一种人TSH受体全长cDNA的细胞株及其构建方法

专利名称：一种人TSH受体全长cDNA的细胞株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞抹，尤其涉及一种人TSH受体全长cDNA的细胞 林及其构建方法。
背景技术：
促曱状腺激素(thyrotropin or thyrotrophin)又称曱状腺刺激激素 (thyroid—stimulating hormone, TSH)， 它是由垂体前叶分)必的一种重要 的糖蛋白激素，通过其特异的受体(即TSH受体)发挥促曱状腺的作用。 TSH受体是一种重要的自身抗原，其相应的自身抗体在自身免疫性甲状腺 疾病的发生过程中起着重要作用。
研究发现，TRAb具有异质性有些TRAb和TSHR结合后发挥类似TSH 的作用(刺激cAMP产生、摄碘及曱状腺球蛋白合成)，称为曱状腺刺激性 抗体(thyroid stimulating antibodies, TSAb);有些TRAb同TSH受体 结合后抑制TSH介导的受体活化，称为甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulation-blocking antibody, TBAb);还有一些TRAb同TSH受体结 合后既无刺激作用也无抑制作用，称为中性TSH受体抗体(neutral TSH receptor antibodies)。 一般i人为，^口果TSH受体^元体以TSAb为主，临床上表现为Graves病；如果以TSBAb为主，临床上则表现为原发性曱状 腺功能减退症。
目前临床常用的方法为Rees Smith等建立的体外竟争受体法，这种 方法是以待测血清与1251标记的TSH竟争结合TSH受体制剂，根据竟争的 强弱判断待测血清TSH受体抗体水平。用这种方法测定的TSH受体抗体也 称为TSH结合抑制免疫J求蛋白(TSH binding inhibiting immunoglobulins: TBII)。 TBII的主要缺点是只能反映抗体与TSH竟争TSH受体的能力，不 能区分抗体的功能是刺激性还是阻断性。
随着人TSH受体的克隆，Vassart等将人TSH受体cDNA克隆到pSVL 真核表达载体中，并将此载体转染到CHO细胞并筛选合适的稳定表达细 胞，得到适于TSAb和TSBAb测定的细胞抹，称为JP26细胞。该JP26细 胞价格贵，不易获得，表达纯度不高，缺乏高效稳定表达。但在国内，有 文献提及原核表达载体的构建，而涉及TSHR体外真核表达系统的研究较 少，仅有一篇报道乂AA曱状腺组织中提取RNA，通过逆转录获得人TSHR 膜外区cDNA,构建了 TSHR膜外区真核表达载体并在中国仓鼠卵巢细胞表 达hTSHR膜外区蛋白分子(非全长cDNA)。由于国内缺乏高效稳定表ii^ TSH受体cDNA的细胞^朱，致使TSAb和TSBAb的测定难以开展，极大地阻 碍了AITD的诊断、治疗和研究。

发明内容
本发明的目的在于
(1)提供一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱；
2 )提供一种人TSH受体全长cDNA细胞林的构建方法。本发明的技术方案如下1、 一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱，它由下列方法制得 (1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列； (2 )将步骤(1 )得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以I / I双酶切鉴定；(3 )将步骤(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pc應3. 1质粒； (4 )将重组的pcDNA3. 1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5a,质粒抽提纯化，质粒鉴定；(5 ) pcDNA3. 1-hTSHR质粒的转染CH0细胞。 其中还包括步骤(6 ):用G418筛选步骤(5 )得到的表达林。 步骤(1) PCR中所用的引物如下上游引物为:5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框内为I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，下游引物为5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' 方框内为I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。 2、 一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱构建方法，包括以下步骤 (1 )用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列； (2 )将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以J/w II双酶切鉴定；(3 )将步骤(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1质粒； (4 )将重组的pcDNA3. 1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5ot，质粒抽提纯化，质粒鉴定；(5 ) pc廳3. 1-hTSHR质粒的转染CH0细胞。 其中还包括步骤(6 ):用G418筛选步骤(5 )得到的表达株, 步骤(1) PCR中所用的引物如下上游引物为5'—cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA—3方框内为I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，下游引物为5'-cclt eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3'方框内为J&I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。依照上述技术方案本发明的具体实施方法是以人曱状腺组织cDNA为才莫板，以hTSHR基因特异的引物进行PCR扩 增，得到目的基因片段特异性条带，目的片断与pGEM-T载体连接后采用 蓝白斑法筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后提取质粒DNA，以^/wI和I作双酶切，经电泳、测序鉴定得到目的基因。将经测序证实的Z/w I 和I双酶切片段连接入质粒pcDNA3. 1的A>71 /i7 a I酶切位点之间， 构建成pcDNA3. 1-hTSHR重组质粒。经转化细菌筛选阳性克隆，扩大培养， 抽4^t冲立DNA,再以《p/ I和1&2 I作双酶切，酶切产物电泳可见2300bp左 右的条带，说明目的基因已克隆入pcDNA3. 1。再对质粒DNA进行测序， 测定结果与基因库登录序列进行比对分析。测序结果显示，克隆入 pcDNA3. 1的目的片段与hTSHR基因的编码区序列完全一致，进一步证明 pcDNA3. 1-hTSHR真核表达载体已构建成功。将pcDNA3. 1-hTSHR质粒转染 CHO细胞，进行表达，用G418筛选阳性表达抹，破碎细胞，用Western 法对细胞表达蛋白进行鉴定，证明细胞可以表达hTSHR。本发明所公开一种人TSH受体全长cDNA的细胞林及其构建方法， 其优点表现在将扩增好的hTSHRcDNA克隆入pGEM-T载体，酶切鉴定确 定是目的基因片段后再将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3. 1中，并再 次进行双酶切鉴定以保证基因片段的正确性。从而完成真核表达载体的构 建。通过脂质体介导，用重组质粒pcDNA3. 1 - hTSHR转染CH0细胞，以 G418筛选稳定表达抹，经Western印记法鉴定出被转染细胞成功表达 hTSHR。 /人而得到高效稳定表达hTSHR的细胞4朱。为TSAb和TSBAb的测定 奠定了勤出，也为进一步研究人TSH受体的结构和功能打下了勤出。


图1: RT-PCR产物电泳结果(M示分子量标准；泳道1和2为RT-PCR 产物)。图2: pcDNA3. 1-hTSHR重组质粒DM的J/m II双酶切结果。 泳道l: DNA分子量标准，泳道2:抽提的质粒DNA,泳道3:抽提的质粒 DNA经《p/7 I/J ^ I双酶切产物，泳道4: RT-PCR产物。图3: G418筛选后的阳性细月包^K。图4:稳定表达hTSHR基因的细胞抹的Western blot结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。 实施例1一、材料与方法 (-)材料 1.质粒(1) pc陽3. 1质粒(Invitrogen公司产品)(2) pGEM-T载体(Promega 7>司产品)2. 菌林(l)大肠杆菌DH5 a (华舜生物工程有限7>司产品) (2)CH0细胞(中国科学院细胞所)3. 试剂盒(1) RNA抽提试剂(Promega />司产品)(2) 逆转录试剂盒(Promega 7>司产品) D)质粒DNA抽提试剂盒(Qiagen 7>司产品)(4) PCR纯化和胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)(5) 质粒小抽试剂盒(Qiagen 乂>司产品)(6) ECL+plusTM Western blotting systemi式剂盒(Amersham7^司)4. cDNA文库及引物:没计软件(1) GenBank登陆号:固—001729。(2) Primer 5. 0软件5. 酶(1) Pf u DNA聚合酶(Promega 7>司产品)(2) T4 DNA连接酶(Promega公司产品)(3) 限制性内切酶入i^/ I和I (New England Biolabs公司产品)(4) 胰蛋白酶(Gibco公司产品)(5) RNase H6. 引物(1) 01 igo- (dT)5(2) PCR上游引物(上海生物工程公司合成)(3) PCR下游引物(上海生物工程公司合成)7. 器材(1) 剪刀(2) 镊子(3) 匀浆管(4) 锡纸(5) 研钵(6) Eppendorf管(7) 离心管 (S)吸管(9)细胞培养瓶(11) 6孔板(12) 1 Ocm盘(13) 96孔盘(14) 牛皮纸(15) 克隆环(16) 刮刀8. 试剂(l)二乙基焦碳酸酯(diethyl pyrocarnonate, DEPC)水吸出DEPClml 放在1000ml双蒸水中配成1%。DEPC水，放在lOOOml容量瓶中静置4小时备用。(2) 75%乙醇(DEPC水配制)(3) 10 x PCR 緩冲液(500腿ol/L KC1 ;15mmol/L MgCl2 ; 100mmol/L Tris HC1; pH 8. 3)(4) 琼脂糖Sigma公司产品(5) 10x连接緩沖液(6) LB液体培养基(在100ml蒸馏水中加入胰蛋白胨lg， NaCl lg,酵母 提取物O. 5g,用NaOH调节pH值7. 2-7. 6，高压灭菌备用。)(7) LB固体培养基琼脂(在100ml LB液体培养基加入l. 5-2 g琼脂糖醋， 加热溶化，高压灭菌备用。)(8) 氨苄青霉素(上海生物工程公司产品)(9) 10xT4緩沖液(10) CaCl2(11) 10%FBS(12) F12培养基(l加-Hanks液称取KC1 0. 4g; KH2P04 0. 06g; NaCl 8. Og; NaHC03 0. 35g;Na2HP04 . 12H20 0. 132g; D—葡萄糖1. Og;酚红(0. 1% ) 1ml,加ddH20至1000ml,高压灭菌IO分钟。 (載EM(15) Lipofectamine 2000 : Invitrogen公司产品(16) 6 x Lysis緩沖液(17) TBST ( TBS+0. 05%Tween20 )(18) SDS-PAGE① 12。/。SDS-PAGE电泳分离月交30%丙烯酰胺4ml; Tris-HCl 5ml; 10°MPS lOOul; 10%SDS lOOul; TEMED 4|al;去离子水3. 3ml混 合。② 5。/。 SDS-PAGE电泳积层月交30%丙烯酰胺0. 85ml; Tris-HCl 0. 625ml; 10%APS 50ul; 10%SDS 50ul; TEMED 5|il;去离子水 混合。③ 5xSDS-PAGE上样纟爰沖液0. 125mol/l Tris-HC1; 20%甘油, 4%SDS; 0. 2 mol/L DTT; 0. 02%溴酚蓝。④ 凝胶电泳緩冲液Tris 3. 03g;甘油14. 4g; SDS1. 0;力。ddH20 至1000ml ) SDS-PAGE染色液90ml曱醇水(1: 1， V/V); 10ml冰乙酸； 25g考马斯亮蓝R250。 ,⑥SDS-PAGE脱色液90ml曱醇水(1: 1, V/V); 10ml水乙酸。(19) 内参Actin —抗浏辣根过氧化酶束联的驴抗兔IgG ( Santa公司产品)9. Marker(1) DNA DL2000 marker (大连Takara/>司产品)(2) 蛋白质Marker (上海生物工程公司产品)10. 主务f义器(1) 倒置显微镜(Olympus公司产品)(2) 紫外分光光度仪(3) C02细胞培养箱(Hereus公司产品)(4) 台式离心才几(Beckman 7>司产品)(5) Perkin-Elmer-Cetus 9700热循环4义(6) j氐温离心才几(S i gma 7>司产品)(6) SDS-聚丙烯胺凝胶垂直电泳装置(Bio-Rad公司产品)(7) 电转膜仪(Bio-Rad公司产品)(9) SmartspecTM3000分光光度计(Bio-Rad公司产品)(10) 超净工作台(上海医疗器械厂产品)(11) FR-200紫外分析扫描装置(上海复日科技有限公司产品) (1》微量加样器(E卯endorf公司产品)妙电泳仪(上海复日科技有限公司产品)(14) TN2-C恒温振荡器(江苏太仓市实验i殳备厂)(15) 超声细胞破^f义(16) 恒溢水浴箱ll.人曱状腺组织(取自外科切除的手术标本) 仁)方法1.曱状腺组织总RNA抽提(l)实验器具的处理与准备 ①塑料制品(包括枪头、Eppendorf管、匀浆管等)先将DEPC水 从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头 需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前 将枪头等》t^吸头台，再高压一次(EP管)②玻璃制品泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1。/。。DEPC水过夜，再烤干) ③匀浆器(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC)(2) 人曱状腺组织取自外科切除的手术标本，术中取少量曱状腺组织(约O. 5g)，立即置液氮中。(3) 将组织直接;^^研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软， 再加少量液氮，再研磨，如此三次，力口入5ml Trizol液，转入离心 管。样品总体积不能超过所用Trizol体积的10°/。。(4) 研磨液室温放置5分钟，使其充分裂解，12，000rpm,离心5分钟， 弃沉淀。然后加入l. Oml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心 管15秒(禁用漩涡振荡器)，混匀后室温放置15分钟。4°C, 12，000rpm，离心15分钟。(5) 吸取上层水相于一新的离心管，加入2. 5ml异丙醇混匀，室温放置 IO分钟。4°C， 12，000rpm，离心10分钟。(6) 弃去上清液，加入5ml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 4°C, 8000g，离心5分钟。(7) 尽量弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过 分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于DEPC子水中，必要时 可55。C-6(TC水溶解IO分钟。(8) 紫外分光光度仪测定RNA的A26。和A28。值。 2. cDNA第一链的合成。(l)在0. 5mlEppendorf管中，加入甲状腺组织总RNA 2pg，补充适量的DEPC水使总体积达11 m 1 。在管中加10 ju M01 igo- (dT) 15引物 l|Lll，轻轻混匀、离心。 U)70。C加热10min，立即将Eppendorf管插入水浴中至少lmin。然后 加入下列试剂的混合物10 x PCR緩冲液2 ju 1; 25mMMgCl2 2 ja 1 ; lOmM dNTP 1 ju 1 ; 0. 1M DTT 2 ]u 1 。轻轻混匀，离心。42。C孵育 2-5min。(3) 力。入Superscript II1 iu 1 ,在42。C水浴中孵育50min。(4) 于7(TC加热15min以终止反应。(5) 将管插入水中，加入RNase H lyl ， 37。C孵育20min，降解残留 的RNA。3. PCR. ( PCR产物电泳结果见图1)(l)才艮据GenBank中hTSHR基因的cDNA序列(GenBank登陆号 NM—001729 ),选用Primer 5. 0库欠件i殳计上下游引物，并分别在上 下游引物中嵌入限制性内切酶和I的酶切位点。GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'上游引物为5'-cta aga ggt aCC(方框内为I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列)下游引物为5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' (方框内为J&I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序 列)。U)以人曱状腺组织cDNA第一链为模板进行聚合SI^反应(PCR)，扩 增片断长度为2337 bp。于Perkin-Elmer-Cetus 9700热循环4义上 进行PCR^Jl，反应体系为:总体积50pl，含linl人曱状腺组织cDNA， 10 x PCR緩沖液5|nl， 10|imol/l上下游引物各1^1， 2. 5隨o1/1 dNTP 4nl， Pfu DNA聚合酶0. 5jil。 PCR反应采用Touch-down法， PCR条件为95。C预变性5分钟，94。C变性30秒，退火温度在起始 的IO个循环中为60°C ~ 55°C,每次递减0. 5°C,退火时间为45秒， 72。C延伸4分钟；在以后的30个循环中，退火温度固定为55°C， 退火时间为45秒，72。C延伸4分钟；最后于72。C延伸10分钟，于 4。C中保存。(3)扩增结束后，取反应液5 10iul进行琼脂糖凝月交电泳，以DL 2000 Marker为对照，确认反应产物。 4.人TSH受体基因PCR产物的回收与纯化(1) 目的DNAPCR产物于l. 5%琼脂糖凝胶电泳，100mV, 20分钟，分离 2337 bp的人TSH受体全长cDNA片,殳。(2) 在紫外灯下用洁净锋利的刀片割胶回》|认TSH受体全长cDNA片段。(3) 按凝胶块大小溶胶液=1: 3 (w/v)的比例加入适量的溶胶液Sl,置 50。C恒循环水浴加热，每2分钟颠倒即管一次混匀，至凝胶充分溶 解。(4) 按凝胶块大小异丙醇=1: 3 (w/v)的比例加入适量异丙醇，颠倒混 匀。(5) 将混合物移入吸附柱，12000 rpm,离心30秒，倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放进同一个收集管中。(6) 在吸附柱中再加500 pl的Wl (洗涤液)，离心15秒，倒掉收集管中 的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。(7) 在吸附柱中再加500 pl的Wl (洗涤液)，静置l分钟后，离心15秒， 倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中，再离心l分 钟。(8) 将吸附柱放入一个1. 5 ml的清洁无菌的Eppendorf管中，在吸附膜 中央加入30jalTE (PH8. 0)，离心1分钟，收集洗脱液。(9) 使用分光光度计测定0D26。值，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。 通过以上步骤得到hTSHR cDNA。5. 将hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体(1) 连接在0. 5ml反应管中加入pGEM-T 50ng;纯化的人TSH受体基 因PCR产物10-50ng; T4 DNA连接酶3weiss units; 10x连々妾緩 冲液l|il。补(1犯20至总体积为lOju 1, 4。C过夜。(2) 转化① 将50 ja 1感受态大肠杆菌DH5a于冰浴上解冻。② 将10 ia 1连接产物与感受态大肠杆菌DH5a混匀，冰浴30分钟。③ 42。C热休克90秒钟，立即冰浴3-5分钟。④ 加入400 y 1预冷的LB液体培养基，37。C轻摇培养45-60分钟。⑤ 将转化后的DH5a涂布于含lOOmg/1氨节青霉素及X-Gal、 IPTG 的LB平板上，用蓝白斑法筛选阳性克隆。(3) 37。C培养16h后，挑取白色菌落，扩大培养。6. 提取质粒DNA。(按照Qiagen公司说明书)(l)挑取单菌落，接种于3 ml的LB培养液中(含100mg/l氨千青霉素及 X-Gal、 IPTG) 37°C， 200 rpm,振摇过夜。(2)将培养好的菌液分于1. 5 ml的无菌Eppendorf管中，4000 rpm离心5分钟，彻底弃去上清，收获细菌。 ("在细菌沉淀中加入悬浮液P1 (含RNaseA) 250 |al，旋涡震荡至彻底 悬浮。(4) 再加入250 jul碱裂解液P2，立即温和颠倒离心管5-10次，混勻， 室温静置4分钟。(5) 加入35Giu 1中和液P3，立即温和颠倒，混匀5-IO次。(6) 4°C， 13000 rpm离心10分钟，为尽量避免蛋白质污染，将上清小心 移入一新Eppendorf管，同样条件再次离心5分钟。(力将上清移入吸附柱，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放 进同一个收集管中(瞬时离心速度10000rpm，以下各步均同)。(S)在吸附柱中力口500ji 1的B1 (结合緩冲液)，离心15秒，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。(9) 在吸附柱中加500ji 1的W1 (洗涤液)，离心15秒，倒掉收集管中的 液体，将吸附柱放进同一个收集管中。(10) 在吸附柱中再加500ju 1的W1 (洗涤液)，离心15秒，倒掉收集管中 的液体，将吸附柱放进同一个收集管中，再离心1分钟。(11) 将吸附柱;^^一个1. 5 ml的清洁无菌的E卯endorf管中，在吸附膜 中央加入50 y 1 TE(PH8. 0) ，37。C水浴2分钟，离心l分钟，管底 即得提取的质粒DNA溶液。7.以iT/7/ I /Z^ I双酶切鉴定。将酶切鉴定的质粒作DNA序列测定(上海 博亚生物技术有限/>司)，并将测序结果与GenBank中的hTSHR cDNA序列及氨基酸序列进行比对。通过以上步骤得到hTSHR cDNA。8. 将hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1质粒(pcDNA3. l-hTSHR重组质斗立 DNA的1/7/7 I /Z^ I双酶切结果见图2 )(l)将测序正确的pGEM-T-hTSHR重组质粒用I和I双酶切，月交回收hTSHR cDNA片#史。 UM吏用限制性内切酶I和I双酶切pcDNA3. 1质粒，月交回收载体片段。(3)冰浴中按顺序加入ddH20 7ial， 10 x T4緩冲液2 ju 1 ，载体片段O. 1 ILig , 250bp BTC cDNA片#爻0. 4 nig, T4 DNA连4妾酶1 ja 1 ( 2U ), 总体积20]111。弹匀E卯endorf管，短暂离心以集中样品，于4°C 中连接过夜。通过以上步骤得到重组的pcDNA3. 1-hTSHR。9. 将重组的pcDNA3. 1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5a(l)用氯化钙(CaCU制备新鲜感受态细菌DH5 oc:① 从于37。C培养16 20小时的新鲜平板上^沐1个DH5ot单菌落(直径2-3mm)，转到1个含5ml LB培养基的20ml试管中，于 37。C以300转/分振摇培养过夜。② 在无菌条件下转移菌液至4个无菌的、用冰预冷的1.5ml E卯endorf管中，每管1 ml菌液，在冰上》文置10分钟，使培养 物冷却至0°C。③ 于4。C中以4， 000转/分离心10分钟，以回收细月包。 弃上清，将管倒置1分钟以使最后残留的少量培养液流尽。⑤用预先灭菌水浴的0. 1M CaCh lml悬浮每份细胞沉淀，在水上放 置30分钟后，于4。C中以3，500转/分离心5分钟。 弃上清，用0. 1M CaCl2 0.6 ml重悬沉淀，按200iul/管分装， 于4'c放置数小时备用。(2) 质粒转化① 取200 ju 1新鲜制备感受态细菌DH5 a ,加入全量连接产物10 ja 1, 置于1. 5ml Eppendorf管中，混匀，冰浴30分钟。②于42。c热^木克90秒后，立即冰浴2分钟。③ 加入无抗生素的lb液态培养基800 m 1，于37。c摇床上温育45 分钟，使细菌复苏。④ 室温下以4，000转/分离心5分钟，弃部分上清，保留约200jal， 吹打、悬浮沉淀细菌。⑤ 取含氨苄青霉素的LB固体培养基琼脂平皿涂板(全部200 n l菌 液)，置37。c恒温培养箱，待菌液吸收后，倒置平皿，于37。c中 培养12 ~ 16小时。转化进了质粒的细菌则能在此氨节选择培养基 上长出单菌落。(3) 质粒扩增①选择数个单菌落克隆。② 挑取少量菌落，溶于ddH20中，以菌液为模板，PCR扩增hTSHR cDNA 片段。③ 选择扩增出BTC cDNA片段的菌落克隆，溶于含氨千青霉素的100ml LB液体培养基中，于37。C中振摇培养过夜。10. 质粒抽提纯化(1) LB培养基于4。C中以5， 000转/分离心15分钟。(2) 弃上清，加入QIAGEN-tip100质粒DNA纯化试剂盒中Pl液4 ml， 吹打溶解沉淀；加P2液4 ml,轻柔充分混匀，室温》丈置5分钟； 加入预冷P3液4 ml,轻柔充分混匀，于冰上》文置15分钟。(3) 于4。C中以15, 000转/分离心30分钟，留上清，重复离心一次。(4) 放Qiagen-tip 100柱，加QBT液10 ml过柱后，将上清过柱，而 后加QC液40 ml过4主。(5) 加5ml洗脱液QF洗柱，存于灭菌离心管中，加异丙醇3. 5ml，充 分混匀，于4'C中以15, 000转/分离心30分钟，弃上清；力o 70% 乙醇2 ml，充分混匀，于4。C中以15， 000转/分离心IO分钟。(6) 弃上清，室温下风干沉淀质粒，用TE液50 ju 1溶解质粒。(7) 取质粒溶液2 ni 1 ，加TE液98 jli 1 ，分光光度计测定0026。值，计算 质粒浓度。11. 质粒鉴定(1) 用限制性内切酶""I和I双酶切重组质粒3小时。(2) 琼脂糖凝胶电泳酶切产物，观察电泳结果。(3) 质粒送上海博亚生物技术有限公司进行DNA序列测定。 通过以上步骤得到pcDNA3. l-hTSHR质粒。12. CH0细l包的培养(l)CHO细胞的传代CHO细胞用含10%FBS的F12培养基培养。当CHO细胞密度达80%左右时及时传代。传代时，先用D-Hanks洗二遍， 力口O. 25%胰蛋白酶，轻轻晃动使胰蛋白酶与细胞充分浸润。倒掉多 于的胰蛋白酶，继续消化2分钟，加适量含10%FBS的F12培养基 吹匀，用含10%FBS的F12培养基稀释到合适的密度，重铺于培养 瓶内，37°C, 5ml/1 C02放置培养。 U)CHO细胞的冻存当CHO细胞传代培养增殖到一定量时，需要部分 冻存一般选择生长状态良好，密度80%左右的细胞冻存。冻存时， 先用D-Hanks洗二遍。加0. 25%胰蛋白酶，轻轻晃动l吏胰蛋白酶与 细胞充分浸润。倒掉多于的胰蛋白酶，继续消化2分钟。加少量含 10%FBS的F12培养基把贴于壁上的细胞轻轻吹下来，尽量吹匀，保 持细胞密度尽量大一些，然后按细胞混合液FBS: DMS0=7: 2: 1 的比例放入冻存管。顺序在4。C放10分钟，-2(TC放16小时，最后 放-8(TC长期保存。 11pcDNA3. 1-hTSHR质粒的转染(1) 准备转染前将对数生长的CHO细胞重铺于6孔板中，待细胞长至 70%覆盖率时准备转染。(2) 转染取4ugDNA加入含250 |ii 1 OMEM的Eppendorf管中，轻轻混 合。取lOjul Lipofectamine 2000力口入另一含250 jul OMEM的 E卯endorf 管中，室温孵育5分钟，然后把含DNA和 Lipofectamine 2000的OMEM混合在一起，室温孵育20分钟。CHO 细胞用D-Hanks洗一次，用F12培养基洗一次，力。2ml含10%FBS 的F12培养基，滴加转染液，37°C， 5ml/l (]02放置培养5小时后弃转染液,换含10°/。FBS的F12培养基。继续培养20小时后用0. 25% 胰蛋白酶消化细胞，把转染后的细胞按一定比例接种至10cm盘。 通过以上步骤得到TSH受体全长cDNA的表达才朱。 W.G418筛选稳定表达抹(G418筛选后的阳性细胞抹见图3)
(1) G418浓度的确定空白细胞接种一个12孔板或者是6孔板，按照 0， 200ng/jal, 400 ng/jal, 600 ng/jal， 800 ng/|Lil, 1000 ng/ ju 1的G418浓度梯度进行筛选，原则上选择刚好能杀死空白细胞 的最低G418浓度。经'险上来i兌，800 - 1000ng/jul的G418浓度比 较适合CH0细胞稳定抹的篩选。在本实验中，我们发现CH0细胞转 染hTSHR以后实际需要使用50 - 100ng/ ja 1维持筛选浓度，否则细 胞将全部死亡。推测是与hTSHR目的基因的质粒本身有关。
(2) 分盘细胞转染24小时后需要分盘。第一次分盘时可以做一个接 种比例的摸索。按照l: 200， 1: 500， 1: 2000的比例，用确定好 的G418浓度筛选，2-4天后观察，此时单克隆已基本成形，选择
单克隆之间位置较远的接种比例。 15.挑取单克隆
在单克隆的生长过程中，每两天或者三天4奂液。克隆生长时间一般 在6天到10天为宜。CH0细胞生长速度4艮快，第六天的时候各个单克 隆的界限还分得比较开，但是当培养时间延长后， 一些克隆中的细胞会 在分裂的过程中迁移到其他地方，又长出一个小克隆，所以经常会发生 在一个很纯的阳性克隆里面夹杂一定比例的阴性细胞。解决的方法是在 早期的时候就挑出单克隆。选择6-7天挑选一次。(1) 克隆环的准备克隆环用氯仿在摇床上摇2小时，换用曱醇摇10-20 分钟，然后顺次用自来水，ddH20清洗几遍，放烘箱烘干。在玻璃 培P底面途上薄薄一层硅脂，克隆环小心地排列在硅脂上，盖上 盖子，包上牛皮纸后高压灭菌，在烘干，然后放超净台照紫外过夜 备用。
(2) 确定单克隆的位置在显微镜下先肉眼确定单克隆的位置，用 Marker笔上下标记出单克隆的位置，把细胞放回超净工作台准备挑 取单克隆。
(3) 单克隆的挑取细胞先用D-Hanks洗两遍，在标记单克隆的位置上 ;改上克隆环，确保克隆环;改准;^文稳。环内加100 m 1 0. 25°/。胰蛋白酶， 消化2分钟。力口 200jul含10。/。FBS的F12培养基，吹吸数次，把消 化好的单克隆细胞放入96孔培养盘继续放大培养。
16.单克隆的培养
如果能保证单克隆较纯，那么挑取的单克隆可以放96孔培养盘直 接扩大培养。如果可能混合进临近的单克隆，即插入位点不一的几个克 隆可能混合在一起，则应稀释到96孔培养盘培养，并且确保每个孔只 有一个细胞。为了避免假阳性克隆，整个》文大培养的过程都要加G418 维持筛选压力。我们采用这样的方法目前得到阳性单克隆8个，已经传 代到p5。
1L用Western法对细胞进行鉴定。(稳定表达hTSHR基因的细胞4朱的 Western blot结果见图4) (l)标本处理① 加入适量预冷的6 x Lysis Buffer。
② 用预冷的刮刀将细胞刮下，冰上裂解细胞10-15分钟。
③ 超声破碎仪破碎细胞200W共4次，每次5秒，间隔2秒。
4°C， 12000g，离心15分钟。
取上清，IO(TC煮5-IO分钟。 (2)电泳和电净争移 ①SDS-PAGE电泳
a) 将50 ia 1目标蛋白与12. 5 jLi 1 5 x SDS-PAGE上样緩沖液混合， 煮沸8分钟，4'C暂存。
b) 在试管中配好12%分离胶，迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶， 直至剩余的板宽比梳子长度多lcm。小心在胶上覆盖一薄层异 丙醇压胶。分离胶聚合完全后，倒去异丙醇，用蒸馏水沖洗胶 面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。在分离胶聚合的过程中， 配制5%的积层胶，迅速灌注积层力交，立即插入干净的梳子，避 免产生气泡。积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸 取电极緩冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。在 上下电泳槽中加入1 x Tris-甘氨酸电泳緩沖液。
c) 在蛋白溶液中加入等体积的2x样品溶解液，混合液在沸水浴 中加热3分钟，冷却后将样品加入梳孔中。
d) 电泳装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100-120V,当 染进入分离胶(这段时间约为20min)后，将电压提高到 200-220V,继续电泳直至染料到达离凝月交底部lcm处。e)固定从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除 去积层胶部分，将分离胶移入固定液中固定。 f)染色除去固定液，加入染色液，室温染色8小时。 g)脱色回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无 色，其间更换脱色液3-4次。 ②将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)用曱醇浸湿，ddH20沖洗，将电泳 胶、PVDF月莫、滤纸》文于Transferring Buffer中平衡后，置于电 转移槽中，在4°C， 400mA恒流条件下电转移120分钟，将蛋白 样品转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。
(3) 免疫学测定
① 封闭用TBST (TBS+0. 05%Tween20)加5°/。牛奶配制成封闭液。 室温封闭PVDF膜1小时或4"C过4艾。
② 一抗孵育用含5%牛奶的TBST分别稀释目标蛋白或者内参 Actin—抗。室温下与封闭好的PVDF膜孵育2小时或4。C过夜。
③洗膜TBST洗膜3次，每次10分钟。
④二抗孵育用含5%牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物
酶驴抗兔/小鼠二抗。于室温下孵育2小时。 ⑤洗膜TBST洗膜3次，每次10分钟。TBS洗膜一次，IO分钟。
(4) ECL:将Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试 剂盒A液与B液40: 1按比例混合，覆盖膜表面，室温下2分钟， 吸干膜上多余试剂，保鲜膜封闭后，在暗室中经不同时间多次曝光， 显影、定影并洗片。
权利要求
1、一种人TSH受体全长cDNA的细胞株，它由下列方法制得(1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列；(2)将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以Kpn I/Xba I双酶切鉴定；(3)将步骤(2)得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，质粒抽提纯化，质粒鉴定；(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。
2、 根据权利要求1所述的细胞林，其特征在于其制备方法还包括步 骤(6 ):用G418筛选步骤(5 )得到的表达抹。
3、 根据权利要求1所述的细胞抹，其特征在于步骤(1) PCR中所用 !(口下上游引物为:5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框内为i>/71酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，下游引物为5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' 方框内为I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。
4、 一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱构建方法，包括以下步骤 (1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列； (2 )将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA， 以i> I /扁I双酶切鉴定；(3 )将步骤(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1质粒；(4 )将重组的pcDNA3. 1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5a，质粒 抽提纯化，质粒鉴定；(5 ) pcDNA3. 1-hTSHR质粒的转染CH0细胞。
5、 根据权利要求4所述的细胞林构建方法，其特征在于还包括步骤 (6 ):用G418筛选步骤(5 )得到的表达株。
6、 根据权利要求4所述的细胞抹构建方法，其特征在于步骤(1)PCR 中所用的引物如下上游引物为5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框内为J/wI酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，下游引物为5'-cct cta gac gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3'方框内为J6a I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列
全文摘要
本发明涉及一种细胞株及其构建方法。其技术方案如下一种人TSH受体全长cDNA的细胞株，它由下列方法制得(1)扩增hTSHR基因编码区的全部序列；(2)将hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体；(3)将hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化菌DH5α；(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。本发明优点表现在将扩增好的hTSHRcDNA克隆入pGEM-T载体，酶切鉴定确定是目的基因片段后再将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，并再次进行双酶切鉴定以保证基因片段的正确性。
文档编号C12N15/12GK101575591SQ200810037200
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者冯绮文, 张洪梅, 李晓永, 青 苏, 艳 董 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院