专利名称：酶电极的制备方法
技术领域：
本发明涉及制备酶电极的方法。本发明主要提供了通过微囊封装对硅酸盐溶胶凝胶上固定化的胆固醇氧化酶(ChOx)和介质进行包被来制备酶电极的方法。
背景技术：
胆固醇及其脂肪酸酯是对人类非常重要的化合物，因为它们不仅是神经和脑细胞的组成物质，也是其它生物物质如胆汁酸和甾类激素的前体(P.L.Yeagle，Biology of Cholesterol，CRC PressIts function andmetabolism in biology and medicinePlenumNew York，1972)。因为过量摄取导致的血液中胆固醇及其脂肪酸酯的累积足以致命，因此血液中胆固醇的测定对心脏病的临床诊断十分重要(D.Noble，Anal.Chem.，1993，65，1037A-41A)。血浆中总胆固醇值的正常范围是3-6mM，而在高血脂的情况下该水平可增至10mM。因此需要开发可以方便快速地测定胆固醇的技术。
为了制备酶电极，本领域曾经使用各种方法来使酶在碳糊中稳定和固定化，或使酶以共价的方式与玻璃碳电极表面连接，或者将其固定化于聚合物膜中。近年来，将酶在溶胶凝胶基质中固定化并保持其活性的方法已经成为开发新型生物传感器的潜在工具。Avnir等公开了通过用聚合前体引入有机化合物从而将该有机化合物在无机载体中固定化的方法[J.Phys.Chem.，88(1984)，5969]。溶胶凝胶处理过的物质因其在用于导电、光学、机械及光电应用的陶瓷膜开发方面的用途而广为人知[Brinker，C.J.，and Scherer，G.W.，Sol-Gel Science，Academic Press，New York，(1989)；Klein，L.C.，Annu.Rev.Mater.Sci.，23(1993)437]。Braun等报道称碱性磷酸酶固定化于溶胶凝胶基质中时仍保持其活性[Mater.Lett.，10(1990)1]。本领域已经公开了将包括葡糖氧化酶在内的酶在溶胶凝胶基质中固定化的方法[Yamanaka et.al，Chem.Mater.4(1992)495；Shtelzer et al，Biochem.Biotechnol.，19(1994)293；Narang et al，Anal.Chem.，66(1994)3139]。
Audebert和Sanchez报道了在TMOS和各种粒度的商品硅胶基础上用两级溶胶凝胶制备方法制作二茂铁为媒介的溶胶凝胶生物传感器[Chem.Mater.5(1993)911]。根据这篇文献，超过80％的葡糖氧化酶在凝胶中保持活性，并且该电极的法拉第反应的结果与基于这一活性进行的理论计算相吻合。Lev等公开了溶胶凝胶法制得的复合硅碳电极的用途，并宣称具有硅基质多孔性和硬度以及石墨导电性的双重优点[Anal.Chem.，66(1994)1747]。在该公开内容中，先将葡糖氧化酶吸附到碳粉表面，然后用于在玻璃碳电极上制备溶胶凝胶膜。Kurokawa等报道了类似的方法，其中由诸如纤维素或丙氧化钛的各种复合纤维制得掺杂葡糖氧化酶的溶胶凝胶复合物[Biotechnol.Bioeng.，42(1993)394；Biotechnology 7(1993)5]。
例如在Analytica Chimica Acta，Vol.414 23pp，2000已经公开了胆固醇氧化酶和辣根过氧化酶在溶胶凝胶膜中的共固定化，所公开的方法包括物理吸附，物理包埋的夹心结构以及使用微囊封装技术在四正硅酸盐衍生的溶胶凝胶膜上固定化胆固醇和辣根过氧化酶的方法。胆固醇测定的响应时间超过100分钟。使用物理包埋的酶夹心结构的溶胶凝胶膜通过安培法测出的响应时间为50秒。此外，据报道该酶电极只能稳定8周的时间。
现有生物传感器在稳定性和保存期方面有诸多缺陷。已经报道了多种将生物识别元件固定化用于化学传感研究的方法[R.F.Taylor，ProteinImmobilizing Fundamentals and ApplicationsMarcel Dicker，New York(1975)Chapter 8，263-303和H.H.Weetall，Immobilized Enzyme；Antigen，Antibodies and Peptides Preparation and CharacterizationMarcel Dicker，New York(1975)Chapter 6，263-303]。文献中报道的方法通常可划归于以下类别之一(1)物理吸附，(2)共价连接或(3)包埋，其中物理吸附是最简单的固定化方式。
这些固定化方法存在一些缺点，例如与生物识别元件(例如蛋白质和酶)的大尺寸有关的问题。物理吸附造成了多种生物识别元件取向和表观结合亲和性(biding affinity)。此外物理吸附常常产生大量对目标分析物完全没有响应的生物识别元件。所固定的物质对目标分析物完全没有响应。由于没有共价键，所固定的物质经常从感应界面流失或解吸。共价法通常能得到更稳定和均匀(过渡的生物识别取向)的界面，且酶流失也达到最小。但是，共价连接会涉及到一种或多种化学变化，一般耗时长且可能成本高。
美国专利第6,342,364号提供了一种感应器，其只需给样一次即可通过电化学法测定低密度脂蛋白中的胆固醇。该感应器含有安装在绝缘基板上的至少包含工作电极和反电极的电极系统、在带有该电极系统的所述基板上形成的酶层及安置在所述酶层前的位于向所述电极系统提供样品溶液的路径上的试剂层。所述酶层至少包括氧化还原酶和电子介质。所述试剂层含有可抑制不同于含所述氧化还原酶的低密度脂蛋白的脂蛋白中的胆固醇活性的试剂，例如，可以和不同于所述低密度脂蛋白的其它脂蛋白结合生成水溶性复合物的试剂。然而，此种感应器的保存时间太短。
美国专利第6,214,612号公开了用于定量测定胆固醇的包括电极系统和反应试剂系统的胆固醇感应器。所述电极系统包括测量电极如碳电极和反电极，而所述反应试剂系统包括胆固醇脱氢酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化的电子介质。电子介质包括铁氰化物、1，2-萘醌-4-磺酸盐、2，6-二氯酚靛酚、二甲基苯醌、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸盐(1-methoxy-5-methylphenazinium sulfate)、亚甲基蓝、棓花青、劳氏紫、N-甲基吩嗪(硫酸单甲酯)盐和麦尔多拉蓝(Meldola’s blue)。也可含有心肌黄酶、胆固醇酯酶和表面活性剂。所述电极系统位于绝缘基板上，该基板上有带凹槽的覆盖部件，该凹槽为从基板末端延伸到所述电极系统的供应样品的通道。在所述基板或覆盖部件上，或同时在所述电极系统和覆盖部件上有包含干燥形式的所述反应试剂系统的反应层和亲水聚合物层，从而使其暴露于所述样品供应槽。在操作过程中，所述电子介质被还原同时样品中的胆固醇被胆固醇脱氢酶氧化，使所述电子介质发生电化学再氧化所需的电流量与样品中的胆固醇量成正比。然而，此感应器的保存时间较短，并且可能会出现所述介质和酶的流失。
美国专利第6,071,392号公开了一种胆固醇感应器，包括含有形成于绝缘基板上的测量电极和反电极的电极系统，用于覆盖该电极系统的电极涂层以及形成于该电极涂层上或其附近的反应试剂层，其中所述反应试剂层至少包含用于催化胆固醇氧化的酶，具有胆固醇酯水解活性的酶和表面活性剂，所述电极涂层包含水溶性纤维素衍生物和糖类两者中至少一种，且其浓度能给予样品溶液足够的粘度，从而当所述电极涂层溶解于提供给所述感应器的样品溶液时，能够阻止所述表面活性剂侵入所述电极系统。此专利的感应器致力于消除由电极退化造成的感应器响应减弱，其中所述电极退化是由表面活性剂侵入所述电极系统造成的。虽然据称此感应器的响应时间更短，但同样因为潜在的酶流失，其保存时间仍然不够长。
美国专利第6,117,289号公开了一种胆固醇感应器，其包括至少含有测量电极和反电极的位于电绝缘基板上的电极系统，和形成于该电极系统上或其附近的反应层。该反应层包括用于催化从胆固醇酯到胆固醇的转化的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和表面活性剂。响应时间最长为9分钟。此外，表面活性剂的存在能够导致电极的退化。
电化学聚合的导电聚合物在过去的二十年中也得到了相当多的关注。这些材料的非凡的从导电的氧化态(掺杂的)到绝缘的还原态(未掺杂的)的转换能力是许多应用的基础。例如，由于具有诸如可通过使单体电化学氧化而直接、简便地沉积于感应电极上，通过电荷沉积来控制厚度，以及用于传感器应用的聚合物的氧化还原导电性(redox conductivity)和聚合电解质特性的优点，聚共轭导电聚合物被考虑用于生物传感方面的应用。
因此，迫切需要开发可以方便、快速地测定胆固醇的生物传感器。
发明目的本发明的主要目的是提供用来评估水性媒质中的胆固醇的基于溶胶凝胶的新型酶电极。
本发明的另外一目的是提供制备新型酶电极的方法，该酶电极能准确快速地评估溶液中的胆固醇。
本发明的再一目的是提供酶稳定的成本高效的高灵敏酶电极。
本发明的再一目的是提供可以在30秒的短时间内准确测定胆固醇的酶电极。
本发明的再一目的是提供至少可以使用五次的基于溶胶凝胶的新型酶电极。
发明概述因而，本发明涉及用于评估水性媒质中的胆固醇的酶电极，该电极包括i)导电基板，ii)沉积在所述导电基板上的溶胶凝胶衍生材料，iii)步骤b)所述的溶胶凝胶衍生物为用电子介质微囊封装的胆固醇氧化酶，该酶电极具有如下性能所封装的酶和所述电子介质零流失，响应时间30秒，至少可重复使用5次，以及保存时间6个月。
在本发明的另一实施方案中，所用的导电基板选自铟锡氧化物包被的玻璃板和银包被的不导电聚合物表面。
在本发明的另一实施方案中，所用的不导电聚合物表面选自膜和片。
在本发明的另一实施方案中，所用的不导电聚合物表面选自聚丙烯酰胺，聚氯乙烯和聚乙烯。
在本发明的另一实施方案中，所用溶胶材料为硅溶胶。
在本发明的另一实施方案中，所用硅溶胶选自原硅酸四乙酯和原硅酸四甲酯。
在本发明的另一实施方案中，所用电子介质选自铁氰化钾、二茂铁和普鲁士蓝。
在本发明的另一实施方案中，所述酶电极的灵敏度为0.4伏特。
在本发明的另一实施方案中，所用胆固醇氧化酶的浓度范围是3-5IU每平方厘米表面积。
在本发明的另一实施方案中，所述酶电极的工作pH值范围为6.5-7.2。
本发明还涉及制备用于评估水性媒质中的胆固醇的酶电极的方法，包括
a.使用已知的方法制备硅酸盐溶液。
b.通过将含有3-5IU胆固醇氧化酶以及约0.01M的电子介质的0.05-0.1M磷酸盐缓冲液缓缓加入步骤a)所述的硅酸盐溶液中，将胆固醇氧化酶和电子介质固定化。
c.将得到的混合物静置直至观察到混浊现象，此时表明酶和电子介质封装完毕，d.使用常规方法将得到的混浊混合物涂布在导电的基板上。
e.将所述导电基板与涂布的混浊混合物在25-30℃的温度范围内干燥至少一天的时间，从而得到所述酶电极。
在本发明的实施方案中，所用的硅酸盐溶胶选自原硅酸四乙酯和原硅酸四甲酯。
在本发明的另一实施方案中，所用磷酸盐缓冲液的pH值范围为6.5-7.2。
在本发明的另一实施方案中，制备酶电极的方法是一步法。
附图的简要说明图l显示了所述酶电极响应对胆固醇溶液浓度的函数关系。
发明的详细描述本发明主要包括如下阶段制备溶胶，并同时向溶胶中加入位于缓冲溶液中的介质以及胆固醇氧化酶。将溶胶和固定化酶的混合物静置，直至实现酶的完全封装为止。此阶段的判断依据为观察到混合物开始变混浊。一旦混合物开始变混浊，就可以将其沉积在基体上来制备所需的电极。在25-30℃的温度范围内干燥约24小时的较长时间后，所涂布的混合物形成具有所述胆固醇感应性能的薄膜。
溶胶的制备优选采用硅酸四乙酯在纯水和HCl中进行。但硅酸四甲酯也可以使用。用于制备所述溶胶的水优选为纯水，更优选超过15Mohms的去离子水。也可采用任何本领域所属技术人员公知的常规方法制备所述溶胶。例如，通过将4.5ml的原硅酸四乙酯(TEOS)、1.4ml的H2O以及100μl 0.1M的HCl在玻璃小瓶中混合制得溶胶凝胶储备溶液。将所得混合物均匀搅拌直至得到澄清的溶液。此溶液将在整个实验中使用，需要的时候可进行稀释。通过将0.5ml的所述储备溶液和0-0.2ml的去离子水混合制得特定的铸塑溶液。
下一关键步骤包括含有固定化的胆固醇氧化酶的溶胶凝胶的制备。该步骤的特点是向溶胶中逐渐加入所述介质及所述酶的缓冲液的过程中，同时实现所述酶的封装和固定化。所使用的酶是胆固醇氧化酶，其浓度范围为3-5IU每平方厘米表面积。所使用的介质优选为铁氰化钾。为了固定化胆固醇氧化酶(ChOx)，将80μl储备溶液加入在含3U ChOx的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)中制得的20μl 0.01M的铁氰化钾溶液中，从而同时对所述酶进行封装，且铁氰化钾在不断增长的形成硅网络的水解凝胶中作为介质。将溶液放置一旁，直到所述酶及介质被完全封装于不断增长的网络中一旦制备得到包含所述固定化和微囊化的酶的溶胶凝胶，就可以很容易地在导电基板上沉积形成膜。该导电基板可以是导电膜如铟锡氧化物(ITO)包被的玻璃板，也可以是任何其他基体如聚合物膜或片。这些基体上可沉积银膜，其用做沉积所述含封装酶的溶胶凝胶膜的导电表面。在薄膜铸塑前，先用HNO3对铟锡氧化物(ITO)包被的玻璃板处理大约2小时，然后用Millipore水清洗三次。最后，在薄膜铸塑前，用正丙醇对所述玻璃板进行清洗。可采用任何本领域所属技术人员公知的常规手段制备所述膜，而且优选保持在空气中以在25-30℃的温度范围内干燥。然后采用所述水溶胶凝胶稀释方案，在所述ITO玻璃上铸塑不同厚度的掺杂ChOx的膜。将所述膜在25℃下干燥，并在4℃储存。
通过将3mg胆固醇溶解在12.8ml 2-丙醇中，并与5.85ml Triton X-100表面活性剂混合来制备标准胆固醇溶液。匀化后用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)将混合液的总体积稀释至100ml，并在35℃恒温。此标准溶液进一步用水稀释成不同的胆固醇溶液。
使用安培响应研究法(Amperometric response study)用上面制备的标准胆固醇溶液对所述酶包被的基体的性质进行检测。安培法是本领域所属技术人员公知的方法。在该方法中，基本上使用三电极电池体系。所用电极为工作电极，即本发明的酶电极。通常所述酶电极是在ITO包被的玻璃上制成的。第二个电极是Ag/AgCl参比电极。在实际测量中，使用在pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液中浓度在0.5-10mM之间变化的胆固醇溶液及上述的两个电极。每100秒检测由于酶作用生成H2O2而产生的电流。通常，对浓度检测响应时间(秒)。
反应使电流上升是基于以下过程实验的结果如
图1所示。为了检查胆固醇中是否存在对所述酶电极的响应有任何不利影响的干扰试剂如葡萄糖或抗坏血酸，用混有所述干扰试剂的胆固醇溶液进行重复实验。结果发现这些干扰试剂对所述酶电极的响应没有任何影响。
在改进现有技术公开的胆固醇测量方法的缺陷的尝试中，生物分子在溶胶凝胶法中被固定化，且保存时间相对变长。这是因为以下事实(i)多种酶被封装在溶胶凝胶基质中形成透明的玻璃状物质(ii)所述酶在这类基质中非常稳定(iii)这些酶在溶胶凝胶玻璃状物质中发生性质可逆反应(iv)可以很容易地用光谱法定量测定溶胶凝胶玻璃状物质中发生的光谱变化。所述溶胶凝胶技术的优越性在于无需或者仅需极少量的热。这些酶分子被包埋在共价网络中，而不是通过化学方式连接在无机基体上，因为所述基体的化学键可能会干扰所述分子的活性。干燥玻璃内的细孔网络(＜10nm)不会散射可见辐射，但允许小分子扩散到所述电极表面。多孔无机干凝胶如原硅酸四乙酯(TEOS)衍生的溶胶凝胶是特别有吸引力的用于电化学生物传感器的基质，因为其结合了物理上较坚硬、在水溶液中膨胀可忽略不计、化学惰性和热稳定性的特点。这些生物传感器总体来说灵敏度高、响应时间短，并且不存在任何损害酶活性的问题。
观察到的另一优于现有技术的酶电极的明显优点是酶和介质的零流失。本发明电极的响应时间缩短到30秒，并可重复使用。还观察到所述电极的保存时间变长了，在25-30℃的常温条件下可保存约6个月。
本发明的创造性步骤在于使用微囊封装技术将胆固醇氧化酶(ChOx)和电子介质在硅酸盐溶胶凝胶中固定化，并将上述微囊封装的酶和电子介质溶胶凝胶膜沉积到导电铟锡氧化物(ITO)包被的玻璃板上，从而制成用于测定溶液中的胆固醇的酶电极。
下面的实施例以示例的方式给出，因此不应构成对本发明保护范围的任何形式的限制。
实施例1酶活性的测定将0.05cm36mM的胆固醇溶液溶于2-丙醇溶液中，并与3cm3体积的0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)混合，并恒温在35℃。将ChOx固定化的溶胶凝胶膜包被的ITO玻璃板浸入上述溶液中，并孵育2分钟，取出玻璃板并用双光束光谱仪在240nm测量所述溶液的吸收，从而测定由酶反应产生的胆固醇。通过以下方法根据所述酶固定化的溶胶凝胶玻璃板孵育前后溶液光吸收的变化来评估表观酶活性(Ucm3)。
Σappenz(Ucm-2)=AV/ϵts]]>其中A为孵育前后溶液光吸收的变化，V是总体积(3.05cm3)，ε是胆固醇的毫摩尔消光系数(12.2)，t是反应时间(min)，s是溶胶凝胶膜的表面积(cm2)。一个酶活性单位(Ucm3)定义为每分钟产生1μl mol胆固醇的活性。酶活性测量是在所述酶(ChOx/HRP)固定化的溶胶凝胶膜上进行的。没有观察到酶(ChOx/HRP)从所述酶固定化的溶胶凝胶膜流失。
实施例2用胆固醇氧化酶固定化的溶胶-凝胶-ITO(ChOx/sol-gel/ITO)电极通过电化学法测定含有干扰试剂的胆固醇。
循环伏安法当胆固醇与含有固定化在TEOS衍生的溶胶凝胶膜中的ChOx的酶电极接触时，发生下面的酶反应和电化学反应
记录H2O2的氧化电流作为安培生物传感器中的传感器响应。因为酶的直接固定化，传感器的性质如时间和灵敏度是所述固定化酶的反映。循环伏安法实验是在含不同浓度的胆固醇(0.5mM至10mM)的0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中，用铸塑在ITO玻璃板上的酶固定化的溶胶凝胶膜作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为反电极的条件下进行的。上述实验在作为干扰试剂的0.1mM抗坏血酸和0.5mM葡萄糖存在及不存在的两种情况下进行。所述循环伏安法实验在750mV处显示出氧化峰，且其阳极电流随着胆固醇浓度从0.5mM增加至10mM而不断上升。这种上升是由于H2O2在所述ITO包被的玻璃表面上直接氧化。然而，在有0.1mM抗坏血酸存在时，随着阳极电流上升，位于0.75V处的氧化峰向阳极偏移了150mV达到相对Ag/AgCl电极0.9V处。当0.5mM葡萄糖存在于所述胆固醇溶液(1mM)中时，阳极电流也有增加但对H2O2的氧化电势没有明显影响，这说明胆固醇中存在0.1mM抗坏血酸和0.5mM葡萄糖对测得的阳极电流均有很大的影响实施例3安培响应研究使用类似于循环伏安法实验中所用的三电极电池体系通过安培法来测定磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中的胆固醇。将工作电极(在ITO玻璃上含有胆固醇氧化酶ChOx固定化的溶胶凝胶)在相对Ag/AgCl电极0.9V条件下极化，并且用安培计校准酶作用生成的H2O2来测量对胆固醇(0.5-10mM)的安培响应。在电池中配好不同浓度的胆固醇溶液(2mM-10mM)后，每100秒监测一次电流。5.0μA的最大电流出现在10mM胆固醇时，超过该浓度时没有观测到电流的明显变化。观察到的对总胆固醇的响应时间为90秒。
实施例4用胆固醇氧化酶和铁氰化钾固定化的溶胶-凝胶铟锡氧化物(ChOx/Fe3+/sol-gel/ITO)作为电极，采用电化学法在有抗坏血酸(0.1mM)和葡萄糖(0.5mM)干扰试剂影响的情况下测定胆固醇。
循环伏安法循环伏安法实验是在含不同浓度胆固醇的0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中，用胆固醇氧化酶和铁氰化钾固定化的溶胶-凝胶铟锡氧化物(ChOx/Fe3+/sol-gel/ITO)膜作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为反电极的条件下进行。发生了下列反应
记录氧化电流作为安培生物传感器中的传感器响应。因为酶的直接固定化，所述传感器的性质如时间和灵敏度是所述固定化的酶的反映。用不含介质的酶固定化的溶胶凝胶膜作为电极时，在实施例2中在相对Ag/AgCl电极0.9V处观测到的氧化峰在此实验中向阴极偏移了300mV达到相对Ag/AgCl电极0.4V处，且其随着胆固醇浓度的增加(2-10mM)而上升。胆固醇溶液中存在0.1mM抗坏血酸和0.5mM葡萄糖对测得的氧化电势没有明显影响。
实施例5安培响应研究使用类似于循环伏安法实验中所用的三电极电池体系通过安培法测定磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中的胆固醇。将所述工作电极(在ITO玻璃上含有胆固醇氧化酶ChOx固定化的溶胶凝胶)在相对Ag/AgCl电极0.4V条件下极化，并且测量了对浓度从2mM至10mM变化的胆固醇的安培响应。在电池中配好不同浓度的胆固醇溶液(2mM-10mM)后每100秒监测一次电流(图1)。在6mM胆固醇溶液(1mL)以在0.4V极化的ChOx/Fe3+/sol-gel/ITO电极测得的阳极电流在30秒内达到稳定状态，且这一对胆固醇溶液的响应在5％之内具有重复性。安培法得到的胆固醇浓度的电流检出下限为0.5mM。
本发明的主要优点为1.本发明制备的酶电极显示出可以忽略的酶流失。
2.本发明制备的酶电极对溶液中的胆固醇显示出快速响应。
3.本发明制备的酶电极可在较长时间内保持稳定。
4.本发明制备的酶电极对胆固醇高度敏感。
权利要求
1.制备用于评估水性媒质中胆固醇的酶电极的方法，包括如下步骤a.制备硅酸盐溶液，b.通过将含有3-5IU胆固醇氧化酶及约0.01M电子介质的0.05-0.1M的磷酸盐缓冲液缓缓加入步骤a)所述的硅酸盐溶液中将所述胆固醇氧化酶和电子介质固定化，c.将所得混合物静置至观察到混浊现象，此时所述酶和电子介质的封装完毕，d.将所得混浊混合物涂布在导电基板，e.将所述导电基板与所涂布的混合物在25-30C的温度下干燥至少一天，从而得到所述酶电极。
2.如权利要求1所述的方法，其中所用的硅酸盐溶胶选自原硅酸四乙酯和原硅酸四甲酯。
3.如权利要求1所述的方法，其中所用的磷酸盐缓冲液的pH值范围为6.5-7.2。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述导电基板选自铟锡氧化物包被的玻璃板和银包被的不导电聚合物表面。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述不导电聚合物表面选自膜和片。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述不导电聚合物表面选自聚丙烯酰胺、聚氯乙烯和聚乙烯。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述电子介质选自铁氰化钾、二茂铁以及普鲁士蓝。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述胆固醇氧化酶的浓度范围是3-5IU每平方厘米溶胶凝胶表面。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述制备酶电极的方法是一步法。
全文摘要
本发明涉及通过微囊封装方法对硅酸盐溶胶凝胶上的固定化的胆固醇氧化酶(ChOx)和介质进行包被来制备酶电极的方法。
文档编号C12Q1/00GK1738906SQ02830187
公开日2006年2月22日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者阿伦·库马尔, 拉杰什, 班西·达尔·马尔霍特拉 申请人:科学与工业研究委员会