专利名称：一种中空多聚糖微球固定化酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中空多聚糖微球固定化酶及其制备方法。
背景技术：
酶是一种在许多领域都有重要应用价值的生物催化剂，具有催化速率高、催化 条件温和、能耗低以及不产生污染等优点。传统的游离酶存在一些缺点，如本身结 构易受外界环境影响出现失活现象；使用后分离回收困难，难以实现连续利用。酶 的固定化技术可以有效地解决这些问题，不仅保留了酶的催化特性，提高了酶的贮 存稳定性和操作稳定性，同时还可以实现酶的回收和连续利用，从而减低了生产中 酶制剂的投入成本，并且简化了后续的产品提纯工艺。微米级的中空球形结构，因 其极高的比表面积和可容纳大量客体分子的中空结构，在酶固定化领域具有广阔的 应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种中空多聚糖微球固定化酶及其制备方法。 本发明提供的中空多聚糖微球固定化酶，包括酶和载体，所述载体是中空多聚 糖微球；所述中空多聚糖微球按照如下方法制备在恒温条件下，将酵母在液体中 进行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒温的温度选自150-24(TC之间的任一温度。 其中，所述酶具体可为水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等、过 氧化物酶、脱氢酶、氧化酶或漆酶等。中空多聚糖微球的制备中所述酵母在液体中 的浓度为10-200g/L。所述恒温的时间为10-24小时。所述液体可以为水，也可以 是水溶液，所述水溶液的溶质选自如下10种化合物中的至少一种盐酸、硫酸、 硝酸、醋酸、氯化钠、氯化钾、醋酸钾、乙醇、乙醛或戊二醛，所述水溶液中溶质 的终浓度可为0. 01-0. lmol/L。所述酵母为球形或椭球形，酵母可以是死的，也可 以是活的。当所述液体为水溶液时，不同的溶质，制备出的中空多聚糖微球可以有 不同的形状，如球形或苹果形或坛子形，还可以是球壁完整的中空微球或球壁上有 一个孔的中空微球。
本发明的另一个目的是提供一种中空多聚糖微球固定化酶的制备方法。 本发明所提供的中空多聚糖微球固定化酶的制备方法，是对中空多聚糖微球的表面进行适当的化学修饰，在中空多聚糖微球表面引入大量的氨基和/或环氧基，然
后利用氨基和/或环氧基与酶之间的化学键合实现酶的固定化。该方法有两种，其中一种方法具体可包括如下步骤
1) 在碱性条件下，将所述中空多聚糖微球用环氧氯丙烷水溶液处理，使所述中空多聚糖微球表面带有环氧基；
2) 将步骤1)得到的中空多聚糖微球与所述酶溶液混合，使所述酶与所述中空
多聚糖微球形成固定化酶。
另一种方法具体可包括如下步骤
1) 在碱性条件下，将所述中空多聚糖微球用环氧氯丙垸水溶液处理，使所述中空多聚糖微球表面带有环氧基；
2) 将步骤1)得到的中空多聚糖微球用氨水处理，使所述中空多聚糖微球表面带有氨基；
3) 将步骤2)中得到的中空多聚糖微球用戊二醛水溶液处理；
4) 将步骤3)得到的中空多聚糖微球与所述酶溶液混合，使所述酶与所述中空多聚糖微球结合形成固定化酶。
其中，所述环氧氯丙垸水溶液的体积百分含量为1-50%;所述氨水的浓度为0. 0卜2. 0mol/L;所述戊二醛水溶液的体积百分含量为0. 1-20%。
本发明的中空多聚糖微球固定化酶的酶蛋白负载量高，酶活性高，酶的稳定性和操作稳定性强。
本发明的中空多聚糖微球固定化酶的制备方法是以酵母碳化得到的中空多聚糖微球为酶的固定化载体。其中，制备载体的原料来源广泛，载体的制备、表面修饰和酶的固定化技术简单易行，且载体具有高比表面积、大内部空间、丰富的表面官能团以及良好的生物相容性等特点。本发明的中空多聚糖微球固定化酶的制备方法适合各种水解酶。
具体实施例方式
实施例l、中空多聚糖微球固定化酶
a)中空多聚糖微球的制备
称椭球形啤酒酵母(Sacc/2aram^^"wWw'fle) 5 g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后将酵母悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在18(TC下加热18h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在2(TC下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察中空多聚糖微球，中空
多聚糖微球为直径2-3微米的球形。
b)中空多聚糖微球固定化酶的制备
取步骤a)球形中空多聚糖微球5g，分散于100mL 20%环氧氯丙垸的碱性溶液中，振荡12小时后用去离子水彻底洗净残留的环氧氯丙烷；取去离子水清洗后的中空多聚微球O. lg，均匀分散到4mL0.06。/。的e—葡萄糖苷酶溶液中，28'C振荡10小时，离心分离沉淀，沉淀用醋酸缓冲液清洗，去除中空多聚糖微球上非共价结合的酶蛋白，获得中空多聚糖微球固定化酶。
以水杨素为底物测定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力的测定方法如下将25mg中空多聚糖微球固定化酶和lmL经过预热的5g/100ml的水杨素溶液(由pH4.8醋酸缓冲液配制)混合，振荡条件下5(TC水浴保温30分钟后迅速离心，向分离得的上清液中加入lmLDNS (3， 5-二硝基水杨酸)试剂，煮沸5分钟，冷至室温后在540nm下测定其吸光度。1个单位酶活(IU)指每分钟水解得到1微摩尔葡萄糖所需的酶量。实验重复3次。
为了测定中空多聚糖微球固定化酶的稳定性，连续使用中空多聚糖微球固定化酶300小时，每隔一定时间回收中空多聚糖微球固定化酶，测定其酶活，酶活测定方法同上。实验重复3次。
酶活力和酶的稳定性测定的结果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力为4. 1U/g载体，中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时后酶活力保留72. 4%，说明中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时酶活力未出现明显下降。
实施例2、中空多聚糖微球固定化酶
a) 制备中空多聚糖微球
称椭球形啤酒酵母(5"acc力aro/^ces cerew'si'ae) 5 g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后将酵母悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在180"C下加热18h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20'C下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球为直径2-3微米的规整的球形。
b) 制备中空多聚糖微球固定化酶
取步骤a)的球形中空多聚糖微球5g，分散于100mL 1%环氧氯丙垸的碱性溶液中，振荡12小时后，用去离子水彻底洗净残留的环氧氯丙烷；将洗后的中空多聚糖微球用0.01M氨水处理9小时，处理后离心分离沉淀，再用O. 1%戊二醛处理沉淀3小时，得到的中空微球用去离子水洗净后取0. lg，均匀分散到4mL 0. 06%的e—葡萄糖苷酶溶液中，28i:振荡10小时，离心分离沉淀，沉淀用醋酸缓冲液清洗，洗去中空多聚糖微球上非共价结合的酶蛋白，获得中空多聚糖微球固定化酶。
以水杨素为底物测定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力和酶的稳定性的测定方法同实施例1。实验重复3次。
酶活力和酶的稳定性的测定结果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力为8. 1U/g载体，中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时后酶活力保留77. 5%，说明中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时酶活力未出现明显下降。
实施例3、中空多聚糖微球固定化酶
a) 中空多聚糖微球的制备
称酵母菌椭球形啤酒酵母(5"acc力ar咖yces cerew'w'3e) 5g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后向酵母悬浮液中加入稀盐酸，使其终浓度为O. 1mol/L，在将上述悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在15(TC下加热24h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在2(TC下干燥24 h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球为直径2-3微米的坛子状。
b) 中空多聚糖微球固定化酶的制备
取步骤a)的坛子状中空多聚糖微球5g，分散于100mL50X环氧氯丙烷的碱性溶液中，振荡12小时后用去离子水彻底洗净残留的环氧氯丙烷；将洗后的中空多聚糖微球用2M氨水处理9小时，处理后离心分离沉淀，再用20%戊二醛处理沉淀3小时，得到的中空微球用去离子水洗净后，取O. lg，均匀分散到4raL 0.06%的0一葡萄糖苷酶溶液中，28C振荡10小时，离心分离沉淀，沉淀用醋酸缓冲液清洗，洗去中空多聚糖微球上非共价结合的酶蛋白，获得中空多聚糖微球固定化酶。
以水杨素为底物测定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力和酶的稳定性的测定方法同实施例1。实验重复3次。
酶活力和酶的稳定性的测定结果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力为10. 5U/g载体，中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时后酶活力保留80. 7%，说明中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时酶活力未出现明显下降。
实施例4、中空多聚糖微球固定化酶a) 中空多聚糖微球的制备
称酵母菌椭球形啤酒酵母(5"3cc力a^ro/z7/cescarew'5^3e) 5g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后向酵母悬浮液中加入戊二醛，使其终浓度为0.05mol/L，在将上述悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在240。C下加热10h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在2(TC下干燥24 h。干燥后即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球为直径3-5微米的苹果形。
b) 制备中空多聚糖微球固定化酶
取步骤a)的苹果形中空多聚糖微球5g，分散于100mL20X环氧氯丙垸的碱性溶液中，振荡12小时后用去离子水彻底洗净残留的环氧氯丙烷；将洗后的中空多聚糖微球用0. 5M氨水处理9小时，处理后离心分离沉淀，再用1%戊二醛处理沉淀3小时，得到的中空微球用去离子水洗净后，取O. lg，均匀分散到4mL 0.06%的0一葡萄糖苷酶溶液中，28t:振荡10小时，离心分离沉淀，沉淀用醋酸缓冲液清洗，洗去中空多聚糖微球上非共价结合的酶蛋白，获得中空多聚糖微球固定化酶。
以水杨素为底物测定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力和酶的稳定性的测定方法同实施例1。实验重复3次。
酶活力和酶的稳定性的测定结果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力为11. 4U/g载体，中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时后酶活力保留83. 5%，说明中空多聚糖微球固定化酶连续使用300小时酶活力未出现明显下降。
权利要求
1、一种固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的载体，其特征在于所述载体是中空多聚糖微球；所述中空多聚糖微球按照如下方法制备在恒温条件下，将酵母在液体中进行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒温的温度选自150-240℃之间的任一温度。
2、 根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于所述酶为水解酶。
3、 根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于所述酵母在液体中的浓度为10-200g/L。
4、 根据权利要求3所述的固定化酶，其特征在于所述恒温的时间为10-24小时。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述酵母为球形或椭球形；所述酵母为死的或活的。
6、 根据权利要求5所述的固定化酶，其特征在于所述中空多聚糖微球为球形或苹果形或坛子形；所述中空多聚糖微球为球壁完整的中空微球或球壁上有一个孔的中空微球。
7、 根据权利要求1至6中任一所述的固定化酶，其特征在于所述液体为水或水溶液；所述水溶液中的溶质选自下述10种物质中的至少一种盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化钠、氯化钾、醋酸钾、乙醇、乙醛和戊二醛；所述水溶液中溶质的终浓度为0. Ol-O. lmol/L。
8、 权利要求1至7中任一所述的固定化酶的制备方法，包括如下步骤1) 在碱性条件下，将所述载体用环氧氯丙垸水溶液处理，使所述载体表面带有环氧基；2) 将步骤l)得到的载体与所述酶溶液混合，使所述酶与所述载体形成固定化酶。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，在步骤1)和步骤2)间还包括如下步骤a) 将步骤l)得到的载体用氨水进行处理，使其表面带有氨基；b) 将步骤a)中得到的载体用戊二醛水溶液处理。
10、 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述环氧氯丙垸水溶液的体体积百分比浓度为1-50%;所述氨水的浓度为0. 01-2. 0mol/L;所述戊二醛水溶液的体积百分比浓度为O. 1-20%。
全文摘要
本发明公开了一种中空多聚糖微球固定化酶及其制备方法。该固定化酶，包括酶和载体，所述载体是中空多聚糖微球；所述中空多聚糖微球按照如下方法制备在恒温条件下，将酵母在液体中进行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒温的温度选自150-240℃之间的任一温度。本发明还公开了该中空多聚糖微球固定化酶的制备方法。本发明的中空多聚糖微球固定化酶的制备方法中制备载体的原料来源广泛，载体的制备、表面修饰和酶的固定化技术简单易行，且载体具有高比表面积、大内部空间、丰富的表面官能团、以及良好的生物相容性等特点。
文档编号C12N11/00GK101643727SQ20081011776
公开日2010年2月10日 申请日期2008年8月5日 优先权日2008年8月5日
发明者倪德志, 周克斌, 森 杨, 雷 王 申请人:中国农业大学