含有rna配体的纳米颗粒的制作方法

专利名称：含有rna配体的纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米颗粒，更具体地涉及含有RM配体如小干扰RNA (siRNA)和孩吏RNA (miRNA)的纳米颗粒，及其在各种应用中的用途。
背景技术：
已经发现小RNA分子在调节基因表达中起着多种作用。这些作用 包括小干扰RNA( siRNA )对mRNA的定向降解，转录后基因沉默(PTG )， 微RM (miRM)对mRNA的发育可控型序列特异性翻译抑制作用和定 向转录基因沉默。RNAi活性限制了转座子转移并提供了抗病毒防御
(Pal-Bhadra等，2004 )。也已经证明了 RNAi机构和小RM在异染 色质复合物的寻靶以及特定染色体位点上的外遗传基因沉默中的作用
(Verdel等，2004 )。双链RNA ( dsRM )依赖性转录后沉默，也称为 小抑制RM ( siRNA)或RM干扰(RMi )，是其中dsRNA复合物可以 靶向准特异性的同源基因以在短时间段内沉默的现象。它作为促进具 有序列同一性的mRNA降解的信号。20-nt siRNA通常足够长以诱导基 因特异性沉默，而且足够短以避开宿主应答(Elbashir等，2001 )。 定向基因产物表达的降低可以是大范围的，具有由几个siRM分子诱 导的90°/。沉默。
由于小分子寡核苷酸的递送可以绕过与基因治疗相关的困难，所 以使用siRNA可能具有优于传统基因治疗的优势。迄今为止，基于载 体的治疗基因的体内有效递送仍然是成功的基因治疗中的障碍。已经 观察到尽管通过siRNA对靶基因的剔除不是永久性的，单独的siRNA 转染可以导致亲本以及子代细胞中靶蛋白的抑制延长(Tuschl, 2001 )。 然而，siRNA的递送在本领域中仍然存在问题。
WO02/32404 ( ConsejoSuperiorde;nvestigaciones
Scientificas)公开了由金属或半导体原子形成的纳米颗粒，其中包 含碳水化合物的配体与纳米颗粒的核心共价连接。这些纳米颗粒用于 调节碳水化合物介导的相互作用且是可溶而无毒的。享有 GB-A-0313259.4 ( Consejo Superior de Investigaciones Scientificas和Midatech Limited)优先^又的PCT申请7>开了具有 核心的》兹性纳米颗粒，该核心包含钝态的^兹性金属原子，核心与配体 共价连接。

发明内容
泛泛地说，本发明涉及具有核心的纳米颗粒，该核心包含金属和/ 或半导体原子，核心与RM配体共价连接。RNA配体通常是设计来模 拟小干扰RNA ( siRNA)和孩￡ RNA (miRNA)序列的短RNA序列。纳米颗 粒可以用于递送RNA配体并具有广泛的用途，可在体外系统中应用和 用于治疗或诊断。例如，本发明的纳米颗粒可以用于(1)定向转录基 因沉默，(2)定向mRNA降解，(3)mRM成象，(4)通过使用相同 或不同纳米颗粒上的多种RNA配体来抑制各种途径，(5 )气雾剂递送， 例如至肺，(6)结合mRM沉默用于革巴向siRNA抗性mRM和(7)用 作功能基因组中的工具。
在本领域中，根据其来源将短RM序列称为"短干扰RNA"( siMA ) 或"微RNA"( miRNA )。两种类型的序列都可以通过结合互补RNA( nmRM ) 和引发mRM消除(RMi)或阻止mRNA翻译成蛋白质用于下调基因表 达。siRNA通过长双链RNA的加工来产生，且实际上发现时通常是外 源的。微干扰RM (miRM)是内源编码的小非编码RNA，通过短发夹 的加工来产生。siRNA和miRNA都可以抑制带有部分互补靶序列的mRNA 的翻译而没有RNA剪切，且可以降解带有完全互补序列的mRNA。 RNAi 途径还作用于基因组，如描述于Science, 301: 1060-1061, 2003。
与纳米颗粒相连的RM可以是单链或双链的(双链体)。将miRNA 样序列用作配体的情况中，RNA序列可以是发夹，即包括部分互补区， 接近它们可以退火形成发夹的末端。纳米颗粒可以任选地包含另外类
型的配体，如碳水化合物来形成糖纳米颗粒，和/或多于一种的siRM。 以下将更详细地讨论纳米颗粒及其用途。有利地，siRM与纳米颗粒 的连接可以提供对siRNA的保护使之不受血液、组织培养基中或细胞 内存在的核糖核酸外切酶的影响。
因此，第一个方面中，本发明提供了含有核心的纳米颗粒，该核 心包括金属和/或半导体原子，其中核心与多种配体共价连接且配体包 括RNA配体。
形成纳米颗粒的siRNA配体可以是单链或双链的(双链体)。然 而，为了最佳化RNA介导的靶基因功能下调的有效性，优选的是选择 siRNA分子的长度来确保RISC复合物对siRNA的正确识别，所述RISC 复合物介导mRNA靼被s iRNA的识别且优选体内施用纳米颗粒时，s iRM 足够短来降低宿主应答。
miRNA配体通常是单链的并具有能够使配体形成发夹的部分互补 区。miRNA通常是单链RNA的形式，并认为调节其他基因的表达。miRNA 是从DNA转录，但不翻译成蛋白质的RM基因。编码miRNA基因的DNA 序列比miRNA长。该DNA序列包括miRM序列和近似反向互补体。当 该DM序列转录成单链RNA分子时，miRNA序列及其反向互补体碱基 对形成双链RNA节段；总的来说，该RNA的结构称为发夹结构('短 发夹RNA，或shRNA)。然后Dicer酶从发夹结构中切掉双链区，而释 放成熟miRNA。
通过在RNA聚合酶III启动子如人H1或7SK启动子的控制下用编 码shRNA序列的DNA构建体转染细胞，可以在细胞内生产shRNA。或 者，可以在外部合成shRNA并直接引入细胞中。
通常，旨在模拟siRNA和miRNA效果的RNA配体具有10至40个 核糖核苷酸(或其合成类似物)，更优选17至30个核糖核苷酸，更 优选19至25个核糖核苷酸，最优选21至23个核糖核普酸。在使用 双链siRNA的本发明的一些实施方案中，该分子可具有对称的3，突 出端，例如， 一个或两个(核糖)核苷酸的3，突出端，通常是dTdT 的UU3，突出端。
在通过shRNA的剪切来产生miRM的情况中，shRNA序列优选40 至100个碱基长，更优选40至70个碱基长。发夹的茎区优选19至 30个碱基对长。茎区可以含有G-U配对来稳定发夹结构。
在使用双链RNA的实施方案中，有义和反义链可以退火形成双链 体。通过在反应混合物中包含双链体来形成纳米颗粒，在颗粒自动装 配的过程中RNA可以连接至核心。根据双链siRNA衍化末端(每条链 的四个可能的5，和3，端)的数量，至多四个纳米颗粒可以连接至单 个siRNA双链体上，且对于每个双链siRM，理论上形成至多十五个 可能的构建体，这些中的一个具有四个纳米颗粒(每个末端两个)， 四个具有一个纳米颗粒，六个具有两个纳米颗粒和四个具有三个纳米 颗粒。在使用单链siRM的情况中，纳米颗粒核心可以连接在siRNA 的任一个或两个衍化末端(即，5，或3，端)上，例如，产生三种不 同的纳米颗粒。这些纳米颗粒可以以这种形式来使用或该方法可以任 选地包括使含有纳米颗粒的siRNA与siRM的互补链退火，从而在预 先形成的纳米颗粒上原位形成双链体的另外的步骤。在miRNA样配体 的形成过程中，通常一个或两个纳米颗粒连接在RNA序列的末端上。
因此，在另一方面中，本发明提供了在此所述纳米颗粒的生产方 法。通常，该方法包括将RM配体与纳米颗粒的核心缀合，通过用连 接物衍化RM链并将衍化的RNA包含于由此合成纳米颗粒核心的反应 混合物中。在纳米颗粒自动装配的过程中，纳米颗粒核心通过连接物 连接至RNA上。优选，连接物是二硫化物连接物，例如混合的二硫化 物连接物，尽管也可以使用亚乙基连接物或肽连接物。示例连接基团 由通式HO-(CH丄-S-S-(CH丄-OH来表示，其中n和m独立地为1至5。 RNA通过末端磷酸基团，在优选的混合二硫化物连接物的情况中，通 过一个末端羟基，可以方便地与间隔物连接。当合成纳米颗粒时，连 接物的-S-S-断裂形成两个含硫连接物，各自通过-S-基团可以共价连 接至纳米颗粒的核心上。使用混合的二硫化物连接物有助于避免RNA 二聚物的形成。
如上所述，在与纳米颗粒核心连接的RNA是单链的情况中，该方
法可包括使与第一链互补的RNA分子退火以提供连接至纳米颗粒上的 双链RM配体的另外的步骤。还可以制备具有退火的双链RM的纳米 颗粒，该RM的一条或两条链由二硫化物连接物功能化。备选地或另 外地，该RNA的有义和反义链可以连接到不同的纳米颗粒上并一起退 火。
本发明的优选实施方案中，为了将双链RM掺入自动装配中的纳 米颗粒中，可以用混合的二硫化物来衍化该RNA的一个或两个末端。 将双链体掺入纳米颗粒中后，将RNA和混合二硫化物的化学成分都掺 入珠粒中。因此，混合二硫化物的化学成分可以凭本身的性质，如耙 向特性包含重要的信息(例如，特异性结合对的成员)，或有可能给 最终形成的纳米颗粒提供另外的物理特性。可以将混合的二疏化物连 接在有义或反义链的3，端或5，端上。
一实施方案中，使用首次在WO 02/32404中所述的方法可以合成 具有核心的纳米颗粒，该核心包含金原子，其中使用二硫化物连接物 来衍化配体并在还原剂存在下使衍化的配体与HAuCl4 (四氯金酸)反 应来生成纳米颗粒。根据该方法，可以将曱醇或水中的二硫化物保护 的RM加入四氯金酸的水溶液中。优选的还原剂是硼氩化钠。该方法 的这些和其他特征描述于WO 02/32404中。
一些应用中，可以使用许多不同的RM分子。可以作为与一组纳 米颗粒缀合的不同配体来提供这些不同的RNA分子或不同的RNA分子 可以是单独的纳米颗粒群，并任选地混合在一起。第一种情况中，本 领域技术人员将意识到由RM与纳米颗粒缀合形成产品混合物的情况 中， 一组纳米颗粒可以包含多种如上所述的产品。在使用多个配体的 情况中，可以使用模拟siRNA和miRM的配体。
除了 RNA分子，纳米颗粒可以包含一种或多种另外类型的配体和/ 或RNA配体除了 RM组分外还可以包含一种或多种不同类型的基团或 结构域。例如，另外的配体，或配体的基团或结构域，可以包括一种 或多种肽，蛋白质结构域，核酸分子，脂质基团，碳水化合物基团， 任何有机或阴离子或阳离子基团。碳水化合物基团可以是多糖，寡糖或单糖基团。优选的配体包括糖缀合物，从而形成糖納米颗粒。如以
下在纳米颗粒用途的讨论中所指出的，配体(RNA或另外的配体)可
以是特异性结合对的成员并用于将纳米颗粒靶向其中存在特异性结合 对的另一成员的靶位置。在除了 RNA配体以外还存在核酸分子的情况 中，该核酸分子可以包括单或双链DNA或RNA。颗粒可以具有多于一 种固定于其上的配体，例如，2， 3， 4, 5， 10， 20或100种不同配体。 备选地或另外地，可以一起使用多种不同类型的纳米颗粒。优选实施 方案中，连接到颗粒单个金属核心上的全部配体的平均数为至少一个 配体，更优选5G个配体，最优选60个配体。
优选，纳米颗粒具有平均直径为0. 5至50nm,更优选0. 5至10nm， 更优选1.0至5nm，再更优选3. 0至7. Onm的核心。当除了核心以外 还考虑配体时，优选颗粒的总平均直径为5. 0至lOOnm，更优选5至 50nm，最优选10至30nm。可以使用本领域/〉知的^支术如透射电子显
微镜法来測J:平均直径。
核心,料可以是金属或半导体并可以由多于一种类型的原子形 成。优选，核心材料是选自Au， Fe或Cu的金属。纳米颗粒核心还可 以由合金来形成，所述合金包括Au/Fe， Au/Cu， Au/Gd， Au/Fe/Cu， Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd,并可以用于本发明中。优选的核心材料是 Au和Fe，最优选的材料是Au。纳米颗粒的核心优选包含约100至500 个原子(例如，金原子)来提供纳米级的核心直径。向其他特别有用 的核心材料中掺杂一种或多种NMR活性的原子，使得在体外和体内都 可以使用NMR来检测纳米颗粒。NMR活性原子的实例包括!^11+2， Gd", Eu+2， Cu+2， V+2， Co+2, Ni", Fe+2， Fe+3和镧系元素+3，或本申请别处所 述的量子点。
可以检测含有半导体原子的纳米颗粒核心，因为纳米级半导体晶 体能够作为量子点，即它们可以吸收光，从而将材料中的电子激发到 更高的能级，随后以材料的特征性频率释放光的光子。半导体核心材 料的实例是硒化镉，硫化镉，碲化镉。还包括锌化合物，如硫化锌。
一些实施方案中，本发明的纳米颗粒或RNA分子包含可检测的标
记。该标记可以是纳米颗粒核心或RNA配体或另一种配体的成分。由 于纳米颗粒的该成分的固有特性或通过与另一种可检测部分连接，缀 合或相连，该标记是可检测的。优选的标记实例包括为荧光基团，放 射性核素，磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素，若丹明或 四甲基若丹明，Texas-红，Cy3， Cy5等，可以通过荧光标记的激发并 使用拉曼散射光谱测定法检测所发射的光来检测(Y. C. Cao， R. Jin， C. A. Mirkin, Science 2002， 297: 1536—1539)。
一些实施方案中，纳米颗粒可以包括放射性核素，用于使用放射 性核素发射的放射性来检测纳米颗粒，例如，使用PET， SPECT，或用 于治疗，即用于杀灭靶细胞。本领域中常用的易于调整以适合于本发 明的放射性核素实例包括"，C，其以多种氧化态存在，尽管最稳定的 是TcO"; "P或"P; "Co; 59Fe;通常以Cu"盐使用的fi7Cu;通常以Ga3+ 盐使用的"Ga，例如，柠檬酸镓；68Ge; 82Sr; "Mo; mPd;通常以In3+ 盐使用的mIn;通常以碘化钠使用的125I或131I; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re;通常以Tl+盐如氯化铊使用的2，1; 39Y3+; 71Lu3+;和24Cr2+。放射 性核素用作标记和示踪剂的一般用途是本领域公知的且本领域技术人 员可以容易地调整以适合用于本发明的各方面中。通过将其掺杂于纳 米颗粒的核心或包括它们作为固定于纳米颗粒上的配体一部分存在的 标记，可以非常容易地使用放射性核素。
另外地或可替换地，可以使用本领域公知的多种技术，使用如上 所述的与纳米颗粒相连的标记或通过使用它们的特性来检测本发明的 纳米颗粒，或它们与其它组分相互作用的结果。这些检测纳米颗粒的 方法可以从检测纳米颗粒结合另一种组分时发生的聚集，例如，通过 简单的目测或使用光散射(含有纳米颗粒溶液的透射率)，至使用尖 端技术如透射电子显微镜法(TEM)或原子力显微镜法(AFM)来观察 纳米颗粒。检测金属颗粒的另外的方法是使用等离振子共振，即在金 属表面的电子激发，通常由光照射引起。表面等离振子共振(SPR)现 象存在于金属(如Ag或Au)和绝缘材料如空气或水的界面上。随着 分析物结合至固定于纳米颗粒表面上的配体改变了界面的折射率，SPR发生了改变。SPR的另一个优势是可以用于监控实时相互作用。如上 所述，如果纳米颗粒包括或掺杂了 NMR活性原子，那么该技术可以用 于使用本领域公知的技术在体外或体内检测该颗粒。还可以使用基于 定量信号放大的系统，利用纳米颗粒促进的银(I )还原来检测纳米颗 粒。如果纳米颗粒包括作为荧光探针的配体，则可以使用荧光光谱测 定法。此外，碳水化合物的同位素标记可以用来帮助它们的检测。
本发明提供了呈现配体的球形阵列的方法，该阵列具有优于现有 技术中提出的其他类型阵列的优势。特别地，纳米颗粒在大多数有机 溶剂中，尤其在水中是可溶的。这可以用于它们的纯化中且重要地意 味着可以在溶液中使用，用于呈现固定于颗粒表面的配体。事实是可 溶的纳米颗粒具有呈现天然构象配体的优势。对于治疗应用，纳米颗 粒在生理条件下是无毒的，可溶的且是稳定的。
一些实施方案中，纳米颗粒的核心可以是磁性的并包含磁性金属 原子，任选地与钝态金属原子结合。例如，钝态金属可以是金且柏， 银或铜，且磁性金属可以是铁或钆。优选实施方案中，钝态金属是金 且磁性金属是铁。在这种情况中，核心中钝态金属原子与磁性金属原 子的适当比例是约5: 0. 1至约2: 5。更优选地，比例为约5:0. l至约 5:1。如本文所用的，术语"钝态金属"指的是没有显示出磁性特性且 对于氧化是化学上稳定的金属。本发明的钝态金属可以是抗磁性的。 抗磁性指的是具有全部成对电子的材料，因此其每个原子不具有永久 的净磁矩。磁性材料具有一些未成对的电子且对于外部磁场是绝对敏 感的-即，外部磁场诱导电子随着外加磁场排列起来，因此电子的磁矩 得到调整。磁性材料可以是顺磁性的，超顺磁性的或铁磁性的。顺磁 性材料对外部磁场不是非常敏感，并在除去外部磁场时不再保持它们 的磁性特性。铁磁性材料对外部磁场高度敏感，甚至在没有外部磁场 存在时也含有磁畴，因为邻近的原子合作使得它们的电子自旋是平行 的。外部》兹场调整邻近区域的磁矩，扩大了磁性效应。通常具有铁》兹 性特性材料的非常小的颗粒不是铁磁性的，因为在300nm或更小的颗 粒中不产生合作效应，使得材料不具有永久的磁性。然而，颗粒对外
部磁场仍然非常敏感并具有强烈的顺磁性特性，称为超顺磁性。优选， 本发明的纳米颗粒是超顺磁性的。
具有包含顺磁性金属核心的纳米颗粒的实例，包括含有Mn+2， Gd+3, Eu+2， Cu+2, V+2， Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe"和锎系元素+3的那些。
可以从能够形成纳米颗粒(磁性流体)的材料如MnFe (尖晶石铁 氧体)或CoFe (钴铁氧体)来形成其他磁性纳米颗粒，添加或不添加 另外的如上所述的核心材料。Biotechnol. Prog. ， 19: 1095-100 (2003 ) ， J. Am. Chem. Soc. 125: 9828-33 ( 2003 ) ， J. Colloid Interface Sci. 255: 293-8 ( 2002 )中给出了用于生产这样纳米颗 粒的自动装配连接化学的实例。
另一方面中，本发明提供了组合物，包含一个或多个以上所定义 颗粒的群。 一些实施方案中，纳米颗粒群可以具有不同密度的相同或 不同的连接于核心的配体。 一些情况中，理想的是将纳米颗粒装入胶 嚢以能够将多个纳米颗粒递送至靶位点。合适的胶嚢化技术是本领域 技术人员公知的。胶嚢化的纳米颗粒群可以是一种，两种，三种或多 种不同的类型。 一实施方案中，本发明提供了在此所定义的纳米颗粒 的气雾剂组合物。气雾剂组合物可以包含纳米颗粒和任选的稀释剂。 以下讨论这些组合物用途的实例。
通过说明而非限制的方式来提供以下纳米颗粒应用的实例以支持 在此所述技术的广泛适用性。Dorseet & Tuschl， Nature Reviews, 3: 318-329， 2004中提供了 siRNA—般用途的综述。
另一方面中，本发明提供了以上定义的纳米颗粒用于治疗或诊断 中的用途。
另一方面中，本发明提供了以上定义的纳米颗粒用于制备药物的 用途，该药物用于治疗通过给予纳米颗粒得到緩解的病症。以下描述 了根据本发明可以治疗的具体用途的实例，与纳米颗粒的其他应用一 起，包括体外和体内的用途。例如，在此所述的纳米颗粒或其衍生物 可以配制于药物组合物中，并以各种形式给药于患者，特别是用于治 疗通过给予RM配体得以緩解的病症。例如，这可以用于治疗通过由RNA下调基因的表达来緩解的病症，其中通过RNA来下调基因，或用 于治疗与通过RNA靶向并下调的基因的超表达相关的病症。
差^4这的源，
包含RNA配体的纳米颗粒可以以多种方式用于调节基因表达，包 括通过小干扰RNA ( s iRNA ) mRNA的定向降解，转录后基因沉默(PTG ), 通过微-RNA (miRNA) mRNA的发育可控型序列特异性翻译抑制和定向 转录基因沉默。
一般而言，本发明提供了在此所述的纳米颗粒用于下调耙基因的 用途。本申请中，下调可以是体外的，例如，来研究基因表达，或者 是体内的，在目标实验系统中或用于医学用途，即纳米颗粒可用于制 备治疗通过RNA下调靶基因的表达来緩解的病症或治疗与靶基因超表 达相关的病症的药物。例如，该病症可以包4舌癌症，例如，乳癌，其 可以使用基于Her2/Neu序列的RNA来治疗。如在此所述的，因为由 RNA提供的下调实际上可能是暂时的，所以， 一些实施方案中，优选 纳米颗粒进一步包含放射性核素，药物或其他药剂，所述药剂用于治 疗或杀灭其中纳米颗粒下调耙基因的细胞。
RM干扰可以用于治疗任何与过于活跃的基因相关的疾病，例如 大多数形式的癌症，例如，使用RNA用于致癌基因抑制。特定基因如
受体的停止运转也是RNA治疗的耙。使用本发明纳米颗粒治疗的合适 病症的另外的实例是眼睛中的黄斑变性，或利用RNA的天然作用作为 通过使病毒的RNA失去能力来对抗致病性病毒的方法，这些病毒特别 包括HIV，丙肝或流感(Check, 2003; Zamore等，2003; Song等， 2003; Matzke & Matzke, 2003)。
途径的T源
特别值得注意的是本发明允许递送多于一种的RNA分子，这以前 在本领域中一直是不可能的事情。因此， 一些实施方案中，本发明提
供了含有至少两种不同RNA序列的纳米颗粒组合物，该RNA序列与相 同的纳米颗粒缀合或存在于至少两种不同类型的纳米颗粒的组合物 中，可以用来下调基因途径中的表达。组合物中存在的RNA配体的数 目将取决于途径的复杂性和需要靶向用于下调的基因数目。可以靶向 的途径的实例，用于研究或治疗，包括引起炎症的途径，抗病毒途径， 癌症中的信号途径，转移途径或代谢途径。例如，这包括对于II型糖 尿病中葡萄糖产生的新糖生成途径的调节。
另一相关的实施方案中，通过设计RNA来靶向家族成员之间保守 的结构域，RNA-纳米颗粒可以用于下调基因家族的表达。
在纳米颗粒用于使用RNA抑制基因表达的任一种用途中，纳米颗 粒还可以包含siRNA序列和mRM沉默序列来耙向mRM。这些纳米颗 粒可以用于抑制siRNA抗性mRNA。这可以用于其中靼细胞对siRNA沉 默是抗性的情况中，因为它们表达阻断siRNA抑制机构的蛋白质。在 这种情况中，可以通过将siRNA对准表达来诱导抗性的基因产物来改 善siRNA抗性。
炎^7^必添谬4'炎^ ww ^乾/^乂^
一种应用中，本发明的纳米颗粒组合物可以用于赋予耙向特性， 用于将RM递送至靼细胞。这可以通过提供具有另外类型的与合纳米 颗粒核心缀合的配体或与RNA配体相连的能够使RNA纳米颗粒与靼细 胞群特异性相互作用的结构域的纳米颗粒来实现。例如，含有RNA的 纳米颗粒可以优先导向细胞群，通过提供具有配体的纳米颗粒，该配 体是能够特异性结合存在于靶细胞表面或内部的结合伴侣的特定结合 对的成员，例如，靶向特定细胞结构如核。适于用作与用于靶向的纳 米颗粒缀合的配体的特定结合对的实例包括配体和受体，且许多备选 物是本领域技术人员显而易见的。例如，葡萄糖衍化的纳米颗粒可以 用于靶向含有蛋白质GLUT家族成员的细胞(18 )。可以使用其他的用 于纳米颗粒的糖配体，如Glc P 4GlcMc或Glc |3 4GlcNH2。前者可以用 于首先将含有siRNA的纳米颗粒耙向细胞表面的GLUT转运蛋白，然后
在进入细胞时(在葡糖苷酶剪切后)，GlcNAc将会进一步将siRNA纳 米颗粒靶向核。后一构建体将正电荷添加至纳米颗粒的表面，进一步 促进粘附并吸收至细胞中。由于自动装配的纳米颗粒可以用于掺入异 源配体如脂质，肽或任何其他化学成分(例如，如上配体讨论中所述 的)，其通过间隔物与二硫化物连接，多种其他耙向分子可以用于将 RM纳米颗粒靶向特定的细胞类型。例如，这些技术可以用于将携带 RNA的纳米颗粒靶向肿瘤细胞。
纳米颗粒用于靶向细胞类型用途的另一实例中，纳米颗粒的RNA 配体可以用作提供纳米颗粒耙向的实体，将纳米颗粒导向其中与RNA 配体相互作用的mRNA得以表达的细胞。可以以这种方式靶向的靼细胞 类型的实例是肿瘤细胞或病毒感染的细胞，使用RM来靼向耙细胞中 病毒基因或肿瘤标记或致癌基因的表达。该实施方案中，优选RM-纳 米颗粒能够透过细胞膜，这是由它们的小尺寸提供的并可以任选地通 过用膜转位信号衍化纳米颗粒来增强的一种效果(参见Nature Biotechnology 18: 410-414， 2000 ) 。 RNA-纳米颗粒对其中表达相 应mRNA的细胞的靶向具有以细胞选择性方式下调耙mRNA的优势。然 而，因为这种作用通常是暂时的，所以优选提供具有放射性核素或药 物的纳米颗粒，使得使用RM靼向的细胞被选择性杀灭。可以将耙细 胞和处理过程成象，接着标记纳米颗粒，例如如上所述的使用放射性 或磁性的纳米颗粒。
另一方面中，本发明提供了 mRM检测和/或成象的方法，其使用 了在此所述的纳米颗粒。特别地，在本发明之前，现有技术中不存在 已知的使mRNA成象方法。该方法可以包括在其中存在于纳米颗粒上的 RNA配体与乾mRM相互作用的条件下使体内或样品中的RNA接触纳米 颗粒，并检测纳米颗粒-RNA-mRNA复合物。检测复合物的步骤可以使 用纳米颗粒的固有特性或通过检测与纳米颗粒相连的标记。适用于本 发明这方面中的标记的优选实例包括含有磁性基团、量子点或放射性
核素的纳米颗粒。量子点，例如，通过硒化镉的纳米晶体提供的，或 除了硒化物以外还可以使用其他阴离子如硫化物，其在生物成象、电 子和光学设备、量子计算机和候选药物的筛选中具有潜在的用途。
WW-韵^覆在^^^然差西遂W工^
基因组筛选通常利用随机产生的RNA序列，然后将其转染至测试 细胞中并监控蛋白质表达的变化。本发明的纳米颗粒具有两个优于这 些现有技术的基因组筛选方法的显著优势。首先是许多随机siRNA序 列实际上没有效果，但是目前测试细胞需要单个筛选，增加了这种形 式的这些实验的人工和成本。本发明允许作为纳米颗粒上的配体包括 多个siRNA序列，从而提供了加快篩选速率的可能。因此，如果在细 胞中观察到效果，则可以筛选珠粒上存在的RM分子来确定是由哪个 序列引起这种效果的。此外，因为纳米颗粒提供了用于RNA的递送系 统，所以可以避免现有技术中需要的转染试剂的使用。这是所需要的 优势，因为转染试剂自身可以导致测试细胞中蛋白质表达的改变。因 此，另一方面中，本发明的纳米颗粒可以用作功能基因组的工具，例 如如Nature Reviews,第3巻，2004年4月，318-329页中所述的。 纳米颗粒可以具有每个颗粒多于两个，多于5个，多于10个或多于 20个或多于IOO个的RNA序列来研究体内的基因功能并且作为用于全 基因组范围的篩选的工具。
气雾浙遽送
另 一方面中，本发明提供了在此所述的纳米颗粒在气雾剂中的用 途。这是因纳米颗粒的小尺寸而成为可能的。气雾剂组合物可以用于 递送RNA配体，特别是递送至肺，用于成象和/或治疗用途，例如，在 治疗感染肺的病症中。
上述任一方面中，纳米颗粒可以与治疗活性物质连接，如抗体或 胂瘤杀伤药物。纳米颗粒的磁性特性还可以用于靶向肿瘤，通过使用 磁场来引导纳米颗粒至肿瘤细胞。然而，单独使用磁场来将纳米颗粒 导向肿瘤细胞不总是可行的或准确的，因此本发明提供了 一种优势， 使纳米颗粒通过肿瘤特异性配体能够特异性地导向肿瘤细胞。这将允 许使用较少的药物并降低副作用的可能性，因为药物只针对需要它的 细胞而不针对健康的细胞。
本发明纳米颗粒的另 一优势是它们特别小的尺寸，这使得它们更 适宜被细胞吸收，甚至当与耙向或治疗分子连接时。
另一方面中，其中配体是抗原的纳米颗粒可以作为疫苗给药，例 如，通过弹道，使用递送枪来加速它们通过表皮外层的经皮穿透。然 后纳米颗粒可例如通过树突细胞来吸收，随着它们通过淋巴系统的迁 移而成熟，导致免疫应答的调节和对抗抗原的疫苗接种。
本发明的纳米颗粒可以配制成固体或液体组合物形式的药物组合 物。这样的组合物通常包含某种载体，例如固体载体如明胶或助剂或 惰性稀释剂，或液体载体如水，石油，动物或植物油，矿物油或合成 油。可以包括生理盐水溶液，或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
这样的组合物和制剂通常含有至少0. lwt。/。的化合物。
可以通过许多不同途径将纳米颗粒組合物给药于患者。非肠道给 药包括通过以下途径的给药静脉内，皮肤的或皮下的，鼻的，肌内， 眼内，经上皮，腹膜内和局部(包括皮肤，眼，直肠，鼻，吸入和气 雾剂)，和直肠全身途径。对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛 部位的注射，活性成分将是非肠道可接受的水溶液形式，其是无热原 的并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域有关技术人员完全能够 制备合适的溶液，使用例如化合物或其衍生物的溶液，例如，在生理 盐水中的溶液，用甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散体。
除了一种或多种化合物以外，任选地结合其他活性成分，组合物 还可以包含一种或多种药物学上可接受的赋形剂，载体，緩冲剂，稳 定剂，等渗剂，防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员公知的其他物质。 这样的物质应当是无毒的并应当不干扰活性成分的功效。载体或其他 物质的确切性质可以取决于给药途径，例如，口服或非肠道。
通常配制液体药物组合物使其具有约3. 0至9. 0，更优选约4. 5
至8. 5，再更优选约5. 0至8. 0的pH。可以通过使用緩冲剂如醋酸盐， 柠檬酸盐，磷酸盐，琥珀酸盐，Tris或组氨酸来维持组合物的pH,通 常的使用范围为约lmM至50raM。另外可以通过使用生理学上可接受的 酸或碱来调节组合物的pH。
药物组合物中通常包括防腐剂来阻止微生物生长，延长组合物的 保存期并允许多重用途包装。防腐剂的实例包括苯酚，间-甲酚，爷醇， 对-幾基苯曱酸及其酯，对羟基苯曱酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，苯扎 氯铵，氯化节乙氧铵。防腐剂通常的使用范围为约0. 1至1. 0%U/V)。 优选，以预防有效量或治疗有效量(视具体的情况而定，尽管预 防可以视是治疗)将药物组合物给予个体，这足以显示出对个体的益 处。通常，这将导致给个体提供益处的治疗上有用的活性。所给予的 化合物的实际量，给药速率和时间进程，将取决于待治疗病症的性质 和严重程度。治疗的处方，例如，对剂量等的决定，是全科医生和其 他内科医生职责内的，且通常考虑待治疗的疾病，个体患者的状况， 递送部位，给药方法和医师已知的其他因素。上述技术和实验方案的 实例可以在Handbook of Pharmaceutical Additives (药物添力口剂手 册)，第2版(编辑M. Ash和I. Ash) , 2001， ( Synapse Information Resources, Inc. ， Endicott，纽约，USA )， Remington's Pharmaceutical Science (雷明顿药物科学)，第18版，Mack Publishing Company, Easton， Pa. ， 1990'， 和 Hankbook of Pharmaceutical Excipients (药物赋形剂手册)，第2版，1994中找到。例如，优选以每kg体 重约0. 01至lOOmg活性化合物，且更优选约0. 5至10mg/kg体重的剂 量将组合物给药于患者。
现在参照附图举例而非限制地来描述本发明的实施方案。


图l显示了 RM-Au-Glc纳米颗粒的透射电子显微照片。
图2显示了测试制得的纳米颗粒中RNA的存在。(a)无UV光
1. RNA-Au-Glc纳米颗粒+EtBr; 2. Glc-Au+EtBr; 3. Glc-Au; 4.洗 涤溶液的残余物+EtBr。 (b)用UV光1. RNA-Au-Glc纳米颗粒+EtBr;
2. Glc-Au+EtBr; 3. Glc-Au; 4.洗涤溶液的残余物+EtBr。
图3a显示了 Her-2/neu siRNA转染后48小时来自等体积的SKBR3 细胞裂解物的Her-2/neu蛋白的蛋白质印迹。C-对照(未处理)细胞； Au-用结合到金纳米颗粒上的siRNA处理的细月包，无RNAiFectamine; S-具有RNAiFectamine的沉默siRNA; NS-具有RNAiFectamine的非沉 默siRNA。
图3b显示了 Her-2/neu siRNA转染后72小时来自等体积的SKBR3 细胞裂解物的Her-2/neu蛋白的蛋白质印迹。C-对照(未处理)细胞； Au-用结合到金纳米颗粒上的siRM处理的细胞，无RNAiFectamine。
图4显示了本发明的包含siRNA和碳水化合物配体的优选纳米颗 粒的图示。
图5显示了对用siRNA单独(A)或用每1000个细胞0. 25/ag(菱 形)，0.5pg(正方形)，l.Opg(三角形)，1.5jag(灰色叉)和 2. Oiag(黑色叉)siRNA-纳米颗粒的siRNA-纳米颗粒(B)转染的OVCAR 细胞的细胞增殖的效果。X轴-天数；Y轴=细胞数(log1Q)。
图6显示了对用siRNA-纳米颗粒转染的OVCAR细胞的细胞增殖的 效果，用和不用转染试剂。使用了三种浓度的纳米颗粒
1. 使用转染试剂(正方形)和不使用转染试剂(菱形)；
2. 使用转染试剂(灰色叉)和不使用转染试剂(三角形)；
3. 使用转染试剂(圆)和不使用转染试剂(黑色叉)； X轴-天数；Y轴-细胞数(log1())。
具体实施例方式
Her-2/neu致癌基因及其编码的产物pl85Her-2/neu属于上皮生 长因子受体酪氨酸激酶(Bargmann等，1986 )。 HER受体家族由四种 跨膜酪氨酸激酶EGFR (也称为Her-1或erbB-l ) ， erbB-2 ( Her-2 ), erbB—3 ( Her-3 )和erbB-4 ( Her-4 )组成。已知Her-2/neu信号途径
在细胞生长和分化、恶性转化和对化疗剂的抗性中起关键作用(Yarden & Sliwkowski, 2001 )。在约三分之一的人乳癌或卵巢癌病例中， Her-2/neu是超表达的，而其超表达与差的预后相关(Berchuck等， 1990)。
已经作出许多尝试来抑制癌细胞中的Her-2/neu表达作为潜在的 治疗方法。针对Her-2/neu的人源化单克隆抗体(曲妥单抗或赫赛汀) 在Her-2/廳-超表达转移性癌症中是有效的(Mendelsohn & Baselga， 2000; Baselga等，1996 )但发现上调Her-3的表达。已经表明针对 Her-2/neu的反义寡核苷酸诱导超表达Her-2/neu的人乳癌细胞系的 凋亡(Roh等，2000 )。使用E1A的基因治疗，通过脂质体或通过腺 病毒载体递送，可以降低Her-2/neu-超表达卵巢癌模型中带有肿瘤小 鼠的死亡率并可以降低乳癌模型中远距离转移的发生率(Chang等， 1996 )。
发现Her-2/neu表达的下调导致PI3K，Akt和磷酸化Akt的减少， 其导致细胞周期蛋白Dl降低的表达，细胞周期蛋白Dl是一种参与 G0/G1细胞败育和致癌基因转化的调节的(细胞周期蛋白Sherr & Robert, 1999 )。比较反义寡核苷酸和siRNA功效的最新研究证明了 在nM基础上siRNA对使受体基因沉默至少10倍更有效(Miyagishi 等，2003 )。以前的几项研究已经证明Her-2/neu促进VEGF的转录， VEGF是有效的促血管生成因子(Kumar & Yarmand-Bagheri， 2001 )， 在Her-2/neu表达沉默后其水平显著降低。逆转录s iRM对Her-2/neu 的下调提高了血小板反应蛋白-l的水平，血小板反应蛋白-1是有力的 血管生成抑制剂(Izuini等，2002 )。体外数据证明了 HER2 s iRNA治 疗还显著上调人肿瘤中的HLA I类表面表达(Choudhury等，2004 )。
a.衷略z沉,教'
Her2/Neu cDNA耙序列:AAG CCT CAC AGA GAT CTT GAA a)有义5， -G CCU CAC AGA GAU CUU GAAdTdT-3，
b) 反义3， -dTdTC GGA GUG UCU CUA GAA CUU-5，
c) 有义5， -G CCU CAC AGA GAU CUU GAAdTdT-3， SS
d) 反义3， SS-dTdTC GGA GUG UCU CUA GAA CUU-5'
6.逸义
沉默5，3，
3，(b)5，
5，")3，
3，SS(d)5，
5,(c)3，SS
3，(b)5，
5,")3，SS
3，SS5,
c. ^"然的6W户遂合
siRNA退火GNPGlc-Glc P 4GlcMcGlc P 4GlcNH2
沉默a-b
a-d
c-bX10
c-d
x-该研究中所用的。
&才法
人勿^系
来自ATCC的SK-BR-3人乳腺癌(目录号HTB-30 )。来自NCI-Frederick癌症DCTD胂瘤/细胞系P&物器(小瓶0502296 )的 OVCAR-3人腹水腺癌。
么s/^^^^务溶濕
选择的Her-2/neu DNA耙序列是AAGCCTCACAGAGATCTTGAA。 有义siRM具有序列r ( GCCUCACAGAGAUCUUGAA ) d ( TT ) 3ThSS (K-盐的MW 7416. 25 ),反义序列r ( UUCAAGAUCUCUGUGAGGC ) d ( TT )
3ThSS (K-盐的MW 7409. 57 )是从Qiagen获得的。
对照(非沉默)siRNA双链序列(目录号1022076 )来自Qiagen，
其中有义序列为r (UUC UCC GAA CGU GUC ACG U) d ( TT )和反义序
列为r (ACG UGA CAC GUU CGG AGA A ) d ( TT )，退火的K-盐的MW
为14839.5。
将一个有义siRNA管的内含物(296. 65 yg)溶解于1ml无菌緩冲 液(100mM醋酸钾，30raM Hepes-KOH， 2mM醋酸镁，pH7. 4)中来形成 40juM储液。每jnl含有0.297 jug siRNA。
将一个反义siRM管的内含物(296. 38 ja g )溶解于1ml无菌緩沖 液(100raM醋酸钾，30mM Hepes-KOH, 2mM醋酸镁，pH7. 4 )中来形成 40juM储液。每yl含有0.296 jug siRNA。
为了退火，将各自3ja 1的RM寡聚物溶液与15|a 1的5X退火緩 冲液合并。最终緩冲液的浓度为DEPC-处理的水中50mM Tris， pH7.5-8.0, lOOmM NaCl。终体积为75jul， s iRNA双链体的终浓度为 16 jaM。
将溶液在90-95"C的水浴中温育1分钟，并使其冷却至室温(即， 低于30°C )。将管子短暂离心来收集管子底部的所有液体。緩慢冷却 至室温需要45-60分钟。所得到的溶液储存在-20'C备用且耐受反复的 冻融。
J. "i W韵^金储务溶濕 一般方法
从Aldrich化学公司购买HAuCl4 ( 99. 999%)和NaBH"在cur实 验室中使用标准方法来合成2-硫代乙基-|3-D-吡喃型葡糖苷。对于所 有的实验和溶液，使用用DEPC (焦碳酸二乙酯)处理过的纳米纯水 U8.1mQ)。所有微量离心管，刮勺和小瓶都是无RNA酶的。
从Qiagen-Xeragon Inc购买退火的双链siRNA。规格是
DNA耙序列AAGCCTCACAGAGATCTTGAA。
有义siRNA r ( GCCUCACAGAGACUUGAA ) d ( TT ) 3，上的3， -巯 基-(SS) -C3-连接物
(K一盐的MW 7416.25 ) 反义s iRNA r ( UUCAAGAUCUCUGUGAGGC ) d ( TT )
(K-盐的MW 7409. 57 )
e. ) ^"^〃-67￡7韵^^"在^賴备
向lOOmM， pH7. 7的TRIS緩沖液(250 uL)中的2-硫代乙基-p -D-吡喃型葡糖苷(0. 9mg， 3. 75 iamol )和si腿(0. 148mg, 0. 01 y mol)溶液中，加入HAuCl4水溶液(22 juL， 0. 025M)。然后，将IN NaBH4 水溶液(30jaL)分几份加入，并快速振荡。将所形成的棕色悬浮液在 4。C另外振荡1小时。通过离心过滤(AMICON MW 10000， 30分钟，4 'C， 14000rpm)来纯化悬浮液。将该过程重复两次，用125yLTRIS 緩冲液洗涤。将AMI CON滤器中的残余物溶解于2 5 0 p L的TRIS緩沖液 中并冻干，获得4mg的RNA-Au-Glc纳米颗粒(固体在1mL水中的重悬 浮应当获得RM在20mMTRIS緩沖液中的6±1 jaM溶液)。使用AMICON (MW 3000， 4'C， 14000rpm)将滤液脱盐并冻干。残余物的重量〈50 jLig。图1中所示的透射电子显微照片(TEM)显示颗粒的平均粒度为 2. 8nm,平均807个金原子/颗粒，siRNA和100个分子的葡萄糖衍生 物如图4中所示并具有近似的MW>160， 000。
尸.检查辨末;^在哞WW的存^
将RM-Au-Glc纳米颗粒、Glu-Au纳米颗粒和洗涤可能含有RNA
寡核苷酸和葡萄糖衍生物的RNA-Au-Glc纳米颗粒的残余物各自溶解 于30jnL水中。将这些溶液的等份试样(1 uL)与溴化乙锭(EtBr) 的水溶液(ljaL， 0.1。/。v/v)混合。在UV灯下观察焚光(参见图2)， 证明了这样制备的纳米颗粒具有掺入的siRNA (图2b，管1)，而只 含有葡萄糖的納米颗粒没有显示出任何荧光(图2b，管2)。
将4mg从148 m g siRNA产生的siRNA/纳米金复合物溶解于lml 水中来获得20mM tris中的6± 1 juM储液。每ja 1溶液含有0. 078 ju g siRNA的等价物。
细胞平板培养
1. 在转染前24小时，将6x 104个细胞吸移至24孔平板中并用 合适的培养基将体积补足至0. 5ml。
2. 使细胞达到50-80%汇合，大概需要24小时。
3. 除去培养基并由300 ju 1新鲜培养基/孔替代。
用siRNA复合物转染细胞
1. 将3. 1合适的双链siRNA储液(或12. 8 jn 1纳米金复合物) 分配至对应含有细胞的24孔平板中。
2. 向每个孔中，加入96. 7 ia 1合适的培养基(或对于纳米金复合 物87. 2 ia 1 )并通过上下吸移5次来充分混合。
3. 向每个孔中(除了纳米金复合物孔以外)，加入6m 1RNAiFect 并通过上下吸移5次来充分混合。
4. 将溶液在室温下温育10-15分钟使复合物形成。
5. 用lOOp l合适的转染复合物覆盖于300 n l培养基中的细胞上。
6. 将平板轻微摇动来混合以避免涡旋。
7. 将平板在0)2培养箱中于37。C下温育48-72小时。
8. 除去培养基并用冰冷PBS将细胞洗涤三次。
9. 将细胞裂解，并测定裂解物的蛋白质含量。
10. 通过SDS-PAGE分离蛋白质，接着使用Cell SignallingTechnology的Her2/ErbB2多克隆兔抗体(目录号2242 )来进行蛋白 质印迹分析。
11.用抗兔IgG-HRP缀合物处理印迹，接着ECL显色。 &潜^
图3a和3b中显示了使用lMg siRM/孔的初步观测结果。将 siRNA-金纳米颗粒加入细胞中，没用RNAiFectamine。 SKBR3细胞达到 80%汇合比0VCAR细胞慢。SKBR3结果来自转染后48小时的裂解物而 OVCAR结果来自转染后72小时的裂解物。纳米颗粒的示意图显示于图 4中。
Wi W-JZ7-67c勿^^^在对勿^无毒^
单独用siRNA和用与金糖纳米颗粒缀合的siRNA来转染细胞。图 5显示了纳米颗粒缀合的siRNA是有效的且无毒性作用。观察到对细 胞数的剂量依赖性作用，表明siRNA纳米颗粒提高了细胞增殖。
57扁-j"-67c韵^^"在遽入勿启
用siRNA-纳米颗粒转染0VCAR细胞，用或不用通常用siRM转染 细胞所需要的转染试剂。图6显示了对于siRNA-纳米颗粒进入细胞不 需要转染试剂。结果表明siRNA纳米颗粒有效地递送至细胞中，甚至 在转染试剂不存在的情况下；实际上，没用转染试剂的递送看来更有 效。对细胞数的剂量依赖性作用表明了对siRNA-纳米颗粒的真正响 应。
参考文献
在此提及的参考文献全部特意引入作为参考。
Pal-Bhadra等，RNAi-Mediated targeting of Heterochromatin by the RITS complex (通过RITS复合物的RMi-介导的异染色质革巴
向).Science (2004) vol. 303， 669。
Verdel等，Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosphila are dependent on the RNAi Machinery (果绳中异染 色质沉默和HP1定位依赖于RNAi机构).Science (2004) vol. 303， 672。
Elbashir等，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells ( 21个核脊酸的RNA的 双链体介导培养的哺乳动物细胞中的RNA干扰).Nature 2001; 411: 494-8。
Tuschl， RNA interference and small interfering RNAs (RNA 干扰和小干扰RNA) .Chem Biochem 2001; 2:239-45。
Bargmann等，The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein ( neu致癌基因编码表皮生长因子 受体相关蛋白).(1986 ) Nature 319, 226-230。
Yarden & Sliwkowski， Untangling the ErbB signalling network (解开ErbB信号网).(2001 ) Nat Rev Mol Cell Biol 2， 127-137。
Berchuck等,Overexpression of HER_2/neu is associated with poor survival in advanced epithelial ovarian cancer (HER-2/neu 的超表达与晚期卵巢上皮癌差的存活相关).(1990 ) Cancer Res 50， 4087-4091。
Mendelsohn & Baselga， The EGF receptor family as targets for cancer therapy (作为癌症治疗耙的EGF受体家族).(2000 ) Oncogene 19， 6550-6565。
Baselga等,Phase II study of weekly intravenous recombinant humanized anti-pl85HER2 monoclonal antibody in patients with HER2/neu over expressing metastatic breast cancer (具有超表 达转移性乳癌的HER2/neu患者中每周静脉内重组人源化抗pl85HER2 单克隆抗体的II期研究) J Clin Oncol 1996; 14: 737-44。
Roh 等，Down regulation of HER2/neu expression induces
apoptosis in human cancer cells that over-express HER2/neu (HER2/neu表达的下调诱导超表达ER2/neu的人癌细胞凋亡).(2000 ) Cancer Res 60， 560-565。
Chang 等 ， Inhibition of intratracheal lung cancer development by systemic delivery of EIA (通过全身递送EIA来 抑制气管内肺癌发展)(1996 ) Oncogene 13， 1405-1412。
Sherr & Roberts, CDK inhibitors: positive and negative regulators of Gl—phase progression (CDK4中制剂Gl—期i^l的正 和负调节物).(1999 ) Genes Dev 13, 1501—1512。
Miyagishi 等,Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRMs directed against the same targets in mammalian cells (反义寡核芬酸和针对哺乳动物细胞中 相同把的siRNA的抑制效果的比较).Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2003; 13: 1-7。
Kumar & Yarmand-Bagheri， The role of HER2 in angiogenesis (HER2在血管生成中的作用).(2001 )Semin Oncol 28， 27-32。
Izumi 等 ， Tumour biology: herceptin acts as an antiangiogenic cocktail (肿瘤生物学赫赛汀作为抗血管生成的混 合物).(2002 ) Nature 416， 279-280。
Choudhury等，Small interfering RNA (siRNA) inhibits the expression of the Her2/Neu gene, upregulates HLA Class I and induces apoptosis of Her2/Neu positive tumour cell lines (小 千扰RNA (siRNA)抑制Her2/Neu基因的表达，上调I类HLA并诱导 Her2/Neu阳性肿瘤细月包系的凋亡).Int J Cancer 108,71-77， 2004。
Overbaugh， HTLV sweet-talks its way into cells ( HTLV巧妙 地进入细胞中).Nat. Med ( 2004 ) vol. 10， 20。
Check, RNA to the rescue (用于扭^L的RNA) .Nature ( 2003 ) vol 425，10-12。
Zamore 等，siRNAs knock down hepatitis ( siRNA 抑制肝
炎).Nature ( 2003 ) vol 9， 266-267。
Song等，RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis (靶向Fas的RNA干扰4吏小鼠免于暴发性肝 炎).Nat. Med. (2003) vol. 9， 347-351。
Matzke & Matzke， RNAi Extends its Reach (RNAi扩展其作用 区).Science (2003) Vol 301， 1060-1061。
WO 02/32404，享有GB-A-0313259. 4优先权的PCT申请。
权利要求
1.含有核心的纳米颗粒，该核心包括金属和/或半导体原子，其中核心与多个配体共价连接且配体包括RNA配体。
2. 权利要求1的纳米颗粒，其中RM配体是siRNA或miRNA配体。
3. 权利要求1或权利要求2的纳米颗粒，其中纳米颗粒进一步包 括含有碳水化合物基团的配体。
4. 权利要求1至3任一项的纳米颗粒，其中纳米颗粒与siRNA 分子通连接基团共价连接。
5. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中连接基团是巯基基团， 亚乙基基团或肽基团。
6. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中RNA配体为17至30 个核糖核苷酸长。
7. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体是siRNA配体并包 括2个核糖核苷酸的3，突出端。
8. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中RM分子的第一有义或 反义链通过其5'和/或3'端与纳米颗粒核心共价连接。
9. 权利要求8的纳米颗粒，其中将与第一链互补的RNA分子的第 二链与RNA分子的第一链退火。
10. 权利要求9的纳米颗粒，其中第二 RNA链通过其5，和/或3， 端与纳米颗粒核心共价连接。
11. 权利要求9或权利要求10的纳米颗粒，其中RNA分子的第一 和第二链分别与纳米颗粒核心连接并随后 一起退火。
12. 权利要求1至6任一项的纳米颗粒，其中RM配体是miRNA 配体并包括发夹。
13. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中RNA配体基于Her2 基因序列。
14. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒包括标记。
15. 权利要求14的纳米颗粒，其中标记是荧光基团，放射性核素，磁性标记，染料，NMR活性原子，或能够使用表面等离振子共振检测 的原子。
16. 权利要求15的纳米颗粒，其中荧光基团是荧光素，若丹明或 四甲基若丹明，Texas-红，Cy3或Cy5。
17. 权利要求15的纳米颗粒，其中放射性核素是""Tc， 32P， 33P, "Co， 59Fe3+, 67Cu2+, 67Ga3+， 6SGe, 82Sr, "Mo， 103Pd， mIn3+， 125I， 131I, 137Cs， 153Gd， 153Sm， 158Au， ，86Re， ,1+， 39Y3+， 71Lu3、X "Cr2+。
18. 权利要求15的纳米颗粒，其中磁性标记是包括Mn+2， Gd+3， Eu+2， Cu+2， V+2， Co+2， Ni+2， Fe+2， Fe"或镧系元素+3的顺磁基团。
19. 权利要求15的纳米颗粒，其中NMR活性原子是1^+2， Gd+3， Eif2， Cu+2， V+2， Co+2， Ni+2, Fe+2， Fe"或锎系元素+3的顺磁基团。
20. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒是水溶性的。
21. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒的核心具有 0. 5至10nm的平均直径。
22. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒的核心具有 1至5nm的平均直径。
23. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中包括其配体的纳米颗 粒具有10至30nm的平均直径。
24. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中核心是金属核心。
25. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中金属核心包括Au， Ag 或Cu。
26. 权利要求24或权利要求25的纳米颗粒，其中金属核心是选 自Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu， Au/Pt， Au/Pd, Au/Ag/Cu/Pd， Au/Fe， Au/Cu， Au/Gd， Au/Fe/Cu， Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd的合金。
27. 权利要求24至26任一项的纳米颗粒，其中纳米颗粒的核心 是磁性的。
28. 权利要求26的纳米颗粒，其中纳米颗粒在核心中包括约5: 0. 1 至约2: 5比例的钝态金属原子和磁性金属原子。
29. 权利要求28的纳米颗粒，其中钝态金属是金、铂、银或铜， 而磁性金属是铁或钴。
30. 权利要求27的纳米颗粒，其中核心包括MnFe (尖晶石铁氧 体)或CoFe (钴铁氧体)。
31. 权利要求1至23任一项的纳米颗粒，其中核心包括半导体原子。
32. 权利要求31的纳米颗粒，其中半导体原子能够作为量子点。
33. 权利要求31或权利要求32的纳米颗粒，其中半导体是硒化 镉、At化镉、碲化镉或硫化锌。
34. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒包括多个不 同类型的配体。
35. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体进一步包括肽、 蛋白质结构域、核酸节段或碳水化合物基团。
36. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体包括多糖、寡糖 或单糖基团。
37. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体是糖纳米缀合物。
38. 权利要求37的纳米颗粒，其中糖纳米缀合物包括糖脂或糖蛋白。
39. 之前任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体包括DNA或RNA。
40. 包括一个或多个之前任一项权利要求的纳米颗粒群的组合物。
41. 制备权利要求1至39任一项的纳米颗粒的方法，其是通过将 RNA缀合至纳米颗粒的核心，该方法包括用连接物衍化RNA的第一和/或第二链来产生用5'和/或3'端连接 物衍化的第一和/或第二RNA链；和将连接物衍化的RM与反应物反应用于产生纳米颗粒的核心，使 得在纳米颗粒自动装配的过程中，纳米颗粒核心通过连接物连接至 腿。
42. 权利要求41的方法，其中连接物是巯基连接物，亚乙基连接 物或肽连接物。
43. 权利要求41或权利要求42的方法，其中反应混合物包括衍 化的siRM，金属和/或半导体原子的盐和还原剂来产生纳米颗粒。
44. 通过权利要求41至43任一项的方法可获得的纳米颗粒。
45. 权利要求1至40任一项的纳米颗粒用于治疗或诊断的用途。
46. 权利要求1至40任一项的纳米颗粒用于制备治疗通过下调基 因表达可緩解的病症或与基因超表达相关病症的药物的用途，其中通 过RNA配体来耙向并下调基因。
47. 权利要求1至40任一项的纳米颗粒用于制备治疗癌症、病毒 感染或眼睛黄斑变性的药物的用途。
48. 权利要求46或权利要求47的用途，其中癌症是乳癌或病毒 是HIV、肝炎或流感。
49. 权利要求46至48任一项的用途，其中RNA基于Her2/Neu 基因序列。
50. 权利要求46至49任一项的用途，其中纳米颗粒包括与纳米 颗粒核心缀合的另外的配体或与RNA分子相关的结构域，其中另外的 配体或结构域能够特异性地与表达靶基因的细胞相互作用。
51. 权利要求50的用途，其中另外的配体或结构域是存在于靶细 胞表面上或内部的能够特异性结合其结合伴侣的特异性结合对的成口贝。
52. 权利要求46至51任一项的用途，其中RNA分子将纳米颗粒 靶向表达能够与RNA分子相互作用的mRNA的细胞。
53. 权利要求46至52任一项的用途，其中纳米颗粒进一步包括 放射性核素、药物或用于治疗或杀灭由RM分子靶向的细胞的其他药 剂。
54. 权利要求46至53任一项的用途，其中纳米颗粒包括膜转位 信号，使得它们能够透过细胞膜。
55. 下调靶基因的使用方法，该方法包括使含有基因的细胞接触 权利要求1至40任一项的纳米颗粒。
56. 权利要求55的方法，其中该方法在体外进行。
57. 权利要求55或权利要求56的方法，其中该方法引起靶基因 的瞬时剔除。
58. 权利要求55至57任一项的方法，其中该方法使用具有至少 两种不同RM配体的纳米颗粒，所述配体缀合至相同的纳米颗粒或存 在于至少两种不同类型的纳米颗粒的组合物中，来下调途径中至少两 种基因的表达。
59. 权利要求58的方法，其中途径是炎症途径，抗病毒途径，癌 症中的信号途径，转移途径或代谢途径。
60. 权利要求55至59任一项的方法，其中RNA配体基于基因家 族的保守结构域来下调基因家族多个成员的表达。
61. 权利要求1至40任一项的纳米颗粒用于RNA检测或成象的用途。
62. 使用权利要求1至40任一项的纳米颗粒的mRNA检测和/或成 象方法，该方法包括在其中存在于纳米颗粒上的RNA能够与靶mRNA 相互作用的条件下，使纳米颗粒接触含有靼mRNA的样品/细胞，并检 测纳米颗粒-RM-mRNA复合物。
63. 权利要求62的方法，其中检测复合物的步骤使用纳米颗粒的 内在性质或通过检测与纳米颗粒相连的标记。
64. 权利要求63的方法，其中标记是磁性基团、量子点或放射性 核素。
65. 斥又利要求61至64任一项的方法，其中该方法在含有mRNA 的样品上体外进行。
66. 权利要求61至65任一项的方法，其中在体内进行该方法用 于检测细月包内的mRNA。
67. 权利要求1至40任一项的纳米颗粒用于将RNA分子递送至靶 细胞的用途。
68. 权利要求67的用途，其中该用途是用于制备将RNA分子递送 至受疾病或病症影响的耙细胞的药物。
69. 权利要求1至40任一项的纳米颗粒用作功能基因组学工具的 用途。
70.含有权利要求1至40任一项的纳米颗粒的气雾剂组合物用于 制备递送至肺的药物的用途，其中纳米颗粒包括用于成象的标记或用 于治疗影响哺乳动物肺的疾病。
全文摘要
提供了制备具有核心的纳米颗粒的材料和方法，核心包括金属和/或半导体原子，该核心与多个包含RNA配体的配体共价连接。RNA配体可包括siRNA或miRNA。还提供了这些纳米颗粒在治疗和诊断中的用途。
文档编号C12N15/11GK101180400SQ200580024037
公开日2008年5月14日 申请日期2005年5月24日 优先权日2004年5月24日
发明者A·G·巴雷特斯, K·古玛, M·马丁-洛马斯, R·欧杰达, S·佩纳德斯, T·W·拉德迈克 申请人:Mida科技有限公司