专利名称：：动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及动物华支睾吸虫病的基因学鉴定，特别是涉及动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
：华支睾吸虫病是由后睾科支睾属的华支睾吸虫(ao"orc/^w'"era/s)寄生于犬、猫、猪等动物及人胆管内所引起的一种重要的人兽共患寄生虫病，俗称肝吸虫病。华支睾吸虫寄生在淡水螺、淡水鱼、淡水虾、犬、猪、牛、鼠、家兔、豚鼠、狐狸和家禽等动物，人为终末宿主，本病可使肝脏肿大并导致其他肝病变，病情多呈慢性经过，临床上可见精神沉郁，食欲减退和下痢等症状，重者可致肝硬化甚至癌变，少数儿童和青少年患者可致侏儒症，并发症多达21种，对人类健康的影响不容忽视。华支睾吸虫病呈地方性流行，在东南亚国家较常见，该病在我国已有很长的历史，流行广泛，目前华支睾吸虫病有逐年上升的趋势，其发生和流行除了跟人们的一些不良饮食习惯如生食鱼虾等有关系外，其中间宿主(淡水螺、淡水虾等)以及保虫宿主(保虫宿主有猫、犬、猪、牛、鼠、狐狸和家禽等动物)在其流行过程中是十分重要和关键的环节。分子生物学方法已开始应用于华支睾吸虫的分子鉴定上。PCR以其高度的特异性和敏感性，已广泛应用于分子生物学研究的各个领域，尤其对各种病原体的检测和疾病的诊断中。目前，在寄生虫学领域，用于疾病诊断和虫体检测的PCR方法很多，如常规PCR、反转录PCR、套式PCR、免疫磁性捕获PCR、荧光定量PCR(FQ-PCR)等。Le(LeTH，VanDeN，BlairD,etal.ClonorchissinensisandOpisthorchisviverrini:developmentofamitochondrial-basedmultiplexPCRfortheiridentificationanddiscrimination.ExpParasitol.2006,112(2):109-14)通过设i十两对线粒体DNA引物，用多重PCR方法成功对华支睾吸虫和麝猫后睾吸虫进行鉴别诊断，能检测到最低样品DNA量为0.78ng;Parvathi等(ParvathiA,JieyuanL，IddyaK,etal.C7o"wr/^w'"e脂、Developmentandevaluationofanestedpolymerasechainreaction(PCR)assay.ExpParasitol,2007,115(3):291-295)首先对华支睾吸虫的基因组用随机引物进行扩增测序，选择合适的部位设计两对引物进行巢式PCR，结果表明，该方法具有很好的敏感性和特异性，能检测到鱼肉中最低华支睾吸虫囊呦的DNA为10'5ng，有望在华支睾吸虫鱼的流行情况调查以及动物的粪便检査中得到应用。人体华支睾吸虫病诊断技术的研究一直是医学研究中的一个热点，已建立了多种诊断检测方法，包括虫卵检查、皮内试验(IT)、B超、CT、间接血凝免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体ELISA(McAb-ELISA)以及免疫胶体金方法等，但在兽医领域，均未见应用于动物华支睾吸虫病的诊断，目前动物华支睾吸虫病主要还是依靠粪检患畜虫卵的方法进行流行病学调查，因为此种方法敏感性不高，极易漏检，也易误诊。从粪便中提取DNA—直是个难点，粪便的成分复杂，含有各种各样抑制PCR的物质，如胆盐、多糖等。目前能从粪便中提取DNA的方法要么就是需要繁琐的步骤，如免疫磁性分离法、梯度离心法、荧光激活细胞分选术等，要么就是需要用到昂贵的DNA提取试剂盒。如能用快速、简便的方法从粪便中提取到寄生虫的DNA，将会有重大的意义，能对疾病进行及早的诊断，预防疾病的发生。PCR检测方法敏感性高、一次检测大量样品、避免主观偏差等优越性预示着它在特异性诊断、流行病学调查和药物治疗监控等方面有着广阔的应用前景。内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)是核糖体DNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括第一、第二内转录间隔区(ITS-l和ITS-2)两段序列，ITS序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而十分适合进行各种分子操作。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过对动物华支睾吸虫病ITS序列进行分析，设计得到的能专一性鉴别动物华支睾吸虫病的动物华支睾吸虫病特异性检测引物。本发明的另一个目的是提供一种运用上述动物华支睾吸虫病特异性检测引物对动物华支睾吸虫病进行简便、高效的特异性检测的方法。本发明的另一个目的是提供含有上述动物华支睾吸虫病特异性检测引物的试剂盒。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的本发明人根据华南农业大学兽医寄生虫研究室已测得的华支睾吸虫ITS序列，还有来自GenbankTM的猫后睾吸虫和部分麝猫后睾吸虫ITS序列，以及其它一些寄生于肝脏的吸虫的ITS序列进行比对，设计出能专一性鉴别动物华支睾吸虫病的特异性引物，通过PCR扩增来鉴定动物华支睾吸虫病。上述特异性引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。采用上述特异性引物，用常规的PCR方法即可实现动物华支睾吸虫病的特异性检测。一种动物华支睾吸虫病特异性检测方法，包括如下步骤(1)华支睾吸虫囊呦DNA的提取或虫卵DNA的提取；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用上述动物华支睾吸虫病特异性检测引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)进行常规PCR扩增；(3)PCR扩增反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，紫外光下观察特异性扩增条带，阳性结果会出现特异性扩增条带，阴性结果则不会出现；上述步骤(2)中，PCR扩增条件采用常规操作即可实现本发明；实际应用时还可选择如下PCR扩增体系总体系为2.5ml，含有上述动物华支睾吸虫病特异性检测引物，终浓度各为0.5pmol4d;pH8.3的Tris-HCl,终浓度为10mM;KC1，终浓度为50mM，4个dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，终浓度各200iaM，MgCl2，终浓度为2.5mM;TaqDNA聚合酶按每个PCR反应含0.625U加入。上述步骤(3)中，PCR扩增反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，紫外光下观察特异性扩增条带，以华支睾吸虫阳性DNA作为阳性对照品，以无DNA超纯水作为阴性对照，待检样品若观察到一条与华支睾吸虫阳性对照同一位置出现的400bp的片段，而该位置处阴性对照没有条带，则说明该待测样品感染有华支睾吸虫病。针对上述检测方法，本发明人从MgCl2的浓度和退火温度两方面进行调整来优化PCR扩增条件，MgCl2的浓度梯度分别为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM和3.5mM、4.0mM，退火温度梯度分别为50°C、54°C、58°C、61。C和68°C，以期获得本发明特异性引物进行PCR扩增获得特异性片段的最佳Mg^浓度和最佳退火温度，经试验确定，最佳退火温度为61°C，MgCl2的浓度为2.5mM，循环数选择为30个循环。上述PCR扩增的最佳反应条件为94'C预变性5分钟；94。C变性30秒、61'C退火30秒、72t延伸30秒，30个循环；72'C后延伸5分钟。采用上述动物华支睾吸虫病特异性引物，制备检测试剂盒，可使得动物华支睾吸虫病的检测更加快速、便利。一种动物华支睾吸虫病特异性，包括如下部分a.PCR反应液总体系为2.5ml，含有上述动物华支睾吸虫病特异性检测引物，终浓度各为0.5pmol4d，终浓度为10mM的pH8.3的Tris-HCl，终浓度为50mM的KC1，4个dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，终浓度各200pM和终浓度为2.5mM的MgCl2;b.阳性对照品华支睾吸虫阳性DNA，lOOpl;c.阴性对照品无DNA超纯水，100pl。上述检测试剂盒还包括TaqDNA聚合酶5U/)il，每个PCR反应含0.625U加入(12.5jil)。上述检测试剂盒还可以包括DNA裂解液含有100mM的NaCl、10mM的Tris-Cl(pH8.0)、25mM的EDTA(pH8.0)、1%(质量/体积，W/V)的十二烷基磺酸钠(SDS)和1.7pg/pL的蛋白酶K。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明根据动物华支睾吸虫病的ITS区序列数据库设计的高度特异性检测引物，可以准确地鉴定动物华支睾吸虫病；2.本发明采用特异性检测引物配制成的检测试剂盒，其成本低、准确性高，操作简便快速，有利于大规模推广；3.本发明提供的检测方法简单高效，通过特异性检测引物，通过简单的PCR，可方便地检测动物华支睾吸虫病；4.本发明对PCR扩增条件进行了优化，选择退火温度为6rC，MgCl2的浓度为2.5mM，循环数选择为30个循环，从而可提高整个PCR反应的特异性，取得更好的检测效果；5.本发明应用华支睾吸虫的ITS重复DNA片段作为遗传标记，建立了用于动物华支睾吸虫病诊断的快速、特异、敏感的PCR方法；6.本发明试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，可用于动物华支睾吸虫病的诊断和流行病学调査。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释，但具体实施例并不对本发明作任何限定。实施例1动物华支睾吸虫病特异性引物的特异性试验本实施例选择经过DNA有效性验证的11阴性对照寄生虫样品日本血吸虫、大片吸虫、肝片吸虫、东毕吸虫、犬弓首蛔虫、犬钩口线虫、猫弓首蛔虫、猪毛首线虫、食道口线虫、猪蛔虫和麝猫后睾吸虫。本实施例的阳性对照是华支睾吸虫阳性DNA。以上述11个对照寄生虫样品DNA各lpL为模板，采用本发明的动物华支睾吸虫病特异性引物(上游引物核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，按照如下PCR反应条件进行特异PCR扩增，同时设空白对照(超纯水)和阳性对照。PCR扩增条件为94"C预变性5分钟；94'C变性30秒，61"C复性30秒，72'C延伸30秒，30个循环；72'C后延伸5分钟。PCR产物在P/。TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。结果显示华支睾吸虫DNA阳性对照扩增出约400bp的条带，而上述ll种阴性对照样品除麝猫后睾吸虫外，其他10种对照寄生虫样品和空白对照均无条带出现。当扩增条件改为退火温度为68"C、MgCl2的浓度为1.0mM时，结果显示仅有试剂盒华支睾吸虫DNA阳性对照扩增出约400bp的条带，而扩增不出麝猫后睾吸虫，其它10个对照样品也无条带出现。麝猫后睾吸虫主要分布在泰国、老挝、越南、马来西亚和印度，猫后睾吸虫主要流行于俄罗斯及东欧等地区。由此说明，本发明所设计的华支睾吸虫病特异性检测引物能扩增出华支睾吸虫病，条带明亮清晰，与其它虫种无交反应，可用于我国华支睾吸虫的PCR流行病学调查。实施例2试剂盒的制备本实施例的试剂盒由如下组分组成a.DNA裂解液30ml:含有lOOmM的NaCl、pH8.0的lOmM的Tris-Cl、pH8.0的25mM的EDTA、1%(W/V)的SDS和1.7昭/pL的蛋白酶K;b.PCR反应液(100个反应，25pL/反应)，2.5ml:含有动物华支睾吸虫病特异性引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，终浓度各为0.5pmol/nl;终浓度10mM的Tris-HCl(pH8.3)，终浓度50mM的KC1，终浓度各200pM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度2.5mM的MgCl2;c.阳性对照品华支睾吸虫阳性DNAlO(Hil;d.阴性对照品无DNA超纯水lOOpl;e.TaqDNA聚合酶，5U/pl，12.5^1。实施例3试剂盒的敏感性试验用核酸蛋白测定仪测定华支睾吸虫代表性成虫样品的DNA浓度，然后将DNA原液等倍稀释成10"、l(T2、10'3、10—4、l(T5、10_6、10—7和10'8八个稀释度。分别取各稀释度的模板DNAlpl，采用实施例2制备所得试剂盒，PCR总反应体系为25pl，具体组分如表l所示，94'C预变性5分钟；94"C变性30秒，61'C复性30秒，72'C延伸30秒，30个循环；72"C后延伸5分钟。同时设空白对照，确定特异弓I物能检测到的最低DNA浓度。表lPCR扩增体系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，以确定其敏感性。试验结果表明该PCR检测方法敏感性高，最低能检测到1.03pgDNA的华支睾吸虫。实施例4试剂盒的保存期试验取实施例2制备所得试剂盒，将其分别在4'C和-2(TC保存1个月、3个月、6个月、9个月，然后用保存条件不同的试剂盒对已知样品进行检测，扩增条件同实施例3，结果表明实施例1制备所得试剂盒可在4°C(Taq酶除外，须-20'C保存)和-2(TC长期保存，在试验周期的9个月内，在合适保存条件下阳性样品均能扩增出目的亮带，而阴性对照无条带出现。实施例5试剂盒在华支睾吸虫病粪便样品诊断中的应用1.样品26份华支睾吸虫阳性的猫粪。2.DNA的提取取0.1克待检粪便于1.5mlEppendorf管中，加入含有2%的TritonX-100和0.1M的氢氧化钾的溶液lml室温下作用10min，其间不断摇匀；然后10000rpm离心2min，去上清，重复前面的步骤清洗两次；离心去上清后加入1.2ml饱和硫代硫化钠溶液，混匀，14000rpm离心5min;此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中；分别吸取200pl上清到另一个1.5mlEppendorf管中，加入1.21111双蒸水，12000rpm离心2min;去上清，保留100^1左右液体，用移液器吹打使沉淀与液体混匀；然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸水，12000rpm离心2min;去上清，再加入1.2ml双蒸水，如此重复35次。最后离心去上清，保留30pl液体，加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡1min后瞬时离心，沸水中煮5min，最后10000rpm离心lmin，取3pl上清PCR扩增。3.PCR扩增应用实施例2制备所得试剂盒对上述样品进行PCR扩增，PCR总反应体系为25pl，具体组分如表l所示，94"C预变性5分钟；94'C变性30秒，61°C复性30秒，72'C延伸30秒，30个循环；72。C后延伸5分钟。同时做阴性对照和阳性对照。4.琼脂糖电泳分析PCR产物在in/。TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。5.扩增产物的DNA序列测定取与试剂盒阳性对照带形一致的代表性PCR产物送上海博尚生物技术有限公司，用相应的种特异引物进行双向测序。测序结果用DNAstar软件进行分析，用BLAST进行序列比对。6.结果与分析26份阳性猫粪样品用以上的方法进行处理后的结果显示，全部都能扩增出400bp大小的特异性条带，证明了所建立的动物华支睾吸虫病诊断的PCR检测方法可用于动物华支睾吸虫病粪便样品的诊断与流行病学调查。实施例6试剂盒在华支睾吸虫病鱼肉样品诊断中的应用1.样品对经镜检确认的12份阳性鱼肉样品和3份阴性样品进行特异PCR鉴定。2.DNA的提取取0.03g待检鱼肉，然后把鱼肉放进1.5mlEppendorf管中，剪碎，加入300^1的DNA裂解液，混匀，置于恒温培养箱中，37'C作用半小时，其间不时摇动离心管，提取DNA;消化好的虫体悬液按Promega试剂盒WizardDNAClean-UpSystem使用说明提取虫体DNA，直接使用或于-2(TC冰箱保存备用。3.PCR扩增应用实施例2制备所得试剂盒对上述样品进行PCR扩增，PCR总反应体系为25jnl，具体组分如表l所示，94"C预变性5分钟；94"C变性30秒，61°C复性30秒，72"C延伸30秒，30个循环；72'C后延伸5分钟。4.琼脂糖电泳分析PCR产物在"/。TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。5.扩增产物的DNA序列测定取与试剂盒阳性对照带形一致的的代表性PCR产物送上海博尚生物技术有限公司，用相应的种特异引物进行双向测序。测序结果用DNAstar软件进行分析，用BLAST进行序列比对。6.结果与分析12份阳性样品全部都能扩增出400bp大小的特异性条带，证明了所建立的动物华支睾吸虫病诊断的PCR检测方法可用于动物华支睾吸虫病鱼肉样品的诊断与流行病学调查。动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒序列表SEQUENCELISTING<110〉华南农业大学-<120>动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒<130〉<160>2<170>Patentlnversion3.5<210〉1<211>20<212〉腿<213>人工序列<400〉1tggcctgactggctggccgg20<210>2<211>20<212>腿<213〉人工序列<400>2cggcaccccacacacataca201权利要求1、一种动物华支睾吸虫病特异性检测引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。2、一种动物华支睾吸虫病特异性检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)华支睾吸虫囊呦DNA的提取或虫卵DNA的提取；(2)用权利要求1所述特异性检测引物采用常规PCR技术进行扩增；(3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外光下观察特异性扩增条带，即可判断样品中是否含有动物华支睾吸虫病。3、根据权利要求2所述特异性检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增条件为94T:预变性5分钟；94'C变性30秒、61。C退火30秒、72°C延伸30秒，30个循环；72"C后延伸5分钟。4、根据权利要求2所述特异性检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增体系为总体系2.5ml，含有权利要求1所述动物华支睾吸虫病特异性检测引物各0.5pmol/pl、10mM的pH8.3的Tris-HCl、50mM的KC1、4个dNTP各200pM、2.5mM的MgCl2和0.625U的TaqDNA聚合酶。5、一种动物华支睾吸虫病特异性检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下部分a.PCR反应液总2.5ml，含有权利要求1所述动物华支睾吸虫病特异性检测引物各0.5pmol4d、10mM的pH8.3的Tris-HCl、50mM的KC1、4个dNTP各200pM和2.5mM的MgCl2;b.阳性对照品华支睾吸虫阳性DNA，lOOpl;c.阴性对照品无DNA超纯水，100|il。6、根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括TaqDNA聚合酶，5U/pl，12.5pl。7、根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括如下部分DNA裂解液30ml:含有100mM的NaCl、10mM的pH8.0的Tris-Cl、25mM的pH8.0的EDTA、1%W/V的十二烷基磺酸钠和1.7pg4iL的蛋白酶K。全文摘要本发明公开一种动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒，该特异性引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO2所示。本发明用上述特异性检测引物对待测模板DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察，阳性结果会出现特异性扩增条带，阴性结果则不会出现。本发明根据动物华支睾吸虫病的ITS区序列数据库设计特异性检测引物，建立了用于动物华支睾吸虫病诊断的快速、特异、敏感的PCR方法，可准确地鉴定动物华支睾吸虫病。本发明的试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，可用于动物华支睾吸虫病的诊断和流行病学调查。文档编号C12N15/11GK101586161SQ20091004039公开日2009年11月25日申请日期2009年6月19日优先权日2009年6月19日发明者唐剑栋,宋慧群,朱兴全,林瑞庆,袁子国,艳邓申请人:华南农业大学