专利名称：：亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种亲和微滤分离纯化木聚糖酶技术方法。属于生物分离和膜分离相结合的
技术领域：
。技术背景通过切断木聚糖主链中卩-l，4糖苷键，内切-p-l,4-D-木聚糖酶(EC3.2丄8)能有效地降解木聚糖。在食品、词料、医药、能源、造纸、纺织等许多行业中，木聚糖酶具有广阔的应用前景，特别在造纸工业中，该酶可用于纸浆的漂白，降低纸浆漂白过程中化学品的用量，从而有效的降低造纸工业对环境所产生的污染。因此，为了规模化、高效利用木聚糖酶，有必要从复杂的发酵介质中分离出木聚糖酶；同时，为了研究木聚糖酶的生物学特性及其作用机理，也必须对木聚糖酶进行必要的纯化。目前，木聚糖酶的分离和纯化过程均基于木聚糖酶与共存的杂蛋白之间在物理、化学性质方面的差异，如分子大小、表面电荷等方面的不同，所采用的分离技术主要是硫酸铵沉淀、超滤、凝胶过滤和离子交换层析等，通常，需要采用多步(一般的是二至五步)串联的分离和纯化过程，木聚糖酶的回收率一般在0.2%到52%之间，工艺复杂、效率低。
发明内容本发明目的旨在利用生物分子的特异性亲和作用进行分离，生物分子的活力回收率高，选择性特别高，只需经过一步处理即可等到几乎均质的生物分子，而且配基(吸附剂)可反复使用，可以达到简化工艺、降低生产成的目的，提出一种亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法。本发明的技术解决方案其特征是本方法的工区步骤分为，1、4"C的粗木聚糖酶液与燕麦木聚糖混合、吸附3小时。2、微滤浓縮到原体积的1/3后，流加pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠，间歇渗滤(diafiltration)洗涤除去杂蛋白质。3、用pH7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠作为洗脱剂，对2中微滤截留物间歇渗滤洗脱3次，被洗脱下来的组分即为木聚糖酶。本发明的优点分离过程简单，分离效率高，酶活力回收率高，一步分离即可得到电泳级木聚糖酶组分。具体实施例方式实施例1:用0.05mol/L的柠檬酸溶液将1L木聚糖酶粗酶液的pH值调至pH3.0，置于夹套反应器中，将木聚糖酶粗酶液冷却至4X:后，加入适量的燕麦木聚糖，使木聚糖含量为10g/L，在4'C下搅拌(250r/min)吸附3小时。在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2tim的微滤膜间歇渗滤(diafiltration)反应器内的悬浮液，渗滤时，首先将悬浮液浓縮4倍，然后补充pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使反应器内物料体积回复到原有体积(1L)，如此进行3次，置换体积为2.0L，洗涤结束时，反应器内悬浮液体积约为200mL。以含1.5mol/LNaCl、pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液为洗脱液，在反应器中补充适量的洗脱液，使总体积为1L。在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140，2的0.2"m的微滤膜将反应器内悬浮液微滤浓縮4-8倍，再补充适量的洗脱液，使反应器内料液体积回复到原有体积的一半(0.5L);然后，进行微滤法连续渗滤，置换总体积为2L，此时，所得微滤透过液即为几乎均质的木聚糖酶溶液。以2.5mol/LNaCl溶液为再生液，在反应器中补充适量的再生液，使总体积为1L。在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2iim的微滤膜将反应器内悬浮液微滤浓縮4_8倍，再补充适量的再生液，使反应器内料液体积回复到原有体积的一半(0.5L);然后，进行微滤法连续渗滤，置换总体积为2L，此时，截留所得悬浮液即为燕麦木聚糖悬浮液，可以循环使用，如此再生，循环10次未改变其吸附性能。实施例2，用0.05mol/L的柠檬酸溶液将1L木聚糖酶粗酶液的pH值调至pH3.0，置于夹套反应器中，将木聚糖酶粗酶液冷却至4'C后，加入适量的燕麦木聚糖，使木聚糖含量为100g/L，在4T:下搅拌(250r/min)吸附3小时。在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2um的微滤膜间歇渗滤(diafiltration)反应器内的悬浮液，渗滤时，首先将悬浮液浓縮5倍，然后补充pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使反应器内物料体积回复到原有体积(1L)，如此进行3次，置换体积为2.5L，洗涤结束时，反应器内悬浮液体积约为250mL。以含1.5mol/LNaCl、pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液为洗脱液，在反应器中补充适量的洗脱液，使总体积为1L。在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2Pm的微滤膜将反应器内悬浮液微滤浓縮8倍，再补充适量的洗脱液，使反应器内料液体积回复到原有体积的一半(0.5L);然后，进行微滤法连续渗滤，置换总体积为2.5L，此时，所得微滤透过液即为几乎均质的木聚糖酶溶液。以2.5mol/LNaCl溶液为再生液，在反应器中补充适量的再生液，使总体积为1L。在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2Pm的微滤膜将反应器内悬浮液微滤浓縮4-8倍，再补充适量的再生液，使反应器内料液体积回复到原有体积的一半(0.5L);然后，进行微滤法连续渗滤，置换总体积为2.5L，此时，截留所得悬浮液即为燕麦木聚糖悬浮液，可以循环使用，如此再生，循环10次未改变其吸附性能。试验结果:表1亲和微滤纯化结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法，其特征是该方法的步骤分为，(1)4℃的粗木聚糖酶液与燕麦木聚糖混合、吸附3小时；(2)微滤浓缩到原体积的1/3后，流加pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠，间歇渗滤洗涤除去杂蛋白质；(3)用pH7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠作为洗脱剂，对步骤2中微滤截留物间歇渗滤洗脱3次，被洗脱下来的组分即为木聚糖酶。2、根据权利要求1所述的亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法，其特征是步骤(1)中的粗木聚糖酶液与燕麦木聚糖混合是用0.05mol/L的柠檬酸溶液将lL木聚糖酶粗酶液的pH值调至pH3.0，置于夹套反应器中，将木聚糖酶粗酶液冷却至4"C后，燕麦木聚糖，使木聚糖含量为10-100g/L,在4'C下搅拌，250r/min，吸附3小时。3、根据权利要求1所述的亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法，其特征是步骤(2)是在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2wm的微滤膜间歇渗滤反应器内的悬浮液，渗滤时，首先将悬浮液浓縮4-5倍，然后补充pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使反应器内物料体积回复到原有体积1L，如此进行3次，置换总体积为2.0-2.5L，洗涤结束时，反应器内悬浮液体积为200-250mL。4、根据权利要求1所述的亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法，其特征是步骤(3)是以含1.5mol/LNaCl、pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液为洗脱液，在反应器中补充洗脱液，使总体积为1L，压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2"m的微滤膜将反应器内悬浮液微滤浓縮4-8倍，再补充洗脱液，使反应器内总料液体积回复到初始料液体积的一半，0.5L;然后，在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为1400112的0.2Pm的微滤膜，进行微滤法连续渗滤，置换总体积为2-2.5L，此时，所得微滤透过液即为几乎均质的木聚糖酶溶液。5、根据权利要求1所述的亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法，其特征是步骤(4)是以2.5mol/LNaCl溶液为再生液，在反应器中补充再生液，使总体积为1L，在压力为30kPa、进料速度为200mL/min条件下，用有效膜面积为140cm2的0.2um的微滤膜将反应器内悬浮液微滤浓縮4-8倍，再补充再生液，使反应器内料液体积回复到原有体积的一半，0.5L;然后，进行微滤法连续渗滤，置换总体积为2-2.5L，此时，截留所得悬浮液即为燕麦木聚糖悬浮液。全文摘要本发明涉及的是一种亲和微滤分离纯化木聚糖酶的生产方法，该方法的步骤分为(1)4℃的粗木聚糖酶液与燕麦木聚糖混合、吸附3小时；(2)微滤浓缩到原体积的1/3后，流加pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠，间歇渗滤洗涤除去杂蛋白质；(3)用pH7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠作为洗脱剂，对步骤2中微滤截留物间歇渗滤洗脱3次，被洗脱下来的组分即为木聚糖酶。本发明的优点分离过程简单，分离效率高，酶活力回收率高，一步分离即可得到电泳级木聚糖酶组分。文档编号C12N9/42GK101210238SQ20071019222公开日2008年7月2日申请日期2007年12月21日优先权日2007年12月21日发明者振周,华江,薄开静申请人:南京林业大学