明公开了一种试管慈姑组织培养快速繁殖的方法，经过外植体的消毒处理、茎尖分化、继代增殖、诱导形成试管慈姑。本发明通过组织培养进行试管慈姑的繁殖，繁殖系数高，繁殖周期短，且整个繁殖过程均在人工控制的条件下进行，不受外界环境影响，可以进行周年生产；试管慈姑因其体积小、重量轻、可以解决慈姑试管苗远程运输和贮存过程中的问题；试管慈姑不带病，解决了慈姑常规用种易带病的问题；试管慈姑的诱导将为球茎膨大机理的研究工作提供一个可操作的简单系统；作为离体休眠器官，还可以进行慈姑种质资源离体室内保存研究，且有利于国际间种质资源的活体交换。本发明为慈姑产业的发展提供了一种快速、方便、有效的繁殖方法。
文档编号A01H4/00GK103070073SQ20131002427
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者朱红莲, 柯卫东, 刘玉平, 彭静, 黄新芳, 刘义满, 李峰, 李双梅, 黄来春, 叶元英 申请人:武汉市蔬菜科学研究所