专利名称：重组人白细胞介素—11的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人 白细胞介素一ll (Recombinant Human Interleukin 11， IL-11)的方法，以及 有关的序列优化、表达载体及工程细胞的构建。
背景技术：
白细胞介素_ 11 (IL-11)主要由间充质来源的粘附细胞(mesenchymal -derived adherent cell)产生，如骨髓基质细胞、基质成纤维细胞、人胚肺成纤 维细胞和滋养层细胞。IL-ll是一种促血小板生长因子，可直接刺激造血干细胞 和巨核祖细胞的增殖，诱导巨核细胞的成熟分化，增加体内血小板的生成，而血 小板功能无明显改变。IL-ll是人类生长因子家族成员，该家族成员包括生长激 素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及其他生长因子等。人IL-11基因定位于19号染色体长臂13区(19ql3. 3—ql3.4)，含有5个 外显子和4个内含子，长约7 Kb 。人IL—11基因5'端有多个潜在的转录调控 序列，如TATA盒样序列(TATATAA)和AP — 1位点(5' GGTGAGTCAG3'), 其3'端在5591和6762个核苷酸处各有一个聚腺苷酸化位点，为此可形成1. 5kb 和2. 5kb的mRNA转录物。人IL-llcDNA含597个bp的单一长开放读码框， 编码199个氨基酸的多肽，其中N端21个氨基酸为导肽，成熟蛋白为178个 氨基酸组成，理论分子量19. 144KD，不含半胱氨酸残基，亦无潜在的糖基化位 点。近年来，随着对IL-11体内外调控作用及分子生物学研究的不断深入,人们认 识到IL-ll是一个多功能的细胞因子,具有广泛的细胞生物学活性。最初发现它
能刺激IL一6依赖的鼠浆细胞瘤细胞系T1165的增殖。这也是基因工程重组IL 一ll体外测活方法的依据。另外，IL-11对造血系统的作用非常广泛，主要表现 为与其他造血因子协同，对各系造血均有不同程度的促进作用。国内外新近研究 发现，IL-ll除最常见的造血活性外，还具有免疫调节、抗感染和保护黏膜上皮 等功能。 '人体内的IL-11能刺激原始造血干细胞的生长，并能诱导巨核细胞前体细胞 的分化和成熟，促进巨核细胞和血小板生成，增加体内血小板数量并保持其功能。 这一家族的共同特点是使用gpl30作为信号转导蛋白。从而发挥其药效学作用， 白介素-11的生物学作用主要有以下几点1、 促进原始祖细胞的增殖IL -ll与IL -3、 IL -4、 SCF和GM-CSF等可 发挥协同作用，可刺激多能造血干细胞、多能定向干细胞和单能定向干细胞增殖， 可促使这些细胞从GO期进入活性周期，縮短了细胞周期。2、 促进巨核细胞和血小板的生成IL-11对巨核细胞和血小板生成的不同阶 段都有刺激作用，不仅可以使形成的巨核细胞集落数目及大小增加，而且可以提 高外周血小板的数量。3、 在各种动物模型中，同时还观察到IL-ll的一些非造血系统效应包括 调节肠上皮细胞的生长(促进胃肠道粘膜损伤愈合)，抑制脂质形成，诱导急性 期反应蛋白合成，刺激破骨细胞的发育和神经祖细胞的增殖。自从1990年发现IL-11后，美国Genetics Institute公司就开始了rhIL-ll 的研究，用基因重组技术将IL-11基因重组到大肠杆菌中进行表达，获得与人体 IL-ll具有相同活性的重组人白介素-11，共177aa，分子量约19KD，与天然的白 介素-ll相比仅缺乏N端的脯氨酸，该缺失对体内外生物活性均无影响无糖基化。。 1997年11月美国FDA批准了该公司的重组产品上市，商品名为Neuraega，用于治 疗肿瘤放化疗导致的血小板减少以免于血小板输注。每支为5mg冻干粉，不含人 与动物的血源物质，主要添加剂为甘氨酸，用无菌注射用水溶解。皮下给药10 50yg/(kg*d)，患者都能较好耐受。临床研究表明，在高剂量化疗肿瘤患者中 应用该公司生产的rhlL-ll后，28%的患者避免了血小板输血，而对照组只有3 %的患者无需输血小板。
本发明系统提供了一种高效生产重组人IL-11的方法。通过优化编码重组 人IL-11的核苷酸序列，采用糖基人源化改造的新型毕赤酵母表达体系分泌表达 缺乏N端1个脯氨酸的人IL-ll，优化表达载体/宿主菌组合，同时改进发酵工 艺，提高重组人IL-ll的表达水平。同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、 极具产业化价值的一种重组人IL-ll生产方法。发明内容本发明的目的就是提供一种优化的重组人IL-ll蛋白。本发明的另一目的就是提供一种高表达重组人IL-ll蛋白的方法，以及用于 该方法的表达载体及工程细胞构建。在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组人IL-ll蛋白的核苷 酸序列，在不改变IL-11的氨基酸序列的情况下，通过基因编码序列的优化设计， 获得优化的编码重组人IL-ll蛋白的核苷酸序列。所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序 列编码区与SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列有74%以上相同性。在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种高表达重组人IL-ll蛋白的工程细胞构建 的方法，通过将优化后的人IL-ll编码序列与合适的表达载体连接，转入毕赤酵 母，筛选获得高表达工程细胞。在另一优选例中，所述的表达载体是pPIC9/IL-11。该载体经甲醇诱导表达 重组人IL-ll蛋白。 ，
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，整合有上述表达 载体。在另一优选例中，所述的工程细胞是经过糖基人源化改造的毕赤酵母在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人IL-11蛋白的方法，该方法包 括步骤1. 挑选已确证构建成功的工程细胞4个，接种至含3mlYPD培养基的50ml离心 管，3(TC， 200rpm过夜培养。2. 生长约30小时后(此时OD,在10 30)，测定每管的0D6。。，计算每管酵母 菌体重悬后达到一致OD,值所需诱导培养基的体积。4000rpm，室温离心 10min，取上清作为诱导前样品，用计算得到的适当体积的诱导培养基YPM(含1%甲醇)重悬菌沉淀，以诱导表达。3. 每隔24小时补充100%甲醇至终浓度1%左右以维持诱导4. 诱导培养后48小时分别取培养液lml，离心后取上清；SDS-PAGE电泳检测。本发明的优点在于(1) 选用的是毕赤酵母GS115宿主细胞，通过小摇表达筛选出高表达工程细胞。(2) 优化后的重组人IL-ll蛋白基因非常适合在毕赤酵母GS115宿主细胞 中表达，具有高表达、高稳定的特点。(3) 蛋白高水平分泌表达，纯化工艺简便，回收率高，生产成本降低。
图1. IL-ll理论序列与IL-ll优化序列的同源性比较。Query:天然IL-1] 基因序列；Sbjct:优化的IL-ll基因序列。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将优化 后的人IL-ll编码序列(SEQ ID NO: 2)转入经糖基人源化改造的甲醇利用型毕 赤酵母(尸.pa"ow's)，实现了重组人IL-11蛋白高效分泌表达。在此基础上完 成了木发明。本发明根据人IL-ll天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸 序列的条件下，全基因合成重组人IL-ll蛋白的目的基因序列，将该基因克隆到 pUC57中测序验证。优化后的人IL-ll编码序列与表达载体pPIC9连接，转化、 整合入尸.pa"on、宿主细胞染色体，小摇筛选获得高表达工程细胞。在本发明的一个实例中，构建了生产重组人IL-ll的酵母表达工程细胞， 甲醇诱导，高水平分泌表达。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商 所建议的条件。实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得根据人IL-ll天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的 条件下，全基因合成重组人IL-ll蛋白的目的基因序列，将该基因克隆到PUC57
中并测序验证。通过PCR扩增得到人IL-ll目的基因，用XhoI+EcoRI双酶切(MBI， 2*TangoTM，37°C) PCR产物及pPIC9质粒(购自Invitrogen公司)。将两个片段 用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5 a (购自Promega公 司)，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR 鉴定筛选出阳性克隆。大量扩增确证的pPIC9/IL-11质粒，获得含有IL-ll的重 组质粒pPIC9/IL-11。表达质粒pPIC9/IL-11经测序验证后，用Sal I酶切线性化，电穿孔法转 化进入毕赤酵母GS115(购自Promega公司)，涂于MD平板上于30。C培养至有转 化子长出，筛选高表达菌株。进行小摇表达筛选得到IL-ll高表达的工程酵母菌 株。实施例2重组人IL-ll的表达时间的确定挑选一株确证好的表达工程菌GS115/ pPIC9/IL-11，用YPD培养基进行培 养，甲醇诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带的出现，并分析其表达 量。分别在甲醇诱导后24， 48和72小时取一部分发酵后的菌液离心，收集上清， SDS-PAGE电泳检测。电泳结果表明目的蛋白是以分泌形式表达，48小时达到最 高表达量。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请 所附权利要求书所限定的范围。
序列表〈110〉上海新生源医药研究有限公司〈120〉重组人白细胞介素一ll的生产方法〈160〉 2〈210〉 1<211〉 534<212〉 DNA<213〉人工序列〈221〉 m i sc_f eature '〈222〉(1)…(534)<223〉优化的重组人IL-11基因<400〉 1ggaccaccac ctggaccacc tcgtgtttct ccagatcctc gtacttctta cacgttctct tcttgctgat acacgtcaac aaattcccag ctgatggaga tcacaatctt gattcacttc ggagcacttg gagctcttca acttccaggt gtacttacac tcatatcttc gtcatgtaca atggcttcgt cgtgcaggtg gaaccagaac ttggaactct tcaagcacgt cttgatcgtc cttatgtcac gtcttgcact tccacaacca ccaccagatc ccaccaixat cagcttgggg aggtattcgt gcagcacatg cttacacttg attgggcagt acgtggactt cttcttcttagtgctgaact tgatagtaca GOttgctgcaca acttcgtgac 120caactcttgc aatgagtgct 180gtcttcgtgc tgatcttctt 240gatcttcact taagactctt 300ttcttcgtcg tcttcaactt 360caccagctcc accacttgct 420ctatacttgg aggacttcat 480agactcgtct ttga 534〈210〉 2〈211〉 177〈212〉 PRT<213> 智人〈400〉 2
Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg ValSer Pro Asp Pro Arg Ala 15 10 15Glu Leu Asp Ser Thr ValLeu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala AspTh;r Arg Gin LeuGly Asp His AsnGly Ala Leu GlyArg Ala Asp LeuArg Ala Gly GlyThr Leu Gin AlaLeu MetSer ArgAla Pro Pro LeuAla Ala His AlaAla ValArg Gly20 25Ala Ala Gin Leu Arg Asp Lys35 40Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu 50 55Ala Leu Gin Leu Pro Gly Val65 70Leu Ser Tyr Leu Arg His Val80 85Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu95 100Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg110 115Leu Ala Leu Pro Gin Pro Pro 125 130Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp140 145lie Leu Gly Gly Leu His Leu 155 160Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg 170 175Phe Pro Ala AspAla MetSer AlaLeu Thr ArgGin Trp LeuPro Glu LeuArg Leu GinPro Asp ProGly Gly lieThr Leu AspLeu177J30460Leu75Arg90Gly105Leu120Pro135Arg 150Trp 16权利要求
1.一种高表达人白细胞介素-11(IL-11)蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤(a)获得优化的白细胞介素-11的DNA序列；(b)构建合适表达载体；(c)转化宿主细胞，筛选获得高表达的工程细胞。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的优化的白细胞介素-11 的DNA序列编码如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N0:1所示的DNA序 列有95%以上的同源性。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的优化的白细胞介素-11 的DNA序列被克隆入合适的表达载体。较佳地，步骤(b)中所述的表达载体是 pPIC9/IL-11。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的工程细胞，含有权利 要求3所述的表达载体或权利要求2所述的编码重组人白细胞介素-ll的DNA序列。 较佳地，所述的工程细胞是毕赤酵母。
全文摘要
本发明提供了一种重组人白细胞介素-11的核苷酸序列，高效生产重组人白细胞介素-11的生产方法，以及有关的工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的重组人白细胞介素-11蛋白基因，非常适合在酵母中表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了产量，具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得重组人白细胞介素-11纯品。
文档编号C12N15/09GK101165180SQ200710162970
公开日2008年4月23日 申请日期2007年9月28日 优先权日2006年9月29日
发明者军 任, 朱飞云, 黄阳滨 申请人:上海新生源医药研究有限公司