专利名称：猪瘟病毒荧光定量rt－pcr诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明所涉及的猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及其生产方法，属兽用生物制品领域。
本发明的技术背景猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus，CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，其特征是小血管壁的变性、导致内脏器官中的多发性出血、坏死和梗死。目前CSF遍布全世界，根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》(2004)中，CSF被列为必须报告的法定传染病之一，在我国属于四大动物疫病之一，经济损失严重。目前临床上CSF在流行特点、临床表现和病理变化等方面表现出非典型性的特征，因此对其诊断带来困难，必须依赖实验室诊断才能确诊。由于CSFV在细胞内繁殖滴度较低，并且不产生肉眼可见的病变，对该病原的进一步研究尤其是诊断技术的研究带来了难度，致使目前CSF的诊断技术研究依然存在许多问题，各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、非特异性反应较严重等诸多问题。
目前常见的CSF病原诊断技术分传统诊断方法和诊断新技术，传统诊断方法主要有猪瘟免疫荧光技术(HCFA)、琼脂糖扩散法、兔体交互免疫试验和实验动物法等；诊断新技术有RT-PCR技术和ELISA抗原捕获法等等。免疫荧光技术又可分为直接免疫荧光和间接免疫荧光，应用荧光标记的一抗或二抗对组织切片进行染色观察，以检测是否有CSFV感染。免疫荧光法是目前检测CSF病原的法定方法，但该法需要较昂贵的显微镜和有经验的试验人员，HCFA技术经验性较强，在制片特别是组织切片过程中难度大，耗时长；组织抹片的制作也可能由于选定的样品为非病灶区而漏检；细胞飞片受多种因素影响如细胞状况好坏、花费时间长，且采用细胞HCFA技术通常会在边缘部分出现非特异性荧光而造成错检。琼脂糖扩散试验该法虽操作简单，但敏感性低。实验动物法用敏感仔猪进行接种试验或用兔体交互免疫试验进行病原的鉴定，此法可用来鉴别疫苗毒和野毒感染，但该法需在有条件的实验室进行，而且费时。ELISA抗原捕获法利用双抗夹心法或竞争法捕获CSFV于酶标板上，然后利用辣根过氧化物酶标记的二抗进行显色，根据吸光值的高低来判断有无CSFV，目前这种试剂盒主要靠进口，价格昂贵，而且敏感度较低，不利于普及。RT-PCR技术随着分子生物学的发展，越来越多的学者应用RT-PCR和nested-PCR对CSFV进行了成功扩增。虽然该法具有操作简便，快速，特异性强等优点，但在病毒含量较低或在RNA提取过程中造成RNA降解等情况下，会出现假阴性结果；此外需要经过反转录、二次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，耗时太长而不利于实验室快速检测。
由于上述各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、非特异性反应较严重等诸多问题。因此开发猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断技术对于猪瘟病原的定量检测具有十分重要的意义。
本发明的目的是将荧光定量PCR技术与ABI定量检测系统相结合，建立CSFV实时荧光RT-PCR快速检测技术，从而制备用于CSFV快速检测的试剂盒。
本发明的主要技术原理实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测。
实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术包括探针类和染料类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqManTM技术为代表，常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是SYBR GreenI染料。
实时荧光PCR技术常用TaqManTM技术，由美国Perkin Elmer公司研制，它在一条20多bp的寡核苷酸探针(Probe)的两端分别标记上荧光发射基团(R)和淬灭基团(Q)，在PCR反应中设立标准模板系列对照反应管和阴性对照管，在PCR扩增的退火或延伸步骤中检测荧光信号的变化，得出实时荧光定量PCR(RQ-PCR)的动力学曲线图。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的-5’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离(见附图1)，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。计算样品的Ct值，Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数；阈值是由所选定作为基线的各个循环数的ΔRn值的平均数加上其标准差所得的数值决定。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。根据Ct值与初始模板浓度的对数呈线性关系，利用标准品10倍梯度稀释绘制出标准曲线(见附图2)。利用各样品的Ct值，就可以确定样品的起初模板量。
本发明的详细描述1.对照品阳性对照采用猪瘟石门标准毒株(SM)特异克隆片段体外逆转录获得，浓度为(0.126～0.368μg)。
阳性参照品毒株猪瘟病毒GDGZ1/95株、HeBHH1/95、BJCY1/96株和JL1/94株病毒由本实验室鉴定和保存，在PK15细胞上传代，灭活后备用。
阴性对照采用无特异性病原(SPF)猪各组织，按1∶5倍体积加入PBS液，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中备用。
2.试剂Trizol(200ml/瓶)购自Invitrogen公司；StrataScript(每支10000U，50U/μl)反转录酶购自Merck公司。
Taq DNA聚合酶(2U/μl，每支1000U)、dNTP Mix(10mM each)和RNase Inhibitor购自北京鼎国生物技术有限责任公司和Promega公司。
3.荧光探针和引物的设计和筛选根据GenBank上下载的29条国内外已测得的CSFV全长序列、18条牛病毒性腹泻病病毒-I(BVDV-I)和6条牛病毒性腹泻病病毒-II(BVDV-II)基因组全序列进行综合排列、比较，同时为保证CSFV荧光探针的特异性，避开与牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)同源部分，找出了5个CSFV保守的区域，在这5个保守区设计了5组TaqManTM探针和引物，分别记作T1(J1、J2)；T2(J3、J4)；T3(5、J6)；T4(J7、J8)；T5(J9、J10)，并由上海基康生物技术有限公司合成。所有荧光RT-PCR反应中都以SPF猪组织和去离子水作为阴性对照。
分别提取CSFV SM株、猪瘟兔化弱毒疫苗细胞毒(HCLV)和经鉴定的分离株GDZ1/95株、HeBHH1/95、BJCY1/96株、JL1/94株的血毒样品总RNA进行RQ-PCR，除T1(J1、J2)无论在高浓度和低浓度的模板中Ct值均较低外，其它4对引物和探针的灵敏度均会受到模板量影响；对于同种样品相同RNA模板浓度的重复反应，T1(J1、J2)的反应Ct值也最为稳定；而对于不同类型的RNA模板，T1(J1、J2)的反应Ct值也都为最低。即T1(J1、J2)在不同的模板环境中的灵敏度最高，所以选用T1(J1、J2)作为本试验的探针和引物。
表1 5对探针和引物在不同样品中荧光RT-PCR的CT值
经筛选的引物和探针序列J15’-GAGTCCAGGAACCGGAATACGAT-3’J25’-TCCGGCTATCATGTCGTAGCTT-3’T15’-TGCGTGTACCTCACTCCCGTCTCGAAA-3’，探针由5’-FAM和3’-TAMRA修饰。
4.荧光RT-PCR反应体系的建立以CSFV SM株和HCLV株作为模板进行荧光RT-PCR，经过对StrataScript反转录酶、上下游引物、探针和反应体系的逐步优化。最终选用的反应体系为StrataScript反转录酶0.3μl、10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、J1(10μm)2.5μl、J2(10μm)2.5μl、T1(5μm)1.5μl、Taq DNA聚合酶1μl、RNase Inhibitor 1μl、加入0.02～0.06μg CSFV SM株RNA模板，补ddH2O到50μl。反应条件42℃20min；92℃ 3min；92℃ 15s，60℃ 1min，40cycles。
5.特异性和敏感性研究采用上述优化的荧光RT-PCR反应体系对牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)OregonC24V株、NADL株和牦牛株、猪伪狂犬病毒(PRV)Fa株、猪细小病毒(PPV)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ株进行特异性试验，上述6种其它病毒的检出率重复3次均为零，采用上述优化的荧光RT-PCR反应体系对野外分离的扁桃体CSF阳性样品(HCFA)10份，阴性样品15份进行符合率试验，同时用水为空白对照，结果HCFA与荧光RT-PCR两者的符合率为83％，荧光RT-PCR较HCFA方法敏感。
将提取的HCLV RNA模板2μl(约2.25×109拷贝/2μl)进行100～109倍梯度稀释，每个稀释度设立3个重复，同时进行荧光RT-PCR和常规Nest-PCR检测。
表2 各稀释度模板的荧光RT-PCR CT值和常规Nest-PCR阳性检出情况
由CT值可知100～10-7间的CT值与模板拷贝数的对数呈线性关系，相邻两个模板浓度间的CT值相差约3.3，与理论上计算的模板浓度相差10倍Ct值相差3.3相符，且10-7后模板拷贝数对数与CT值已不成线性关系，可见荧光RT-PCR可以检测出109倍稀释模板量即102的拷贝数；而由电泳结果显示常规Nest-PCR能检测出105倍稀释模板量，即104的拷贝数，由此荧光RT-PCR比常规Nest-PCR的灵敏度高出100倍。
试剂盒生产组装及应用1.试剂盒生产组装1.1对照品及水阳性和弱阳性对照采用猪瘟石门标准毒株(SM)特异克隆片段体外逆转录获得特异RNA，强阳性对照含量为(0.126～0.368μg/10μl)和弱阳性对照含量为(0.013～0.037μg/10μl)，300μl/管分装，各2管，-20℃冻存备用。
阴性对照采用SPF猪各组织，按1∶5倍体积加入0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中，分装成1200μl/管，共10管，-20℃冻存备用。
0.1％DEPC水(以下简称DEPC水)在去离子水中加入0.1％DEPC，37℃1小时处理，或室温过夜处理。15磅高压20分钟，20ml/瓶。
1.2试剂Trizol裂解液25ml/瓶，分装至棕色瓶中，4℃存放备用。RT-PCR反应液按本发明设计的引物J15’-GAGTCCAGGAACCGGAATACGAT-3’和J25’-TCCGGCTATCATGTCGTAGCTT-3’，由上海基康生物技术有限公司合成。每个反应包括10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、J1 2.5μl、J2 2.5μl，共11.0μl。50个反应共计550μl，分装成2管(275μl/管)。
反应酶每个反应包括StrataScript反转录酶0.3μl、Taq DNA聚合酶1.0μl，共1.3μl。50个反应共计65μl，分装成1管。
探针溶液按本发明所设计的探针
T15’-TGCGTGTACCTCACTCCCGTCTCGAAA-3’，探针由5’-FAM和3’-TAMRA修饰，是上海基康生物技术有限公司合成，用0.1％DEPC水稀释成5μM，每个反应需1.5μl。50个反应共计75μl，分装成1管，-20℃冻存备用。
2.试剂盒组装(以50头份计)取上述阳性对照和弱阳性对照各2管，阴性对照10管，RT-PCR反应液2管、反应酶1管、探针溶液1管、Trizol 1瓶，DEPC水1瓶，正放于试剂盒中；8联PCR反应管及管盖7排。
3.试剂盒的应用3.1样品制备3.1.1血液样品每个反应取200μl全血提取RNA。
3.1.2组织脏器取待检样品50～100mg于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加1ml DEPC水混匀，4℃，3000r/min离心15min，取200μl上清液(/反应)转入无菌的1.5ml Eppendorf管中，编号备用。
3.1.3细胞培养物每个反应取200μl细胞培养物提取RNA。
3.2样本存放制备的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。
3.3样本的处理在样本制备区进行。
1)取n个灭菌的1.5ml Eppendorf管，其中n为被检样品数×重复数与阴性对照的和(阳性对照、弱阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)。
2)每管加入500μl Trizol，分别加入被检样品、阴性对照各200μl，一份样品换一个吸头，充分混匀，静置5min；再加入200μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。
3)取与步骤1)相同数量灭菌的1.5ml Eppendorf管，加入500μl异丙醇(4℃预冷)，做标记。取上清约400μl(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，4℃静置20min。
4)于4℃、12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600μl 75％乙醇，颠倒洗涤。
5)4℃、12000g离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
5)6)4000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器小心地将其吸干，一种样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。
6)7)加入3μl DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。
3.4扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出猪瘟病毒荧光RT-PCR反应液、反应酶和探针溶液，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设PCR反应数为n，其中n为待检样品数×重复数+强阳性管数+弱阳性管数+阴性管数，每个样本测试反应体系配制见下表。
表1 每个样品反应体系配制表
3.5加样在样本处理区进行。
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤3.3中制备的36.2μl RNA溶液，盖紧管盖。
阳性对照和弱阳性对照管中分别加入10μl阳性对照和弱阳性对照，补水至50μl。
3.6荧光RT-PCR检测在检测区进行。
将上述PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置第一阶段，反转录42℃/20min；第二阶段，预变性92℃/3min；第三阶段，92℃/15s，60℃/1min，40个循环。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
3.7结果判定3.7.1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
3.7.2质控标准1)阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
2)阳性对照的Ct值应在15.0左右、弱阳性对照Ct值应在25.0左右并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
3.7.3结果描述及判定1)阴性无Ct值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无猪瘟病毒。
2)阳性Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟病毒。
3)有效原则Ct＞35且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现Ct值和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
五
图1实时荧光定量技术的原理图2标准品10倍梯度稀释绘制出标准曲线图3本发明的技术路线图4各模板稀释度Nest-PCR反应产物电泳5经筛选的引物(J1、J2)和探针(T1)序列六、本发明的优点根据由GenBank下载的29条CSFV全长序列、牛病毒性腹泻病毒-I(BVDV-I)和牛病毒性腹泻病毒-II(BVDV-II)全序列进行综合排列、比较，同时为保证猪瘟荧光探针的特异性，避开与BVDV同源部分，设计了5组CSFV的特异性探针和引物。通过对5组探针和引物的筛选，反转录酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化，建立了实时荧光RT-PCR检测CSFV的试验方法。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术(HCFA)方法符合率为83％，且比HCFA方法更敏感，较常规Nest-PCR方法敏感100倍；在其它病原体的特异性试验中，其它病原的检出率均为零，说明该方法具有很强的CSFV特异性；与常规Nest-PCR相比，从反应时间和试验成本等方面都体现了荧光RT-PCR检测CSFV的优越性，建立了特异、灵敏、快速的CSFV实验室诊断方法。
本发明的优点，可以归纳为1)特异性好Taqman定量技术通过杂交对定量分子进行甄别，具有很高的准确性，同时靶序列由特异引物和探针双重控制，特异性好，假阳性低；2)灵敏度高反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很灵敏的检测能力；3)线性关系好由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测可以直接对样品初始模板浓度进行定量；4)操作简单自动化程度高，Taqman技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，对环境污染机会少；5)没有后处理过程不用杂交、电泳、拍照等过程。
权利要求
1 一种猪瘟病毒诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂、对照品和水所组成1)阳性和弱阳性对照采用猪瘟病毒石门标准毒株特异克隆片段体外逆转录获得特异RNA，含量为0.126～0.368μg/10μl和0.013～0.037μg/10μl，300μl/管分装，各2管，-20℃冻存备用；2)阴性对照采用SPF猪各组织，按1∶5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中，分装成1200μl/管，共10管，-20℃冻存备用；3)0.1％焦碳酸二乙酯水在去离子水中加入0.1％焦碳酸二乙酯，37℃1小时处理，或室温过夜处理，15磅高压20分钟，20ml/瓶；4)Trizol裂解液25ml/瓶，分装至棕色瓶中，4℃存放备用；5)RT-PCR反应液每个反应包括10×PCR buffer 5μl、dNTP 1μl、J1 2.5μl、J2 2.5μl，共11.0μl，50个反应共计550μl，分装成2管，每管275μl；J1和J2为本发明设计、由上海基康生物技术有限公司合成的引物J15’-GAGTCCAGGAACCGGAATACGAT-3’和J25’-TCCGGCTATCATGTCGTAGCTT-3’；6)反应酶每个反应包括StrataScript反转录酶0.3μl、Taq DNA聚合酶1.0μl，共1.3μl，50个反应共计65μl，分装成1管；7)探针溶液按本发明所设计的探针T15’-TGCGTGTACCTCACTCCCGTCTCGAAA-3’，由5’-FAM，3’-TAMRA修饰，合成的探针用0.1％焦碳酸二乙酯水稀释成5μM，每个反应需1.5μl，50个反应共计75μl，分装成1管，-20℃冻存备用。
全文摘要
本发明属兽用生物制品技术领域。本发明公开了一种动物传染病猪瘟诊断试剂盒。该试剂盒是以本发明人所设计并筛选出的猪瘟病毒荧光探针和引物建立起荧光RT－PCR反应体系用于猪瘟病毒的诊断和猪瘟活疫苗生产过程中的中间监测。本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、线性关系好、操作简单、没有后处理过程，有很高的使用价值。
文档编号C12Q1/68GK101058830SQ20061010940
公开日2007年10月24日 申请日期2006年8月11日 优先权日2006年8月11日
发明者王琴, 王泰健, 范学政, 徐璐, 蒋春燕, 宁宜宝, 赵启祖 申请人:中国兽医药品监察所