专利名称：一种发酵生产胰岛素原的补料培养基及补料培养优化方法
技术领域：
本发明属于微生物工程领域，涉及一种发酵生产胰岛素原的补料培养基，还涉及该培 养基的补料培养优化方法。
背景技术：
糖尿病是一种慢性内分泌疾病，胰岛素作为糖尿病的特效药，用药量大，每天临床使 用量为几毫克，且用药时间长，胰岛素依赖型糖尿病患者一般都终生使用胰岛素。但在1982 年以前，人类应用的全部胰岛素皆来源于动物。从动物脏器提取的猪、牛胰岛素受脏器来 源的限制，而且由于一级结构的差异，带来免疫原性问题，并可能导致一系列的副作用。 1982年世界上第一个重组药物人胰岛素(reeombinanthumnainsulin， ht)l问世，由于重组
人胰岛素在一级结构上与人体内分泌的胰岛素完全相同，疗效确切，动物胰岛素就逐渐被 基因工程人胰岛素所取代，而且重组人胰岛素己成为占重组药物市场份额最大的产品。但 是受经济水平和研发水平的限制，目前我国临床上使用多为结晶猪胰岛素的制剂，这与发 达国家在用药水平上还存在相当大的差距。我国加入WTO以后，生物制药产业面临巨大的 冲击，国外的基因工程药物大举进入国内市场，因此研制具有技术或价格优势的国产基因 工程药物是一个十分紧迫的任务。
随着社会逐步进入老龄化，我国糖尿病患者的数目一直呈上升趋势，据专家预计，到 2010年我国糖尿病患者将达6300万，对胰岛素的需求将会越来越大。因此加快研制国产 基因工程人胰岛素具有明显的社会效益和经济效益。目前，市售基因工程药物的价格一般 较普通药物偏高，尽管基因工程人胰岛素市场售价远较其它基因工程药物低，但人胰岛素 的用药量大，特别是对胰岛素依赖型糖尿病患者而言，仍是一个难以承受的负担。对于生 产厂家而言，由于复杂的下游处理(变性、复性、酶切及多种层析过程)等原因，人胰岛素 的生产成本一直居高不下，使得降价的空间很小。因此通过技术改进，工艺优化降低基因 工程人胰岛素的生产成本成为十分迫切的要求。
胰岛素类产品按照生产来源分为动物胰岛素、半合成胰岛素和DNA重组生物合成胰岛 素。与这三种分类相对应的就是胰岛素的三种生产方法。(1)动物胰岛素是由动物(牛、猪) 胰脏提取的一种蛋白质生物制剂，所含杂质不仅对人体具有抗原性，还影响胰岛素的生理
3作用，即使多次重结晶仍含少量杂质，目前欧美各国都采用高纯度胰岛素，我国已能制备 高纯胰岛素，但因受原料限制，产量有限。(2)半合成人工胰岛素。和人胰岛素最相近的猪
胰岛素，e链30位氨基酸，人为苏氨酸而猪为丙氨酸，现已通过生化方法将猪胰岛素e
链第30个氨基酸丙氨酸用苏氨酸置换，即半合成人胰岛素，使之更合乎人体需要而减少抗 体产生的机会。(3)重组人胰岛素，即应用DNA重组技术，将人胰岛素基因插入细菌或酵 母的DNA，由微生物合成人胰岛素，再经纯化处理即得到重组人胰岛素。目前，重组人胰 岛素的生产中应用的宿主表达系统主要有大肠杆菌和酵母表达系统。用.Eocli表达胰岛素 有两个优点一是表达量高，表达产物可达到.Eocli总蛋白质的20%-30%:二是表达产物为 不溶解的包涵体，经过洗涤后即可大大提高表达产物的纯度，因而有利于下游纯化。其缺 点是表达出的胰岛素没有生物活性，需要复性。
目前，国内外的研究工作者将主要的精力集中在如何优化提取纯化工艺来提高胰岛素 原的表达量，而对大肠杆菌发酵过程中的补料分批培养环节研究很少。已经公布的 CN101029323、 CN1042378、 CN1075983分别针对酵母菌、链霉菌及大肠杆菌生产胰岛素前体 的发酵培养方法，并不涉及补料培养优化方法。如L deMare'等在Feeding strategies:for E. coli fermentations demanding an enriched environment(Bioprocess Biosyst Eng ,2007,30:13-25)中歹!j 举了多种补料培养方法，多以补碳水化合物、酵母粉等氮源、氨基酸等为主。其中ZawadaJ 禾口Swartz J等在Maintaining rapid growth in moderate density Escherichia coli fermentations. (Biotechnol Bioeng， 2005, 89:407415)中陈述了补加碳源对大肠杆菌发酵的意义； A-kesson'M等在Avoiding acetate accumulation in Escherichia coli cultures using feedback control of glucose feeding(BiotechnoI Bioeng，2001,73:223-230指出了添加葡萄糖和微量元素 对大肠杆菌培养带来的益处。
发明内容
本发明对人胰岛素原的发酵补料环节进行了综合考虑，着力于提高大肠杆菌在发酵阶 段的表达量，从而提高人胰岛素的最终收率，优化了生产工艺，建立了一套高表达高收率 的重组人胰岛素发酵补料生产工艺。
为了达到本发明的目的，发明人另辟蹊径，公开了一种适用于大肠杆菌发酵胰岛素原 的补料培养基，该补料培养基含有用于动物细胞培养的DMEM-高糖培养基(含L-谷氨酸胺， 不含丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)以及其它常规的用于大肠杆菌发酵的组分。其中，其他常 规的用于大肠杆菌发酵的组分为蛋白胨,酵母粉，硫酸铵和甘油。另外，本发明的发明人针对目前大肠杆菌表达胰岛素原过程中发酵密度小、表达量低 等不足，提出了一种将上述补料培养基应用于大肠杆菌发酵胰岛素原中的分批补料优化方 法，即将上述补料培养基分批流加到发酵液中，其实时待调整的补料流加速率的确定是根 据如下技术方案实现的
根据微生物生长动力学，实时待调整的补料流加速率是通过最初补料流加速率和下一 时刻的比生长速率确定的，而本发明人通过大量的试验研究发现，当最初补料流加速率在
100 400ml h—'时，菌体的外源蛋白表达量具有显著增加，优选最初补料流加速率为200 400ml h一1，进一步优选为200 ml h_1。
本发明涉及的补料分批培养优化方法中，比生长速率是通过最终发酵菌体密度与实时 测样菌体密度的差值和发酵周期来确定的，具体步骤为-
(1) 确定最终大肠杆菌的发酵菌体密度和发酵周期；
(2) 补料流加开始后，每隔l小时取样一次，检测菌体密度，得到实时检测菌体密度；
(3) 根据最终发酵菌体密度与实时测样菌体密度的差值和发酵周期，计算出下一时刻比生长 速率。
在细胞生物技术领域，醒EM-高糖培养基是用来培养动物细胞的。本发明人意外地发现， 将函EM-高糖培养基作为补料培养基的一种组分用来发酵大肠杆菌，取得了意想不到的效 果。为了使所述新型补料培养基的发酵效果得到增强，相应地，本发明通过大量试验研究 出了补料分批培养的优化方法，从而使胰岛素原表达量有了很大提高。通过实施例可以看 出，与常规补料培养基相比，胰岛素原表达量提高10%以上。根据附图l可以看出，实施 例1-4相比于实施例5-8，表达出目的蛋白量显著增加，杂蛋白如多聚体等蛋白所占比例 逐渐减少，经过伯乐凝胶成像电泳数据分析系统分析，采用本发明的补料培养基并结合本 发明的补料优化方法发酵所表达的蛋白占总蛋白比例为35.3%，而只采用本发明的补料培 养基或只采用其补料优化方法，或按照常规的补料培养基和补料方法所表达的蛋白占总蛋 白比例为23.9%，即前者比后者蛋白表达量提高11.4%，从总体上提高了收率。本发明改善 了高密度培养大肠杆菌时表达胰岛素原时表达量低的现状，具有很好的工业实用价值。
本发明与以往技术相比，还具有以下的优点由于DMEM高糖培养基已经商品化，便于 控制质量标准，含有碳源、氮源等养料，能够提供给大肠杆菌足够营养满足其生长以及表 达外源蛋白的需要；而且该技术通用性强，大大提高了大肠杆菌表达胰岛素前体等外源蛋 白的表达量。通过电泳检测最终表达量，补料流速便于控制，从而更方便地控制各项参数 以及菌体生长速率。
附图1补加DMEM培养基前后胰岛素原表达量(SDS-PAGE电泳即比较
①-④分别为实施例l-4的胰岛素原表达量⑤高分子量marker⑥中低分子量marker ⑦-⑩分别为实施例5-9的胰岛素原表达量。胰岛素原分子量为9000，箭头所指方向就是 目的蛋白胰岛素原的位置。电泳采用不连续SDS-PAGE电泳，具体方法见郭亮君编著的蛋白 质电泳实验技术(北京科学出版社，1999， 134_136),其中浓縮胶选用5%，分离胶选 用15%。
具体实施方案
下述实施例仅仅更加详尽地描述本发明的具体实施方式
，对本发明保护的范围并不构 成任何限制。
实施例l
一，发酵规模及各项参数
发酵罐体积为50L，大肠杆菌宿主菌BL21 (DE3)PlysS，将活化好的菌种接种到LB培养 液中，37°C培养10小时，作为发酵罐用种子备用。配制发酵液培养基，补足水后121°C 灭菌30min后降温至最适生长温度一37。C。按照10%接种量将种子接种在50L发酵罐中， 根据基因工程菌的生长规律，按照常规方法培养，最初调节转速250rpm，温度保持在37°C， 空气流量调节在10L h—、 pH值控制在7.0左右，溶解氧一直保持在40%以上。发酵最终 0Ds。。定为69，发酵周期定为19小时。培养两个小时后取样检测菌体密度，继续增大转速至 350 rpm，始终保持溶解氧在40%以上，维持一定的生长速率。待转速调至600rpm，培养 至6个小时后，检测菌体密度，发酵液的600nm吸光值已经达到15.0，菌体细胞器合成和 生长速率受限，加入自制微量元素溶液1L，此时发酵液变为微红色，生长速率继续加快。 微量元素逐渐被消耗殆尽，发酵液变为乳白色，大肠杆菌生长减慢，乙酸产量降低，此时 溶解氧开始瞬时升高，瞬间PH值升至7. 8以上，开始补入含有DMEM-高糖(含L-谷氨酸胺， 不含丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)细胞培养基的补料培养基，补料流加速率为200ml*h—、 控制氧气流量、空气通量，使溶解氧继续维持在40%以上。
发酵液培养基配方蛋白胨5.75g/L,酵母粉5.45g/L，十二水合磷酸氢二钠25g/L, 磷酸二氢钾3.00 g/L，氯化钠0.75 g/L，氯化钾0.50 g/L,氯化铵1.00 g/L，甘油
61.50mL/L，硫酸镁1.05g/L ，补足水分，发酵罐内灭菌备用。
自制微量元素溶液配方五水合硫酸锰0.001g/L，六水合氯化钴0.(K)4g/L， 二水合 钼酸钠0. 002g/L，氯化锌0. 002g/L,硼酸0. 0005 g/L,七水合硫酸亚铁0. 02 g/L， 二 水合氯化钙0. 02 g/L，五水合硫酸铜0. 001 g/L。
补料培养基配方蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L,硫酸铵50g/L,甘油200mL， DMEM(高 糖)培养基(含L-谷氨酸胺，不含丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)200mL,补足水至lOOOmL,灭菌 后备用。
(二) 比生长速率A的计算
确定最初补料流加速率V。=200ml h—、此时发酵时间t。=10h，测得菌体密度X。(0D600) =38。 pH值和溶解氧瞬间升高为7. 7和69%时加入lg IPTG (异丙基-P -D-硫代半乳糖苷) 诱导，15分钟后继续补入含有L-谷氨酰胺的函EM(高糖)细胞培养基，调节空气、氧气流 量以及补料流速，保持溶解氧维持在40%以上，使菌体生长和胰岛素原表达能够保持一致。
按照微生物生长动力学，P=dx/dt/X，单位时间为lh，比生长速率为A，则 Xt-X。(l+K)，X^Xi(l+m)……以此类推，Xn=Xn—Jl+K—》。
预计t。后比生长速率为恒定值，即^=^=……则X = X。(l+MtOn， Xn =69， n =T-1。，可 求得Mo。
K= (X /Xo) 1/n-1= (69/38)"(19—1。)-1=0.0685259，同样地，当下一取样时刻，继续设时间 为t。，所测得菌体密度为X。，可求得下一时刻的比生长速率Mo。
(三) 根据比生长速率Mo，得出补料流加速率 根据微生物动力学中提到的底物消耗方程，AS二na+n^X+ni3AP，其中mi、 m2、 1113为比
例系数，考虑到诱导期单位时间内产物增加和菌体量增加都很少，则AS^mJ，因时间单 位为lh，所以AS即为补料流加速率。还是以取样时间t。=10h为例，所测得菌体密度X。 (0D6。。=38)，补料流加速率为AS。二V。二200ml h_1，比生长速率K为0.0685259，则下一时 间底物消耗ASpmA， ASyAS^Xyx^(l+K)，可以得到下面方程 AS,二AS。(1+Md) =200X (1 + 0.0685259) =213.70518 ml h—'。 同样地，在下一取样时段，设时间为U所测得菌体密度为X。，可求得再下一时段的AS,。
(四) 根据实时计算的补料流加速率补入改进后的补料培养基，继续培养至放罐 根据比生长速率计算出的补料流加速率，能够在菌体不同生长时期及时地调整补料流
速，尽可能地提高菌体生长速率，增加胰岛素原表达量，使菌体本身生长与外源蛋白表达 相一致。在发酵至19小时后停止补料，待溶解氧反弹后发酵结束，放出发酵液离心收集菌体，检测蛋白表达量。 实施例2
确定最初补料流加速率V。二200ml h—、其他参数和步骤均与实施例1 一致。 实施例3
确定最初补料流加速率V。二300ml h—、其他参数和步骤均与实施例1 一致。 实施例4
确定最初补料流加速率V。^400ml h—、其他参数和步骤均与实施例1 一致。 实施例5
补料培养基为蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L，硫酸铵50g/L,甘油200mL，补足水至 1000mL,灭菌后备用。其他参数和步骤均与实施例1 一致。
实施例6
补料培养基为蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L,硫酸铵50g/L,甘油200mL，补足水至 lOOOmL,灭菌后备用。其他参数和步骤均与实施例4 一致。
实施例7
补料培养基与实施例1 一致。根据常规经验培养10个小时后补料；补料速率固定为 300ml h—'。
实施例8
补料培养基为蛋白胨200g/L,酵母粉200g/L,硫酸铵50g/L,甘油200mL，补足水至 lOOOmL,灭菌后备用。根据常规经验培养10个小时后补料；补料速率固定为300ml *h—权利要求
1.一种发酵生产胰岛素原的补料培养基，其特征在于，它含有DMEM-高糖培养基以及其它用于发酵的组分，其中DMEM-高糖培养基含L-谷氨酸胺，不含丙酮酸钠和碳酸氢钠。
2. 如权利要求1所述的补料培养基，其特征在于，其它用于发酵的组分为蛋白胨，酵母粉， 硫酸铵和甘油。
3. —种将权利要求1所述补料培养基应用于发酵生产胰岛素原中的补料优化方法，其特征在 于，将所述补料培养基分批流加到发酵液中，其中实时补料流加速率是通过最初补料流加 速率和下一时刻的比生长速率确定的。
4. 如权利要求3所述的补料优化方法，其特征在于，最初补料流加速率为100 400ml h一1。
5. 如权利要求3所述的补料优化方法，其特征在于，最初补料流加速率为200 400ml h—、
6. 如权利要求3所述的补料优化方法，其特征在于，最初补料流加速率为200ml 『1。
7. 如权利要求3所述的补料优化方法，其特征在于，比生长速率是通过最终发酵菌体密度与 实时测样菌体密度的差值和发酵周期来确定的，具体为(1) 确定最终大肠杆菌的发酵菌体密度和发酵周期；(2) 补料流加开始后，每隔1小时取样一次，检测菌体密度，得到实时检测菌体密度；(3) 根据最终发酵菌体密度与实时测样菌体密度的差值和发酵周期，计算出下一时刻比生长 速率。
全文摘要
一种发酵生产胰岛素原的补料培养基及补料培养优化方法，属于微生物工程领域。本发明针对目前大肠杆菌表达胰岛素原过程中发酵密度小、表达量低等不足，提出了一种含有DMEM-高糖培养基的补料培养基，以及一种将这种补料培养基应用于大肠杆菌发酵胰岛素原中的分批补料优化方法。本发明涉及的培养方法工艺易于控制，通用性强，弥补了大肠杆菌表达胰岛素前体的补料培养基和补料培养优化方法。
文档编号C12P21/04GK101643764SQ20081021040
公开日2010年2月10日 申请日期2008年8月9日 优先权日2008年8月9日
发明者强红刚, 赵志全, 钟传青 申请人:鲁南制药集团股份有限公司