专利名称：Fgf受体3基因检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基因检测方法，尤其涉及成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因的检测方法。
背景技术：
成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)广泛表达于多种组织细胞，具有重要功能。已经证实FGFR3在胚胎发育、器官发生、细胞分化中发挥着重要的作用。FGFR3基因的异常表达能够导致多种疾病，包括软骨发育不良以及多种肿瘤。研究表明慢性骨髓白血病、恶性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤等疾病均可发现FGFR3的过量表达，而经移植治疗的慢性骨髓白血病人白细胞中FGFR3的表达量显著下降。因此，FGFR3有可能作为病理检验和疗效评价的标志分子。
对于FGFR3的表达水平，目前本领域技术人员认为其包含两层含义，第一是mRNA表达水平，第二是蛋白质表达水平。对于蛋白质表达水平，可以通过免疫的方法来检测FGFR3蛋白表达水平，但该方法的灵敏度较低，同时仅仅是半定量方法，所以实践中较少采用。现有技术中对FGFR3的表达水平的检测方法所涉及的主要是定量检测FGFR3的mRNA表达水平。
对于FGFR3的mRNA表达水平可以通过传统的Northern等分子生物学方法进行定量。但是需要的RNA量很大，会对病人造成较大创伤，难以在临床诊断中应用。因此现有技术中主要通过基于PCR扩增的方法来进行定量。
Dvorak等建立了两项基于PCR扩增的在mRNA水平定量FGFR3表达水平的检测系统，分别是竞争性RT-PCR系统，和Taqman荧光定量法，请参见Dvorak P，Dvorakova D，Doubek M，Faitova J，Pacholikova J，Hampl A，Mayer J.Increased expression offibroblast growth factor receptor 3 in CD34+BCR-ABL+cells frompatients with chronic myeloid leukemia.Leukemia.2003Dec；17(12)2418-25。在该现有技术所披露的两种方法中，前者的灵敏度较低，而后者利用Taqman法，成本较高。
竞争性RT-PCR方法是通过在反应体系中加入竞争模板，然后通过反应终点内源性模板与竞争性模板比例推知反应始点内源性模板的方法。该方法首先要建立竞争模板，费时费力。其次，在定量检测时，样品与竞争模板间浓度差别不能过大，需要反复调节两者间比例。另外，其检测操作烦琐，灵敏度和准确性不高。
Taqman法利用了FGFR3的特异引物扩增出一段FGFR3的基因片段，而后依赖特异Taqman探针定量检测FGFR3的表达水平。其中，Taqman探针在自由状态不发射荧光，而一旦与特异DNA片段结合，并为引导DNA聚合的Taq酶所识别而切断后就将发射荧光，由此能够实时反应PCR扩增的进程。Taqman法的灵敏度和准确性都较好，但需要使用特殊的荧光标记探针和相应的试剂，所以成本较高，限制了在临床分析中的应用。
因此，针对现有技术存在的问题，需要一种快速、准确、低成本的检测FGFR3基因表达水平的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因的检测方法。该方法用于定量检测FGFR3的mRNA表达水平。
本发明运用SYBR Green I进行实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测。
根据本发明第一方面提供的一种FGFR3基因的定量检测方法，包括以下步骤(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’，下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3’；(b)进行RT-PCR反应确定线性空间；以及(c)进行RT-PCR反应建立FGFR3的标准曲线并检测样品中FGFR3的量，该标准曲线为突破阈值循环数与总RNA加入量(亦即不同稀释度的FGFR3量)的对数值之间的线性关系，根据标准曲线，利用样品的突破阈值循环数求得样品中FGFR3的量；其中进行RT-PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。
上述方法还包括建立18S的标准曲线并检测样品中18S的量的步骤。其中建立18S的标准曲线并检测样品中18S的量时扩增18S所用的上游引物18SP1为5’-TTCGGAACTGAGGC CATGAT-3’；下游引物18SP2为5’-TTTCGCTCTGGTCC GTCTTG-3’。该方法，还包括用样品中FGFR3的量除以样品中18S的量得到样品中FGFR3的相对量的步骤。
根据本发明的方法，其中PCR扩增的条件为反应体积15-25μl，优选20μl；引物浓度0.05-1umol/l，优选0.5umol/l；MgCl2浓度0.5-10mmol/l，优选2.5mmol/l；退火条件为45度-60度，时间10秒-60秒，优选52度25秒。进而，根据本发明的方法，还包括提取总RNA和进行体外转录的步骤。
根据上述方法，其中采用荧光染料染色来实时检测的荧光检测温度为75度。
根据本发明的第二方面提供的一种FGFR3基因的定量检测方法，包括以下步骤(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；(b)进行RT-PCR反应，检测样品A中FGFR3的Ct值Cta1和样品中18S的Ct值Cta2；样品B中FGFR3的Ct值Ctb1和样品中18S的Ct值Ctb2；(c)利用下述公式计算样品A和样品B中FGFR3的表达量相差倍数样品A中FGFR3/样品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)，其中，Ct值为突破阈值循环数，即进行PCR扩增时开始进入指数扩增期的循环数，并且，进行RT-PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。
根据上述方法，其中还包括提取总RNA和进行体外转录的步骤。并且采用荧光染料染色来实时检测的荧光检测温度为75度。
根据本发明的检测方法能够精确定量、灵敏度高、线性范围广且成本较低。
图1A示出了FGFR3基因特异条带电泳分析。其中，1100pg总RNA经RT-PCR反应；2100pg总RNA的无RT反应对照；3无模板对照；4分子量标记。
图1B示出了FGFR3特异条带与引物二聚体的熔解曲线分析，其中曲线1100pg总RNA经RT-PCR反应(双峰)；曲线2100pg总RNA的无RT反应对照；曲线3无模板对照。
图2示出了根据本发明的一个实施例中的FGFR3线性区间分析。
图3示出了根据本发明的一个实施例中的18S标准曲线。
图4示出了FGFR3和18S扩增效率相同。
图5示出了对扩增的FGFR3特异片段序列测定。
具体实施例方式
本发明提供了一种FGFR3基因的定量检测方法，包括以下步骤
(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3’；(b)进行RT-PCR反应，建立FGFR3的标准曲线并检测样品中FGFR 3的量，该标准曲线为突破阈值循环数与总RNA加入量(亦即不同稀释度的FGFR3量)的对数值之间的线性关系，根据标准曲线，利用样品的突破阈值循环数得到样品中FGFR3的量；其中进行RT-PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。
根据本发明的一个实施例的FGFR3基因的定量检测方法，还包括建立18S的标准曲线并检测样品中18S的量的步骤。其中建立18S的标准曲线并检测样品中18S的量时扩增18S所用的上游引物18SP1为5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’；下游引物18SP2为5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’。
在根据本发明提供的方法中，FGFR3基因的上游引物、下游引物用于扩增出特异的FGFR3基因片段。本领域技术人员可以理解，定量是否准确依赖于扩增出的片段是否特异，扩增的效率是否足够高。所以，FGFR3基因的上游引物、下游引物对于准确定量检测FGFR3基因的表达水平至关重要。如果引物存在缺陷，将会导致扩增得到的片断无特异性或者特异性较差，使扩增产物中包含FGFR3基因以外的物质，这将严重地影响检测结果的准确性。
在根据本发明提供的方法中所用的FGFR3基因的上游引物、下游引物是从众多引物中挑选出的，其中上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’。该对引物对于扩增FGFR3基因具有良好的特异性。该引物的优点在下面结合图1A和图1B进行说明。
本领域技术人员可以理解，由于实验条件的限制，在试验中无法提供绝对相同的条件对不同的样本进行检测(例如器壁的粘附总是难以避免的)。这样就会使检测结果产生误差。为了尽可能地减小这种误差的产生，在根据本发明的一个实施例中使用一个内参照物18S来减小操作中的误差。请参照文献Daniel R.McCulloch，Pascal Akl，Hemamali Samaratunga，et al.Expression of the DisintegrinMetalloprotease，ADAM-10，in Prostate Cancer and Its Regulation byDihydrotestosterone，Insulin-Like Growth Factor I，and EpidermalGrowth Factor in the Prostate Cancer Cell Model LNCaP.ClinicalCancer Research Vol.10，314-323，January 2004。其中，内对照物18S使用上游引物18SP1 5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’；下游引物18SP2 5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’；用于实时定量内对照18S。由于样品中FGFR3基因的量可以变化，而18S的量是相对稳定的，利用18S作为内参照物可以降低不同样品之间由于操作条件的差异而产生的误差。18S基因的上游和下游引物用于扩增18S基因特异片段，18S主要作为内参照用来校准FGFR3所得结果。样品中FGFR3的量除以样品中18S的量得到校准后的样品中FGFR3的相对量。
在根据本发明提供的方法中，确定标准曲线有两个目的。第一，是为了确定本发明的方法的适用范围。在一定范围内，不同浓度的样本之间存在一定的线性关系，在标准曲线的范围内，利用样本之间的线性关系可以确定某一样品的浓度。但是如果被测样品的浓度超出了标准曲线的范围，利用线性关系推导出的浓度的准确性就无法保证。第二，是为定量不同样本提供相比较的依据。确定线性空间范围的方法如下首先，准备标准样品。即将血液来源的总RNA经NQ1处理去除可能的DNA污染，并使用Access RT-PCR system以随机引物进行反转录得到cDNA。其次，按不同稀释度稀释cDNA标准品，例如106稀释、105稀释、104稀释、103稀释、102稀释、10稀释，或者分别46稀释、45稀释、44稀释、43稀释、42稀释、4稀释等。稀释倍数是本领域技术人员可以改变的。然后，以经过稀释的标准品为模板，进行PCR反应，并实时荧光检测。荧光检测利用的是一种荧光染料Sybr green I。扩增反应利用FGFR3P1/P2；18SP1/P2进行。最后，建立标准曲线。该标准曲线可以显示出线性空间的范围(在该范围内各点之间线性关系良好)。可以理解的是，确定线性空间所用的标准曲线也可以用作测定样品中FGFR3的量的标准曲线。但是为了结果的准确性，通常在测定样品中FGFR3的量时另外建立标准曲线。
Sybr green I是一种荧光染料，此染料在自由状态不释放荧光，而一旦和双链DNA相结合机会释放出强烈的荧光。因此在PCR过程中随着产物的增加，荧光信号会逐渐加强，因此可以通过实时检测荧光信号来反应PCR的扩增。(Morrison，TB，Weis，JJ and WittwerCT.，quantification of low copy transcripts by continuous SYBR GreenI monitoring during amplification.1998，Biotechniques 24，954-959)。Sybr green I与双链DNA间属于非特异结合，利用sybr green I进行荧光定量必须避免任何非特异条带的产生。在本发明的扩增条件下，FGFR3条带非常特异，不存在非特异条带的影响。引物二聚体也能够与sybr green I相结合并产生荧光，过多的引物二聚体同样影响定量的准确性。调整检测温度是消除引物二聚体影响的有效方法。通常荧光检测温度应高于引物二聚体解链温度并低于基因特异条带解链温度3到4度，从而保证信号值完全反映基因特异条带的扩增。熔解曲线分析表明FGFR3特异条带与引物二聚体的解链温度有较大差别，可以通过上述方法进行区分，实验中采用74-77摄氏度为荧光采集温度，优选75℃，有效地排除了引物二聚体的干扰，保证了结果的准确。
FGFR3反应条件的优化。经反复试验确定FGFR3扩增系统参数如下反应体积15-25μl，优选20μl；引物浓度0.05-1umol/l，优选0.5umol/l；MgCl2浓度0.5-10mmol/l，优选2.5mmol/l；退火条件为45度-60度，时间10秒-60秒，优选52度25秒。FGFR3的扩增条件为，预变性95度15分钟，扩增40个循环94度15秒，52度25秒，72度20秒，75度5秒，并读荧光信号。18S的扩增条件为，预变性95度15分钟，扩增40个循环94度15秒，60度70秒，78度5秒，并读荧光信号。
本发明的第二方面提供了另外一种简便的FGFR3基因的定量检测方法，即ΔΔCt法，其包括以下步骤(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3’；(b)进行RT-PCR反应，检测样品A中FGFR3的Ct值Cta1和样品中18S的Ct值Cta2；样品B中FGFR3的Ct值Ctb1和样品中18S的Ct值Ctb2(c)利用下述公式计算样品中FGFR3的相对量样品A中FGFR3/样品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)，其中，Ct值为突破阈值循环数，即进行PCR扩增时开始进入指数扩增期的循环数。检测样品A(第一样品)中FGFR3的Ct值为Cta1和该样品中18S的Ct值为Cta2；样品B(第二样品，标准样)中FGFR3的Ct值为Ctb1和该样品中18S的Ct值为Ctb2。并且，进行RT-PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。
在本发明的第二方面中，进行了18S和FGFR3扩增效率异同的测定血液来源的总RNA 100ng经随机引物反转录为cDNA，2倍梯度稀释，分别求算每个稀释度18S和FGFR3的Ct值，以每个稀释度的ΔCt值(FGFR3和18S Ct值之差)对相对稀释倍数的对数值作图。经线性回归分析，所得直线斜率值小于0.1时可以认为18S与FGFR3具有相同扩增效率。由于FGFR3是需要检测的目的基因，在不同的样品中其表达量会有较大的差别，由于18S是一种看家基因，其表达量在不同的样品中基本相同。因此18S被用来作为内参照，以此来校准检测时所加入的总RNA量。
相对ΔΔCt法而言，使用常规实时定量RT-PCR法成本较高。ΔΔCt法由于不需要绘制标准曲线，节省了试剂消耗能够有效降低成本。应用ΔΔCt法的前提是目标基因和内对照基因的扩增效率必须相等。根据(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System UserBulletin 2.P/N 4303859B，Stock No.777802-002)提供的方法，我们检验了梯度稀释后18S和FGFR3之间ΔCt的变化。ΔCt成线性分布，方程斜率为0.0232，所以18S和FGFR3的扩增效率基本相同，参见图4。所以，在本发明中还可以使用ΔΔCt法来检验不同样本间的表达差异。
方法和优选条件仪器lightcycler荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；高速冷冻离心机购自德国Heraeus公司；Genequant pro紫外分光光度仪购自美国Amercia公司。凝胶成相系统购自美国Kadak公司。
试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司(CA)；AccessRT-PCR system、无RNA酶污染的DNA酶NQ1购自美国Promega公司；QuantiTectTMSYBRGreen PCR Kit(Qiagen sybr green I定量PCR试剂盒)购自德国Qiagen公司。引物由上海生工生物有限公司合成。
引物实时定量FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；内对照物18S使用上游引物18SP1 5’-TTCGGAACTGAGGC CATGAT-3’；下游引物18SP2 5’-TTTCGCTCTGGTCC GTCTTG-3’；用于实时定量内对照18S。
a.提供如前所述的引物。
b.提取总RNA，在细胞样品中加入Trizol 1ml，用注射器吹打至完全消化溶解。每管加入氯仿约200μl，震荡15秒，置室温放置3分钟。离心12000g，4℃，15分钟。上层水相回收到新EP管中，每管加入异丙醇500μl，混匀，置室温10分钟，离心12000g，4℃，10分钟。弃上清，每管加75％乙醇1ml，混匀，离心7500g，4℃，5分钟。弃上清，吸干残留液，风干10分钟。每管加DEPC-H2O，30μl，置-80℃保存。上述条件为优选条件，本领域技术人员可以对其中的条件进行适当改变。
c.进行RT-PCR反应，建立FGFR3的标准曲线并检测样品中FGFR3的量。该步骤中利用标准样建立标准曲线。标准样一般选择FGFR3表达水平较高的白血病人样品。该标准样一般可以先经过多次选择，找到合适的样品，然后都用该样品作为标准品。在开始选择时一般是随机选择，然后在确定FGFR3表达水平较高的样品。
其中，RT-PCR反应如下RNA样品经RQ1处理去除可能的DNA污染，使用Access RT-PCR system以随机引物进行反转录，所得cDNA分别利用FGFR3P1/P2；18SP1/P2进行实时定量PCR扩增。优选条件如下总RNA经紫外分光光度计定量，取2ug总RNA70℃水浴10分钟，使用RQ1酶切，37℃水浴60分钟。酶切后的RNA样品经酚抽提去除蛋白成分。加入糖元，乙醇重新沉淀总RNA。取纯化的总RNA 1ug，利用随机引物，AMV逆转录酶，进行逆转录，得到cDNA。取cDNA2ul，基因特异引物FGFR3P1/P2或18SP1/P2终浓度0.5uM，MgCl2浓度2.5mM，总体积20ul，使用Qiagen sybr green I定量PCR试剂盒(德国Qiagen公司)进行扩增。FGFR3的扩增条件为，预变性95度15分钟，扩增40个循环94度15秒，52度25秒，72度20秒，75度5秒，并读荧光信号。18S的扩增条件为，预变性95度15分钟，扩增40个循环94度15秒，60度70秒，78度5秒，并读荧光信号。
实施例1，确定标准曲线。对标准样品进行上述步骤a至b。
步骤cFGFR3实时定量PCR反应系统标准曲线测定的步骤如下用于制备标准曲线的经过RQ1酶切处理过的标准品总RNA 1ug经随机引物反转录得到cDNA。将此cDNA样品按不同稀释度稀释，46稀释、45稀释、44稀释、43稀释、42稀释、4稀释。分别取每一数量级稀释液1ul进行PCR扩增，实时荧光检测。使用FGFR3特异引物P1/P2可以从低至100pg的总RNA中扩增得到大小正确(110bp)的特异条带FGFR3-1(图1A)，经测序正确无误(图5)。相同条件下，无反转录对照和无模板对照中会形成较小的引物二聚体(图1A)。根据图1A可以看出，利用本发明提供的引物，没有出现非特异产物，所以本发明提供的引物对于扩增FGFR3基因具有良好的特异性。如图1B所示，经熔解曲线分析，特异条带FGFR3-1熔解温度为78.9度，引物二聚体熔解温度为71.6度。因此将荧光检测温度设定为75度。而且，从图1B中可以看出，FGFR3特异条带与引物二聚体的熔解曲线的峰值明显地分开，通过对荧光检测温度的适当设定，引物二聚体不会对对检测结果产生不利的影响。该荧光检测温度可以在74至77度之间，优选75度。所以根据图1B也可以看出，本发明提供的引物对于扩增FGFR3基因具有良好的特异性。
以cDNA质量对数值对Ct值作图得到FGFR3的标准曲线。利用Excel进行线性回归分析。参见附图2，该图中有6个数据点，通过线性回归分析发现线性关系良好，其R2达到0.9991，由此确定FGFR3实时定量PCR反应系统可以定量少至100pg血液RNA中FGFR3基因表达量。该标准曲线中显示出线性空间的范围在102至105pg血液RNA中FGFR3基因表达量。该线性空间范围较大，也说明本发明所提供的方法具有适用范围广的优点。
需要说明的是，图2中纵轴显示的是总RNA加入量而不是总RNA的对数值。这只是为了直观地显示线性空间的范围。实际上在图2中横轴的坐标是指突破阈值循环数Ct值，而纵轴的坐标是总RNA加入量的对数值。即，图中显示的纵坐标10对应的实际纵坐标应该是10的对数1，纵坐标100对应的实际纵坐标应该是100的对数2，依此类推。线性方程Y＝-0.2863X+8.3233中X是突破阈值循环数Ct值，Y是总RNA加入量的对数值。
图3是内参照物18S的标准曲线(建立方法与FGFR3的标准曲线相同)。其中横轴X的坐标是指突破阈值循环数Ct值，而纵轴Y的坐标是总RNA加入量的对数值(图3中纵轴显示的是总RNA加入量)。线性方程为Y＝-0.2848X+6.0424。R2为0.9993，表明线性关系良好。
PCR产物测序通过对PCR产物进行测序，证明利用本发明提供的引物，提供的条件扩所增出的产物的确是特异的FGFR3基因片段。其中，测序引物与实时定量所用引物相同，测序结果见图5。这证明利用本发明提供的引物进行PCR扩增，不但具有良好的特异性，而且本发明的方法可靠性好。
步骤d.待测样品RNA经RQ1处理去除可能的DNA污染，使用Access RT-PCR system以随机引物进行反转录得到cDNA。cDNA经10倍稀释，取1ul与上述6个稀释度的标准品一起使用FGFR3特异引物FGFR3P1/P2，18S特异引物18sP1/P2扩增。所得标准曲线见图2和图3。所得Ct值，以及通过Ct值和标准曲线求得的相对含量见下表。
根据图2的标准曲线，对于样品1，根据线性方程Y＝-0.2863X+8.3233，当FGFR3 Ct值X为20.22时，FGFR3相对含量的对数值Y为2.5343，FGFR3相对含量为342.2。对于样品2，根据线性方程Y＝-0.2863X+8.3233当FGFR3 Ct值X为17.68时，FGFR3相对含量的对数值Y为3.2615，FGFR3相对含量为1826.00。
根据图3的标准曲线，对于样品1，根据线性方程Y＝-0.2848+6.0424，当18S Ct值X为12.81时，18S相对含量的对数值Y为2.3941，18S相对含量为247.80。对于样品2，根据线性方程Y＝-0.2848+6.0424，当18S Ct值X为12.15时，18S相对含量的对数值Y为2.5821，18S相对含量为382.03。
样品中FGFR 3的量除以样品中18S的量得到样品中FGFR 3的相对量。对于样品1，342.2除以247.80得到1.3809；对于样品2，1826.00除以382.03得到4.7797。样品2相对于样品1的FGFR3含量为4.7797除以1.3809等于3.46。同理，样品3相对于样品1的FGFR3含量为2.87。
实施例2，测定18S与FGFR3扩增效率。
利用实施例1中同样的条件，血液来源的总RNA 100ng经随机引物反转录为cDNA，2倍梯度稀释，分别求算每个稀释度18S和FGFR3的Ct值，以每个稀释度的ΔCt值(FGFR3和18S Ct值之差)对相对稀释倍数的对数值作图。经线性回归分析，所得直线斜率值为0.0232。当该斜率值小于0.1时可以认为18S与FGFR3具有相同扩增效率，所以18S与FGFR3具有相同扩增效率。反应条件参见实施例1。18S与FGFR3扩增效率的测定结果如图4所示。
待测样品RNA经RQ1处理去除可能的DNA污染，使用AccessRT-PCR system以随机引物进行反转录得到cDNA。CDNA稀释10倍，使用FGFR3特异引物FGFR3P1/P2，18S特异引物18sP1/P2扩增。所得Ct值，以及通过Ct值利用下列公式求得的相对含量见下表。
公式样品A中FGFR3/样品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)其中Ct值为突破阈值循环数，检测样品A(第一样品，被测样品)中FGFR3的Ct值为Cta1和该样品中18S的Ct值为Cta2；样品B(第二样品，标准样)中FGFR3的Ct值为Ctb1和该样品中18S的Ct值为Ctb2。样品2中FGFR3相对于样品1中FGFR3的量为2(3.68)比较实施例1与实施例2的结果可知，采用实施例1中的方法与实施例2中的方法得到的结果基本相同。这说明采用实施例2中的简便方法同样可以得到可靠的结果。
所以，根据本发明提供的方法，可以快速、准确、低成本的检测FGFR3基因表达水平。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种FGFR3基因的定量检测方法，包括以下步骤(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’，下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；(b)进行RT-PCR反应，确定线性空间；以及(c)进行RT-PCR反应，建立FGFR3的标准曲线并检测样品中FGFR3的量；其中所述进行RT-PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的FGFR3基因的定量检测方法，还包括建立18S的标准曲线并检测样品中18S的量的步骤。
3.根据权利要求2所述的FGFR3基因的定量检测方法，其中建立18S的标准曲线并检测样品中18S的量时扩增18S所用的上游引物18SP1为5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’；下游引物18SP2为5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’。
4.根据权利要求3所述的FGFR3基因的定量检测方法，还包括用样品中FGFR3的量除以样品中18S的量得到样品中FGFR3的相对量的步骤。
5.根据权利要求3所述的FGFR3基因的定量检测方法，其中所述PCR扩增的条件为反应体积15-25μl，优选20μl；引物浓度0.05-1umol/l，优选0.5umol/l；MgCl2浓度0.5-10mmol/l，优选2.5mmol/l；退火条件为45度-60度，时间10秒-60秒，优选52度25秒。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的FGFR3基因的定量检测方法，其中还包括提取总RNA和进行体外转录的步骤。
7.根据权利要求6所述的FGFR3基因的定量检测方法，其中所述采用荧光染料染色来实时检测的荧光检测温度为75度。
8.一种FGFR3基因的定量检测方法，包括以下步骤(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’，下游引物FGFR3P2为5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；(b)进行RT-PCR反应，检测样品A中FGFR3的Ct值Cta1和样品中18S的Ct值Cta2，样品B中FGFR3的Ct值Ctb1和样品中18S的Ct值Ctb2；(c)利用下述公式计算样品A和样品B中FGFR3的表达量相差倍数样品A中FGFR3/样品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)其中，所述Ct值为突破阈值循环数并且，进行RT-PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其中还包括提取总RNA和进行体外转录的步骤。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述采用荧光染料染色来实时检测的荧光检测温度为75度。
全文摘要
本发明涉及一种FGFR 3基因的定量检测方法，包括以下步骤(a)提供引物，其中该FGFR3基因的上游引物FGFR3P1为5’－TTAACACTTCTTACGCAATGCT－3’；下游引物FGFR3P2为5’－GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA－3’；(b)进行RT－PCR反应确定线性空间；以及(c)进行RT－PCR反应建立FGFR 3的标准曲线并检测样品中FGFR 3的量；其中进行RT－PCR反应采用荧光染料染色来实时检测PCR扩增。本发明还涉及一种FGFR 3基因的定量检测方法，利用下述公式计算样品A和样品B中FGFR 3的表达量相差倍数样品A中FGFR 3/样品B中FGFR 3＝文档编号C12Q1/68GK1873022SQ200510072338
公开日2006年12月6日 申请日期2005年5月30日 优先权日2005年5月30日
发明者陈彪, 蔡彦宁 申请人:首都医科大学宣武医院