专利名称：肿瘤消解病毒疗法的制作方法
背景技术：
“用病毒治疗肿瘤”(WO 00/62735)涉及一种将能够复制和杀死具有IFN介导的抗病毒反应缺陷的肿瘤细胞的病毒作为药物使用的方法，该专利的一个特定的方面包括“全身性”使用这种病毒。
已知副粘病毒与红细胞反应并使其凝集，Howe，C.和Lee，L.T.报道说从红细胞提取了比流感病毒的效率具有更低的副粘病毒(Adv.VirusRes.171-50，1972)。此外，通过病毒外壳蛋白的特异性抗体的中和而特异性地抑制由副粘病毒引起的红细胞凝集是一个已了解得很清楚的现象。
Schirrmacher等人(Int.J of Oncology，16363-373，2000)已经证明，NDV会激活小鼠巨噬细胞的抗肿瘤活性，下面的试验结果表明NDV被加到小鼠全血中时并不优先与小鼠白细胞组合。
Bonina等人(Giorn.Batt.Virol.Immun.，LXXVIII，254-261，1985)证明，人的巨噬细胞能支持NDV的生长。
Woodruff等人(Cellular Immunology 5296-306，1972)及Woodruff和Woodruff(J of Immunology，116(6)2176-2183，1974)发现，NDV在体外凝集大鼠、小鼠和人的淋巴细胞。
Faden等人(Blood，58221-7，1981)证明，NDV在体外会与人的嗜中性粒细胞结合。
上述资料并没有显示任何NDV优先于红细胞而与白细胞结合的倾向性。
文献描述了NDV与红血细胞(通常为鸡)的结合，由于NDV并不是人的病原体，发现NDV优先与人血液中的白细胞成分结合的结果是很让人惊异的。
文献表明，NDV与细胞的结合是通过病毒HN蛋白的神经氨酸苷酶与连接到细胞表面蛋白上的唾液酸残基的相互反应产生的。人红细胞具有非常高浓度的与细胞表面蛋白连接的唾液酸残基，在人血液中红细胞和白细胞的比例大约为1000∶1，因此，特别使人惊奇的是NDV与占小部分的白细胞结合而不是与数量上多得多的红细胞结合。
发明内容
本发明提供了一种治疗肿瘤患者的方法，包括给患者注射适量的可有效地对患者进行治疗的药物组合物，该药物组合物包含悬浮在生理溶液中的人白细胞和具有复制能力的肿瘤消解病毒(oncolytic virus)，其中该病毒与白细胞特异性地结合，及组合物中病毒的空斑形成单位(plaque forming units)与白细胞数的比例至少为1∶100，从而对患者进行治疗。
本发明提供了一种治疗肿瘤患者的方法，包括给患者注射适量的可有效地对患者进行治疗的药物组合物，该药物组合物包含悬浮在生理溶液中的以肿瘤消解病毒感染的人体细胞，其中该细胞是白细胞或血小板，从而对患者进行治疗。
本发明提供药物组合物用于治疗肿瘤患者或在肿瘤治疗药物的制造中的应用，该药物组合物包含(a)悬浮在生理溶液中的人体白细胞和具有复制能力的肿瘤消解病毒，其中该病毒与白细胞特异性地结合且组合物中病毒的空斑形成单位与白细胞数的比例至少为1∶100；或(b)悬浮在生理溶液中的以肿瘤消解病毒感染的人体细胞，其中该细胞是白细胞或血小板。应用(a)和应用(b)是有关联的，即实施应用(a)通常包含实施应用(b)，因为具有复制能力的肿瘤消解病毒通常会感染白细胞。
本发明部分地是基于肿瘤消解病毒如NDV与白细胞和血小板结合的发现，与红细胞相比，NDV优先与白细胞结合。肿瘤涉及到炎性过程，因此与肿瘤消解病毒结合的白细胞或以肿瘤消解病毒感染的白细胞是投送肿瘤消解病毒的特别有效的手段。
具体实施例方式
在这里使用的术语“人体细胞”意指从人体分离得到的细胞，或从人体分离得到的细胞衍生的和/或其核酸成分通过如永生化、照射或重组的方法改变了的培养细胞。“人体白细胞”和“人体血小板”是本身分别为白细胞和血小板的人体细胞。除另外特别说明或由上下文所要求的外，术语“细胞”或“人体细胞”指的是白细胞和/或血小板。
在这里使用的术语“空斑形成单位”(pfu)意指一个传染性病毒颗粒。
在这里使用的术语“感染多重度”(MOI)意指每个细胞添加的感染性病毒颗粒的数目。
在这里使用的术语“克隆病毒”意指源自单个感染性病毒颗粒的病毒，且其分子克隆个体具有显著的核酸序列同源性，例如，序列同源性达到至少八个来自该病毒群体的分子克隆个体在超过300个相邻核苷酸的序列上具有大于95％的序列同源性。
在这里使用的术语“白细胞病毒复合体”(LVC)意指肿瘤消解病毒与白细胞群体混合且该病毒已与细胞结合形成的复合体，该术语既包括病毒结合在细胞外面的细胞，也包括被病毒感染的细胞。
在这里如果病毒与特定的细胞结合的特异性高于这种病毒与红细胞结合的特异性，我们就说该病毒与该细胞“特异性地结合”。“特异性地结合”或“特异性结合”的英文术语“bind(s)specifically”和“specifically bind(s)”可互换使用。
在这里“NDV”是新城鸡瘟病毒(Newcastle Disease Virus)的缩写。
在这里使用的术语“具有复制能力的”病毒指的是在肿瘤细胞中产生传染性子代的病毒。
在这里使用的过渡性词“包括”是开放的，使用该词语的权利要求可包含除在该权利要求中引用的元素外的额外的元素。
按照本发明，人体细胞可由任何来源获得。它们可由患者以外的人提供，但从安全方面考虑，如果可能一般优选患者提供的细胞。任选的从供体分离得到的细胞首先可在培养物中生长，而该培养的细胞也被认为是细胞所取自的供体的细胞。按照本发明可使用的培养细胞的例子包括永生化的人体白细胞系，如美国菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)等来源可公开提供适宜的细胞系，如U-937(ATCC号CRL-1593.2)和KG-1(ATCC号CCL-246)。
按照本发明，所使用的白细胞(例如单核细胞、嗜中性粒细胞和包括肿瘤渗透性淋巴细胞在内的淋巴细胞)可以是具有活性的或非活性的。灭活白细胞的技术包括照射。
按照本发明，所使用的细胞可被分离(例如在白细胞的情况下通过白细胞去除进行分离)，但细胞分离不是必需的，也可以改用全血，在这种情况下药物组合物包含悬浮在全血中的肿瘤消解病毒或含有病毒感染的白细胞和/或血小板的全血。任选的白细胞或血小板首先从全血中被分离出来，与病毒混合或以病毒感染，然后再加回到其它的血液成分中。
在本发明的不同实施例中，白细胞选自单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞。在本发明的一个更特殊的实施例中，白细胞是肿瘤渗透性淋巴细胞(TILs)，TILs可通过例如Rabinowich，H.等人(Cancer Res.，47173-7，1987)描述的方法进行制备。
按照本发明，所使用的肿瘤消解病毒可具有低(弱毒)、中等(中毒)或高(强毒)毒性，毒性水平是根据鸡胚平均死亡时间(MDT)试验(Alexander，“Chapter 27Newcastle Disease”in Laboratory Manual for theIsolation and Identification of Avian Pathogens，3rded.，Purchase，et al.eds.(Kendall/Hunt，Iowa)，page 117.)确定的，通过MDT试验将病毒划分为弱毒(MDT＞90小时)、中毒(MDT从60小时到90小时)和强毒(MDT＜60小时)。
在本发明的一实施例中，病毒是克隆病毒。
参照使用的药物组合物包含悬浮的白细胞和肿瘤消解病毒的方法或应用，在该方法的一实施例中病毒的空斑形成单位与组合物中的白细胞数的比例至少为1∶1，一般优选白细胞被活性病毒颗粒饱和。在NDV的情况下病毒的空斑形成单位与白细胞数的比例为200∶1时达到饱和，因此在本发明的实施例中，病毒是NDV且组合物中病毒的空斑形成单位与白细胞数的比例从约1∶1到约200∶1，优选为约200∶1。
在上述的使用的药物组合物包含以肿瘤消解病毒感染的细胞的方法或应用中，该方法的一实施例中被感染的细胞至少是组合物中白细胞和血小板总数的千分之一(0.1％)，更优选为至少30％及最优选为约百分之百。所使用的病毒可以是无复制能力的，虽然优选为病毒是具有复制能力的。
在本发明的实施例中，肿瘤消解病毒是选自由新城鸡瘟病毒(NDV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、水泡性口膜炎病毒、副流感病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹I型病毒、牛痘病毒和呼肠孤病毒组成的组。在一更特别的实施例可使用中等毒性的新城鸡瘟病毒株。
有经验的医师能够确定在各病例中的注射的组合物的最适量。典型情况当细胞是白细胞时，有效量是组合物注射日剂量包含6×106-6×1010白细胞/平方米体表面积，例如约6×107白细胞/平方米体表面积。当细胞是血小板时，有效量一般是组合物的日剂量包含109-1011血小板/平方米体表面积，例如约1011血小板/平方米体表面积。
组合物的日剂量可在单个的24小时的时间段的疗程中分多次给患者注射，其中一次注射日剂量的一部分。更优选日剂量进行单次注射给药。在本发明的一实施例中，在一周的时间内组合物的日剂量按1到7次的频率(即在1到7天的各天中)给患者注射。
按照本发明，任何常规的注射方式都适用于该药物组合物的注射，例如该组合物可进行静脉注射、肿瘤内注射、腹膜内注射或膀胱内注射(肾)。在静脉注射的情况下，适宜的组合物注射量从25毫升到1升，在肿瘤内注射的情况下，适宜的组合物注射量从100微升到10毫升/肿瘤块，在腹膜内注射的情况下，适宜的组合物注射量可达到2升，在膀胱内注射的情况下，适宜的组合物注射量可达到75毫升，优选为50-60毫升。根据病毒的pfus和注射的细胞的量的不同，可对组合物的浓度进行改变以获得适宜的体积。当肿瘤是实体瘤时，可采用上述给出的给药方式中的任一种进行组合物的注射，例如静脉注射或肿瘤内注射，而当肿瘤是非实体瘤(如白血病)时，不能采用肿瘤内注射，而可通过上述给出的其它的给药方式进行组合物的注射，例如静脉注射。
参照下面的实施例可更好地理解本发明，这些实施例只是阐述而不是限制在这里所描述的本发明。在下面的实施例中，所使用的NDV是三次空斑纯化的(triple-plaque purified)新城鸡瘟病毒MK107株的减毒变体，在2000年10月26日出版的国际专利公开文件WO 00/62735(Pro-Virus公司)中对其有更全面的描述。
实施例实施例1NDV与人体血细胞的结合目的研究NDV与人体血细胞的结合以确定与病毒结合的细胞类型。
材料索引号RL-004的NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗体(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的叠氮钠的、编目号554656、批号M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)缓冲液，编目号710-1832、批号7367的藻红蛋白偶联-Rockland羊抗鼠多克隆抗体，编目号349202、批号82026的Becton Dickinson免疫细胞计数仪10X FACS溶血素溶液。
方法人全血被收集在柠檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickinson#366415)中，从两管中各取出约4ml全血经冷却并保持在室温下直至使用。用台盼蓝排除法和血细胞计数器进行细胞计数，批号RL-004的NDV(1.3E+10PFU/ml)按MOIs(感染多重度，表示为PFU/细胞)为0.2、0.05和0.02(还有不添加病毒的阴性对照)感染细胞。在添加病毒后，样品管在37℃孵育30分钟，在孵育期间轻轻搅拌三次以使细胞保持在悬浮状态。
样品清洗两次，清洗步骤如下加入2ml的冷PSB，在4℃的温度下2000rpm离心5分钟并吸除溶液留下细胞团。各次PSB是通过抽吸去除的。通过加入冷PSB将各样品的体积调整到1ml，通过加入20μl的含9.1μg抗体的溶液向各样品添加Mab2F12单克隆抗体。样品在冰上孵育30分钟并按前述步骤再清洗两次，羊抗鼠PE指示抗体通过加入1ml的含12μg/ml该抗体的溶液被加入各样品中，样品再在冰上孵育30分钟并按上述方法清洗。为分析白细胞部分，100μl的各样品与3ml的1X FACS溶血素溶液在室温下孵育6分钟，再如前进行离心和抽吸，细胞团重悬在0.5ml的PSB中。为进行红细胞分析，1.5μl的各样品被加入到2.0ml的PSB中。用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行样品分析，前向和侧向散射参数采用线性设置，而藻红蛋白的FL2检测采用对数设置。
结果在表1中显示的试验结果表明NDV优先与人全血中的白细胞部分结合。在MOI为0.05(对于全血)的情况下，46％的白细胞为NDV阳性，而红细胞的NDV阳性率为0％；在MOI为0.2的情况下，NDV在89％的白细胞中出现，而只与15％的白细胞结合。请注意如果扣除红细胞不算，则MOI为0.05和0.2对于白细胞来说约为5和200。在较高的MOI时少量的与红细胞结合的NDV可能反映了与存在于细胞表面上的唾液酸残基结合的低亲和力。
表1NDV结合阳性细胞百分率(％)
一般认为，副粘病毒与红细胞相互反应并产生红细胞的凝集反应(参见How，C.and Lee，L.T.，“Virus-Erythrocyte Interactions”)。因此，人们普遍相信，涉及到与这些病毒结合的主要的细胞类型，包括NDV，是红细胞。NDV与细胞的结合被认为是通过病毒HN蛋白的神经氨酸酶与连接到细胞表面蛋白上的唾液酸残基的相互反应产生的。在血液中，为达到将细胞保持在溶液中的目的，人红细胞具有非常高浓度的与表面蛋白连接的唾液酸残基。因为在人血液中红细胞和白细胞的比例大约为1000∶1，因此特别让人惊奇的是NDV与占小部分的白细胞结合而不是与数量更为巨大的红细胞结合。
实施例2在NDV中和抗体存在的情况下NDV与白细胞结合介绍/背景本试验的目的是检测NDV在有或无NDV中和抗体存在的情况下与白细胞结合能力。在抽取本试验的全血样本之前，521号临床患者接受了大约27个疗程的NDV治疗，通过空斑中和(plaqueneutralization)和微中和(micro-neutralization)分析显示521号患者具有显著水平的NDV中和抗体。
方法从正常供体和521号患者获得的人全血样本被收集在柠檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickenson#366415)中，各供体的采样管保持在室温下。将全血样本按测试用量均分并掺入NDV(批号RL-005)。NDV是按MOIs(感染多重度，表示为PFU/细胞)为0.2、0.02和0.002(同时还有不加病毒的阴性对照)掺入。在病毒被加入后，采样管在室温下孵育30分钟，通过使用polymorphprep(Nycomed，Inc.)分离液的梯度离心从添加了病毒的样本中分离血浆和白细胞。从梯度层的顶部小心地去除血浆，收集两个白细胞带(多形核白细胞带和单核细胞带)并将其置于0.5X DMEM，使细胞成团并重悬在全浓度DMEM中。细胞清洗几次以除去分离介质，使用库耳特颗粒计数器对各测试量中的白细胞进行计数。已知数目的白细胞或已知用量的血浆被共培养或接种在25cm2组织培养瓶(Corning)中的单层HT1080人纤维肉瘤细胞(ATCC，CCL-121)上。HT1080细胞对NDV的细胞溶解作用是高度敏感的，在数天内对细胞单层进行定性观察以确定CPE(细胞病变效应)的出现。出现CPE的培养瓶被认为是阳性的。
结果如表2中所示，在每瓶300000白细胞的情况下，对于所有三种MOI的掺入，正常供体和521号患者的两个被检测的培养瓶都为NDV感染的阳性；对于正常供体，在3000细胞的水平所有的培养瓶都为阳性，而在30细胞的水平除最低的MOI掺入外所有的培养瓶也为阳性；对于521号患者，在3000细胞水平，MOI为0.02时2个培养瓶中只有1个为阳性，MOI为0.002时2个培养瓶中没有1个为阳性，在30细胞水平，MOI为0.2时2个培养瓶中只有1个为阳性，其它所有在这一细胞水平的培养瓶都为阴性。
血浆数据表明，在正常供体，病毒可在所有的MOIs测试中从血浆中恢复(参见表3)，但是，没有感染性病毒从含中和抗体的521号患者的血浆中恢复。
讨论结果表明，与正常供体相比，521号患者与感染性病毒结合的白细胞的数目减少了，但是，病毒仍然能够在中和抗体存在的情况下与白细胞结合，即使在与患者剂量相似的低MOI(0.002)时也出现了这种结合。
NDV引起导致中和抗体产生的人体免疫反应，病毒与白细胞的结合可以使该病毒免于中和抗体的攻击，这是其优于游离病毒的地方，游离病毒暴露于中和抗体并导致非感染性。
从这些数据可以得出结论，使用白细胞作为向肿瘤投送病毒的载体优于游离的传播病毒，在已产生反射反应的患者(如已接受多剂量NDV的患者)体内的中和抗体会导致游离病毒丧失感染性。
表2感染性NDV与白细胞结合的检测正常供体
521号患者
*每2个测试培养瓶中阳性培养瓶的数目。
表3感染性NDV的血浆检测
N＝1培养瓶由于NDV不是人体的病原体，发现NDV优先与人血液中的白血细胞成分结合是一个让人惊异的结果。
实施例3人白细胞/NDV复合体的制备通过白细胞去除或采用POLYMORPHPREP(Nycomed公司)按照生产商的说明进行的梯度离心制备人白细胞(5×10+8细胞)，在室温下用消毒1XPBS清洗细胞两次并用同样的缓冲液将容积调整到10ml，细胞与1×10+10pfu的NDV(无菌条件下添加)混合并使其静置30分钟(在10和20分钟进行短暂的混合)，在1500rpm对细胞离心5分钟并去除PBS，用20ml的1XPBS清洗细胞并再次离心，细胞团被稀释到10ml以用于注射。
实施例4用人白细胞/NDV复合体治疗无胸腺小鼠中的人肿瘤异种移植(＜10mm及＞5mm)无胸腺小鼠用1千万人肿瘤细胞进行皮内注射，在肿瘤大小达到5-10mm之间的范围后，给予8×10+6细胞的如实施例3中所描述的白细胞/NDV复合体的单次注射，按完全退化和部分退化观察LVC对肿瘤生长的作用。
实施例5用人白细胞/NDV复合体对患者进行全身性的肿瘤治疗通过白细胞去除从患者获得人白细胞，按实施例3中所述制备白细胞/NDV复合体(LVC)，该复合体(5×10+8细胞)通过静脉注射返回到患者体内。LVC的注射隔三天一次，持续21天。
实施例6用人供体的白细胞/NDV复合体对患者进行全身性的肿瘤治疗通过白细胞去除从正常供体获得人白细胞，按实施例3中所述制备白细胞/NDV复合体(LVC)，该复合体(5×10+8细胞)通过静脉注射返回到患者体内。LVC的注射隔三天一次，持续21天。
实施例7NDV与小鼠血细胞的结合目的研究NDV与小鼠血细胞的结合以确定与病毒结合的细胞类型。
材料参考批号RL-004NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗体(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的叠氮钠的、编目号554656、批号M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)缓冲液，编目号710-1832、批号7367的藻红蛋白偶联-Rockland羊抗鼠多克隆抗体，编目号349202、批号82026的Becton Dickinson免疫细胞计数仪10X FACS溶血素溶液。
方法小鼠全血被收集在柠檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickinson#366415)中，用台盼蓝排除法和血细胞计数器进行细胞计数，批号RL-005的NDV(4.2E+10PFU/ml)按MOIs(感染多重度，表示为PFU/细胞)为0.2、1和3(还有不添加病毒的阴性对照)感染细胞。在添加病毒后，样品管在37℃孵育30分钟，在孵育期间轻轻搅拌三次以使细胞保持在悬浮状态。
样品清洗两次，清洗步骤如下加入2ml的冷PSB，在4℃的温度下2000rpm离心5分钟并吸除溶液留下细胞团。每次PSB是通过抽吸去除的。通过加入冷PSB将各样品的体积调整到1ml，通过加入20μl的含9.1μg抗体的溶液向各样品添加Mab2F12单克隆抗体。样品在冰上孵育30分钟并按前述步骤再清洗两次，羊抗鼠-PE指示抗体通过加入1ml的含12μg/ml该抗体的溶液被加入各样品中，样品再在冰上孵育30分钟并按上述方法清洗。为分析白细胞部分，100μl的各样品与3ml的1X FACS溶血素溶液在室温下孵育6分钟，再如前进行离心，细胞团重悬在0.5ml的PSB中。为进行红细胞分析，1.5μl的各样品被加入到2.0ml的PSB中。用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行样品分析，前向和侧向散射参数采用线性设置，而藻红蛋白的FL2检测采用对数设置。
结果在表4中显示的试验结果表明，与NDV与人血液细胞结合时病毒优先与人全血中的白细胞部分结合(实施例1)的情况不同，NDV优先与小鼠全血的红细胞部分结合而不与白细胞结合。
表4NDV结合阳性细胞百分率(％)
在人白细胞大部分为NDV结合阳性的MOI为0.2的情况下，小鼠白细胞为阴性。
实施例8NDV与大鼠血细胞的结合目的研究NDV与大鼠血细胞的结合以确定与病毒结合的细胞类型。
材料参考批号RL-004 NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗体(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的叠氮钠的、编目号554656、批号M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)缓冲液，编目号710-1832、批号7367的藻红蛋白偶联-Rockland羊抗鼠多克隆抗体，编目号349202、批号82026的Becton Dickinson免疫细胞计数仪10X FACS溶血素溶液。
方法从Sprague Dawley大鼠获得的全血(1.8ml)被收集在柠檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickinson#366415)中并保持在室温下直至使用，用台盼蓝排除法和血细胞计数器进行细胞计数，批号RL-005的NDV(4.2E+10PFU/ml)按MOIs(感染多重度，表示为PFU/细胞)为0.05、0.2、0.5、1和3(还有不添加病毒的阴性对照)感染细胞。在添加病毒后，样品管在37℃孵育30分钟，在孵育期间轻轻搅拌三次以使细胞保持在悬浮状态。
样品清洗两次，清洗步骤如下加入2ml的冷PSB，在4℃的温度下2000rpm离心5分钟并吸除溶液留下细胞团。每次PSB是通过抽吸去除的。通过加入冷PSB将各样品的体积调整到1ml，通过加入20μl的含9.1μg抗体的溶液向各样品添加Mab2F12单克隆抗体。样品在冰上孵育30分钟并按前述步骤再清洗两次，羊抗鼠-PE指示抗体通过加入1ml的含12μg/ml该抗体的溶液被加入各样品中，样品再在冰上孵育30分钟并按上述方法清洗。为分析白细胞部分，100μl的各样品与3ml的1X FACS溶血素溶液在室温下孵育6分钟，再如前进行离心，细胞团重悬在0.5ml的PSB中。为进行红细胞分析，1.5μl的各样品被加入到2.0ml的PSB中。用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行样品分析，前向和侧向散射参数采用线性设置，而藻红蛋白的FL2检测采用对数设置。
结果在表5中显示的试验结果表明，在低MOI(0.02和0.05)的情况下NDV与大鼠白细胞结合，而在这些MOI’s的情况下NDV与红细胞的结合并不好。这一形式介于病毒与人白细胞优先结合和与小鼠白细胞不结合之间。
表5NDV结合阳性细胞百分率(％)
实施例9NDV与人血小板的结合目的研究NDV与人血小板的结合。
材料参考批号RL-004 NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗体(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的叠氮钠的、编目号554656、批号M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)缓冲液，编目号710-1832、批号7367的藻红蛋白偶联-Rockland羊抗鼠多克隆抗体，编目号349202、批号82026的Becton Dickinson免疫细胞计数仪10X FACS溶血素溶液。
方法血小板的分离人全血被收集在柠檬酸管(3.2％，0.105M柠檬酸盐，BectonDickinson#366415)中，将7ml的全血放入15ml的聚丙烯离心管中，该管在室温下按800g离心5分钟，从离心管的顶部收集大约1.5ml的富血小板血浆(PRP)。根据公布的产率，确定样品中含有8.0E+8细胞/ml。100μl的PRP在室温下用NDV(RL-005)按MOIs为0.1、10和100感染30分钟。
样品清洗两次，清洗步骤如下加入2ml的冷PSB，在4℃的温度下2000rpm离心5分钟并吸除溶液留下细胞团。每次PSB是通过抽吸去除的。通过加入冷PSB将各样品的体积调整到1ml，通过加入20μl的含9.1μg抗体的溶液向各样品添加Mab2F12单克隆抗体。样品在冰上孵育30分钟并按前述步骤再清洗两次，羊抗鼠-PE指示抗体通过加入0.1ml的含12μg/ml该抗体的溶液被加入各样品中，样品再在冰上孵育30分钟并按上述方法清洗。用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行样品分析，前向和侧向散射参数采用线性设置，而藻红蛋白的FL2检测采用对数设置。
结果在表6中显示的试验结果表明，NDV与人血小板结合。在MOI的测试范围内NDV结合阳性的血小板的数目没有很大的增加，尽管平均荧光值的显著增长，这表明随着MOI的增大，有更多的NDV结合到血小板的阳性部分。
表6NDV与人血小板的结合
实施例10NDV与人白细胞结合的等级材料参考批号RL-004NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗体(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的叠氮钠的、编目号554656、批号M059394的BD PharMingenTMStain Buffer(PSB)缓冲液，编目号7100-1832、批号7367的藻红蛋白偶联-Rockland羊抗鼠多克隆抗体，编目号349202、批号82026的Becton Dickinson免疫细胞计数仪10X FACS溶血素溶液。
方法人全血被收集在柠檬酸管(3.2％，0.105M，Becton DickinsonTM#366415)中，从两管中各取出约4ml全血经冷却并保持在室温下直至使用。用台盼蓝排除法和血细胞计数器进行细胞计数，批号RL-004的NDV(1.3E+10PFU/ml)按相对于全血的MOIs(感染多重度，表示为PFU/细胞)为0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1和0.2感染100μl的样品。在添加病毒后，样品在37℃孵育30分钟。
样品清洗两次，清洗步骤如下加入2ml的冷PSB，在4℃的温度下2000rpm离心5分钟并吸除溶液留下细胞团。用PSB将各样品的体积调整到100μl，通过加入2μl在PSB中制备的含1μg抗体的溶液向各样品添加Mab2F12单克隆抗体。样品在冰上孵育30分钟并按前述步骤再清洗两次，向各样品中加入100μl的由含12μg/ml该抗体的溶液按2.4∶1的比率在PSB中稀释的溶液以添加羊抗鼠-PE指示抗体，样品再在冰上孵育30分钟并按上述方法清洗。为制备用于白细胞分析的样品，各样品与3ml的1X FACS溶血素溶液在室温下孵育6分钟，再如前进行离心和抽吸，细胞团重悬在0.5ml的PSB中。用Becton DickinsonFACSCaliburTM流式细胞仪进行样品分析，通过比较各样品的前向散射和侧向散射参数选择性通过粒细胞、淋巴细胞和单核细胞群体，这被用于确定各样品中各细胞群体的病毒结合阳性细胞数和平均荧光值。
结果(表7)表明，NDV优先与三个细胞群体结合，优先顺序为单核细胞＞粒细胞＞＞淋巴细胞。而且，如平均荧光值数据所显示的，单核细胞群体与NDV的结合比粒细胞群体显著要多，比淋巴细胞群体更多得多。
表7
权利要求
1.一种药物组合物在肿瘤患者治疗中的应用，该药物组合物包含(a)悬浮在生理溶液中的人体细胞和具有复制能力的肿瘤消解病毒(oncolytic virus)，其中所说的细胞为白细胞，所说的病毒与白细胞特异性地结合，且在该组合物中病毒的空斑形成单位(plaque forming units)与白细胞数的比例至少是1∶100；或者(b)悬浮在生理溶液中的以肿瘤消解病毒感染的人体细胞，其中所说的细胞为白细胞或血小板。
2.一种肿瘤患者的治疗方法，包括给患者注射适量的可有效地对患者进行治疗的药物组合物，该药物组合物包含悬浮在生理溶液中的人体细胞和具有复制能力的肿瘤消解病毒(oncolytic virus)，其中所说的细胞为白细胞；所说的病毒与白细胞特异性地结合；及组合物中病毒的空斑形成单位(plaque forming units)与白细胞数的比例至少为1∶100，从而对患者进行治疗。
3.如权利要求1-2中任一项所述的应用或方法，其中所说的药物组合物包含悬浮在全血中的肿瘤消解病毒。
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用或方法，其中组合物中病毒的空斑形成单位与白细胞数的比例至少为1∶1。
5.如权利要求4所述的应用或方法，其中组合物中病毒的空斑形成单位与白细胞数的比例范围从约1∶1到约200∶1。
6.如权利要求5所述的应用或方法，其中所说的比例为约200∶1。
7.一种肿瘤患者的治疗方法，包括给患者注射适量的可有效地对患者进行治疗的药物组合物，该药物组合物包含悬浮在生理溶液中的以肿瘤消解病毒感染的人体细胞，其中所说的细胞为白细胞或血小板，从而对患者进行治疗。
8.如权利要求1-7中任一项所述的应用或方法，其中所说的细胞是患者的细胞。
9.如权利要求1-7中任一项所述的应用或方法，其中所说的细胞是除患者外的供体的细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的应用或方法，其中所说的细胞是培养细胞。
11.如权利要求10所述的应用或方法，其中所说的培养细胞包括永生细胞系。
12.如权利要求11所述的应用或方法，其中所说的永生细胞系为U-937或KG-1。
13.如权利要求1-12中任一项所述的应用或方法，其中所说的细胞为白细胞。
14.如权利要求13所述的应用或方法，其中所说的白细胞是通过白细胞去除(leukopheresis)分离的白细胞。
15.如权利要求13-14中任一项所述的应用或方法，其中所说的白细胞是具有活性的。
16.如权利要求13-14中任一项所述的应用或方法，其中所说的白细胞是非活性的。
17.如权利要求13-16中任一项所述的应用或方法，其中所说的白细胞是单核细胞、嗜中性粒细胞或淋巴细胞。
18.如权利要求17所述的应用或方法，其中所说的白细胞是肿瘤渗透性淋巴细胞。
19.如权利要求1-3和权利要求7-11中任一项所述的应用或方法，其中所说的细胞是血小板。
20.如权利要求1和7-19中任一项所述的应用或方法，其中所说的药物组合物包含全血，在全血中含有以病毒感染的白细胞或血小板。
21.如权利要求1-20中任一项所述的应用或方法，其中所说的病毒具有低到中等的毒性。
22.如权利要求1-21中任一项所述的应用或方法，其中所说的病毒是克隆病毒。
23.如权利要求1-22中任一项所述的应用或方法，其中所说的被感染细胞至少是组合物中白细胞和血小板总数的千分之一。
24.如权利要求23所述的应用或方法，其中所说的被感染细胞至少是组合物中白细胞和血小板总数的百分之三十。
25.如权利要求1-24中任一项所述的应用或方法，其中所说的病毒选自由新城鸡瘟病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、水泡性口膜炎病毒、副流感病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹I型病毒、牛痘病毒和呼肠孤病毒组成的组。
26.如权利要求25所述的应用或方法，其中所说的病毒是具有中等毒性的新城鸡瘟病毒。
27.如权利要求1-18和20-26中任一项所述的应用或方法，其中所说的药物组合物的有效量是6×106至6×1010白细胞/平方米体表面积的日注射剂量。
28.如权利要求27所述的应用或方法，其中所说的日剂量为约6×107白细胞/平方米体表面积。
29.如权利要求1、7-11和19-26中任一项所述的应用或方法，其中所说的有效量是109-1011血小板/平方米体表面积的日剂量。
30.如权利要求29所述的应用或方法，其中所说的日剂量为约1011血小板/平方米体表面积。
31.如权利要求27-30中任一项所述的应用或方法，其中所说的日剂量是单次给药的。
32.如权利要求27-31中任一项所述的应用或方法，其中在一周的时间内，所说的日剂量按一到七次的频率给药。
33.如权利要求1-32中任一项所述的应用或方法，其中所说的组合物是通过静脉给药。
34.如权利要求33所述的应用或方法，其中所说的组合物的给药量从25毫升到1升。
35.如权利要求1-32中任一项所述的应用或方法，其中所说的组合物是肿瘤内注射给药的。
36.如权利要求35所述的应用或方法，其中所说的组合物的给药量是每个肿瘤块100微升到10毫升。
37.如权利要求1-36中任一项所述的应用或方法，其中所说的肿瘤是实体瘤，且所说的组合物是静脉注射或肿瘤内注射给药。
38.如权利要求1-36中任一项所述的应用或方法，其中所说的肿瘤是非实体瘤，且所说的组合物是静脉注射给药。
39.如权利要求38所述的应用或方法，其中所说的肿瘤是白血病。
40.如权利要求1-32中任一项所述的应用或方法，其中所说的组合物是腹膜内注射的。
41.如权利要求40所述的应用或方法，其中所说的组合物的注射量最大达到2升。
42.如权利要求1-32中任一项所述的应用或方法，其中所说的组合物是膀胱内注射的。
43.如权利要求42所述的应用或方法，其中所说的组合物的注射量最大达到75毫升。
44.如权利要求43所述的应用或方法，其中所说的组合物的注射量为50-60毫升。
45.如权利要求1、3-15和17-44中任一项所述的应用或方法，其中所说的病毒是能够复制的。
46.本发明基本上如此所述。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤患者的治疗方法。给患者注射一种药物组合物，该药物组合物包含悬浮在生理溶液中的人体白细胞和具有复制能力的肿瘤消解病毒(oncolytic virus)，或者该药物组合物包含以肿瘤消解病毒感染的人体白细胞或血小板。
文档编号C12N5/02GK1514688SQ02809700
公开日2004年7月21日 申请日期2002年5月9日 优先权日2001年5月11日
发明者威廉S·格洛依那, 威廉S 格洛依那, A 米勒, 杰弗里A·米勒, N 缪勒, 斯蒂芬N·缪勒 申请人:沃尔斯泰特生物制剂公司