专利名称：：环介导等温扩增技术(lamp)检测鼠疫杆菌的方法
技术领域：
：本发明属于生物检测领域，具体涉及一种改进的环介导等温扩增方法及其在检测鼠疫杆菌中的应用。
背景技术：
：鼠疫是一种以发病急、传播快、病死率高、传染性强为特征的自然疫源性传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病。自从上个世纪90年代以来，全球鼠疫流行呈上升趋势。世界范围鼠疫疫情连年不断，尤以非洲为重，亚洲次之，但也有大规模的爆发流行。与世界其它地区一样，我国鼠疫自然疫源地进入活跃期，鼠疫疫情也明显上升。鼠疫的病原体鼠疫杆菌在自然界中常表现为典型菌与非典型菌并存的状况，非典型鼠疫菌是不具备典型鼠疫杆菌生物学特性一项或几项特异特征的菌林。在鼠疫流行静息期，非典型鼠疫杆菌是鼠疫杆菌在自然界中长期保存的主要形式，而典型菌是鼠疫流行期的主要菌群，典型菌和非典型菌在一定情况下可发生互相转换。目前对鼠疫的4企测方法有常规四步检测法，免疫学^r测法，分子生物学法，全自动微生物分析系统。我国对鼠疫菌的检测主要采用血清学方法和鼠疫菌的四步检测法。血清学方法只能作追溯性诊断，四步检验虽然可靠，但耗时过长。常规的检测手段很容易检出典型鼠疫菌,却很难检出非典型鼠疫菌，而且灵敏度及特异性不高。PCR技术多以存在于鼠疫菌质粒上的毒力基因为靶位点进行检测，对非典型鼠疫菌的调查缺乏特异性，且大多PCR扩增方法均局限在室内，不适用于疫源地的监测与现场初筛。
发明内容本发明涉及一种新的检测鼠疫杆菌的方法，其中采用环介导等温4扩增技术。环介导等温扩增技术(LAMP)是日本学者Notomi发明的一种全新核酸扩增方法，它在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了反应时间，而且不需要昂贵的热循环仪，等温条件下即可完成反应，扩增产物肉眼可见，-使于推广应用。LAMP是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异，高效，快速扩增DNA的新技术。LAMP反应主要包括两个阶段循环扩增始发物的形成和循环扩增伸长延伸阶#殳。耙序列6个特异区域和引物的结构如图1所示，FIP引物包括正向内引物F2区段(与耙基因3,末端F2c互补)和Flc(与耙基因3，末端Flc序列相同)，正向外引物F3(与靶基因3，末端F3c互补)；BIP引物包括反向内引物B2区段(与靶基因3,末端B2c互补)和Blc(与靶基因3，末端Blc序列相同)，反向外引物B3(与靶基因3，末端B3c互补)。循环扩增始发物形成DNA在60-65。C处于动态平衡，在具链置换活性BstDNA酶的作用下，任一引物与耙基因序列进行互补延伸时，另一条链就会解离。反应以正向内引物F2为起点，与耙序列F2c配对延伸扩增模板互补链，与此同时，正向外引物F3与把序列F3c互补延伸合成模板互补DNA链，并置换下由正向内引物FIP引导合成的模板链。被置换下的模板单链5,末端Fl与Flc互补，发生自我碱基配对，形成环状结构，而反向内引物BIP结合其另一端，引导合成互补链，紧接着由反向外引物B3与B3c结合延伸，解下BIP引导合成的模板DNA单链。BIP引导合成的DNA链两端均有互补序列，发生自我配对，形成哑铃状模板DNA。循环扩增伸长延伸阶段哑铃状模板DNA为循环反应的起点，为后续反应提供原料。哑铃结构的DNA通过自我引导延伸，生成双链茎环结构，在循环反应中，引物FIP结合到茎环DNA的环状结构上，引导合成新的DNA双链，同时置换出与W目同序列的链，形成一个过渡性茎环结构DNA，在其茎上含有一耙序列反向拷贝，而另一端通过BIP形成一环状结构，在随后自我引导的链置换DNA合成反应中生成一条可填补缺口，长度为靶DNA两倍的茎环DNA。经过一系列自我引物置换延伸合成过程，在内引物作用下进行循环反应，茎的长度和环的个个数都逐渐增加，最后扩增产物为由DNA组成的混合物，即含有若干倍茎环结构和类似花椰菜的结构(含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构)。LAMP扩增结果判定有三种(1)琼脂糖电泳观察是否产生连续的DNA扩增条带。(2)反应管离心肉眼观察管底有无白色沉淀，阴性反应无此现象，或采用浊度仪检测管内浊度变化，可进行实时定量检测。(3)反应产物中加SYBRGreenI,肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。LAMP技术扩增以形成环状模板DNA作为反应的起点，因此成功形成此结构是反应的关键。对引物设计有其特殊要求(l)Tm:内引物中Flc、Blc的Tm值要求在64-66°C，Flc、Blc的Tm值应比B2、F2以及外引物F3、B3高约5。C是为了使Flc、Blc不会过早与模板链Fl、Bl结合，过早结合将导致环状模板DNA形成失败；B2、F2以及外引物F3、B3的Tm值在59-6rC,B2、F2的Tm〈B3、F3的Tm值，以使反应起始F2能首先与模板DNA结合进行扩增而并非F3、B3与模板链结合直接形成互补双链。(2)内外引物应具备相当的稳定性，引导合成新DNA链的F2，B2，F3,B3的3，末端，涉及形成环状DNA的Flc，Blc的5，末端AG《-4kcal/mo1。(3)GC含量内外引物对GC含量在40-60%，以50-60%最佳。(4)二级结构引物对之间与引物自身应避免形成二级结构，由于LAMP的大多数产物均为FIP和BIP所扩增，因此涉及内引物时应注意不形成引物二级结构。(5)引物长度要求F2—B2:120-160bp,F1-F2、B1-B2:40-60bp,F2-F3/B2-B3:0-60bp。本发明涉及一种测定鼠疫杆菌的新方法，其中包括1、鼠疫杆菌疫苗抹EV76.DNA的提取；2、LAMP引物设计和合成，其中LAMP引物包括两个外引物和两个内引物，内引物FIP(上端内引物)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5,-Flc-F2;内引物BIP(下端内引物)包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2序列，即5，-Blc-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合耙序列上的6个特异区域；3、在所选酶浓度、Mg2+条件、dNTPs浓度、反应温度条件下进6行反应。经过本发明人的大量研究，本发明所述的方法中，(1)釆用BstDNA聚合酶2~12U进行LAMP单因素，结果酶活性单位在5-12U中扩增效果优良，在9-11U的范围内扩增效果好，更优选酶浓度为IOU，此时效果最佳。(2)1xThermol緩冲液含有2画1/LMg2+，本发明选择Mg2+浓度在2mmol/L~10mmol/L进行LAMP扩增，优选采用3-6mmol/L进行LAMP扩增，最优选4mmo1/LMg2+。(3)采用dNTPseach浓度为100umol/L~600umol/L进行LAMP扩增，优选200-500umol/L，更优选300-450umol/L,最有优选400umol/L处扩增。(4)比较不同反应温度对整个LAMP扩增体系的影响，本发明的方法优选的温度范围在53°C~68°C,更优选58-65°C，最优选63。C。本发明所述方法中，所述鼠疫杆菌疫苗抹EV76DNA的提取利用煮沸法进行基因提取。例如，主要步骤如下1)取培养后液体增菌液于EP管，离心，收集细菌，弃上清；2)用dH20重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH20重悬;3)沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管；4)NnnoDrop法测定DNA浓度，保存于-20°C。本发明的鼠疫杆菌疫苗抹EV76DNA的提取利用煮沸法进行基因才是取，具体实例例如1)取培养48h后液体增菌液lml于1.5mlEP管，13.4x1000rpm离心30sec，收集细菌，弃上清；2)0.25mldH20重悬洗涤细菌，13.4x1000rpm离心30sec，弃上清，重复一次，最后用0.25mldH20重悬；3)沸水浴10min裂解细菌，8000g离心10min，4吏细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于1.5mlEP管；4)NnnoDrop法测定DNA浓度，保存于-20°C。本发明的方法中，引物设计和合成过程中包括两个外引物和两个内引物的设计和合成，内引物FIP(上端内引物)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5,-Flc—F2;内引物BIP(下端内引物)包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2序列，即5，-Blc-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合耙序列上的6个特异区域。1)第一套引物(YP0392)F3F2210ACAGTCAGGATCTGATCATCAAAGTGAAAGGTGTTGATGATCGGGAAGCCGC^-Flc262GAATTTACTGACTAATTGCGAAATTATCGTAGATTACAACTCCCTGCATTGGAABlc316GAGGATGATTACTACTGGAAAGACCTTATGGGTTGCCAAGTAGTAACCACCACB2B3369GGGTTATGAACTGGGTAAAATCATCGATATGATGGAAACCGGTTCTAACGATG4422TCATGGTCGTGAAGGCAAATCTGAAAGATGCATTCGGTATGA序列l.根据鼠疫杆菌YP0392基因设计的引物。用于引物设计的序列区域用箭头表示，两端的数字为对应的YP0392的位置。2)第二套引物(YP2088)B3870CTTCCTCTTCAAAATCCAACTCAAG898序列2.根据鼠疫杆菌YP2088基因设计的引物。用于引物设计的序列区域用箭头表示，两端的数字为对应的YP2088的位置。表1LAMP引物对<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>合成引物后，将内引物FIP，BIP均稀释为50uM,将外引物F3，B3稀释为10uM，优选在-10~-80。C下保存，更优选在-1555。C保存，最优选-2(TC-4(TC保存。通过LAMP预实一睑，实—睑结果表明，扩增产物主要在120-180bp间，在100-200bp间为主要产物，由实验结果可知选4奪的引物对不同，对实验菌扩增的结果不同，YP2088引物对LAMP扩增后DNA梯度条带比YP0392细且多，但主要产物亮度比YP0392暗，见图2a，肉眼观察反应管，阳性反应管混浊，阴性对照未见混浊，如图2b。本发明所述方法中，对酶浓度进行优化，确定对于不同引物的最佳酶浓度。本发明所述的方法，确定YP0392与YP2088引物对对于BstDNA聚合酶要求的最优值的一般性方法例如是PCR反应管置于PCR扩增仪，63。C反应60min，80°C4min，4'C保存；反应产物于2%琼脂糖电泳观察结果。参考文献中LAMP扩增反应体系得用量进行鼠疫杆菌酶浓度条件实验，例如，参见(TomokoHorisaka，KayokoFujita^tal,"SensitiveandSpecificDetectionofYersiniapseudotuberculosisbyLoop~MediatedIsothermal"Amplification.Journalofclinicalmicrobiology,2004,42(ll):5349-5352)实验结果表明YP0392引物对扩增能力较强，对酶浓度无太大限制要求，酶活性单位2U以上即可出现扩增，6U以上扩增效果一致，选择6U作为最优浓度；YP2088引物对在6U开始出现扩增，扩增条带不清晰，酶浓度越高，条带越清晰，考虑到其他条件未优化及成本问题，选择IOU作为反应工作浓度。图l:靶序列上6个特异序列及引物设计；图2a:LAMP预实验结果B为空白对照，1、2、3孔为YP0392引物扩增结果，第4、5孔为YP2088引物扩增结果；图2b:鼠疫耶尔森菌疫LAMP扩增浑浊度变化；上述图2a和图2b中，左空白对照，右阳性鼠疫菌EV76;图3:不同Mg2+浓度LAMP检测鼠疫菌电泳结果；图4:不同浓度甜菜碱LAMP检测鼠疫菌电泳结果；图5:不同dNTPs浓度LAMP检测鼠疫菌电泳结果；图6:不同反应温度LAMP检测鼠疫菌电泳结果；图7a、图7b:YP0392特异性实验结果；图7a所示顺序依次为空白对照，鼠疫杆菌环境分离抹(+),中间耶尔森菌，克氏耶尔森菌，阿氏耶尔森菌，弗氏耶尔森菌；图7b依次为空白对照，鼠疫疫苗林EV76,莫氏耶尔森菌，假结核耶尔森菌，小肠耶尔森菌，罗氏耶尔森菌，鲁氏耶尔森菌；图8a、图8b、图8c:YP2088特异性实^r结果；图8a所示顺序依次为空白对照，鼠疫杆菌环境分离林(+),中间耶尔森菌，克氏耶尔森菌，阿氏耶尔森菌，弗氏耶尔森菌，伯氏耶尔森菌；图8b依次为空白对照，鼠疫疫苗抹EV76，莫氏耶尔森菌，假结核耶尔森菌，小肠耶尔森菌，罗氏耶尔森菌，鲁氏耶尔森菌；图8c，B:空白对照；M:DL2000DNAMarker;1:阳性对照鼠疫菌EV76;2-6:中蒙边境阳性分离株；图9:YP0392基因组灵敏度实-睑结果，B:空白对照，M:DL2000DNAMarker;1:148.8ng;2:14.88pg;3:148.8pg;4:14.88pg;5:148.8fg;6:14.88fg;7:1.488fg;8:0.1488fg;图10:YP2088基因组灵每文度实-验结果；B:空白对照，M:DL200010DNAMarker;1:148.8ng;2:14.88pg;3:148.8pg;4:14.88pg;5:148.8fg;6:14.88fg;7:1.488fg;8:0.1488fg;图11:YP0392细菌数灵敏度实验结果(LAMP法)，B:空白对照，M:DL2000DNAMarker;1:20000cfu;2:2000cfu;3:200cfu;4:20cfu;5:2cfu;6:0.2cfu;图12:YP2088细菌数灵敏度实验结果(LAMP法)，B:空白对照，M:DL2000DNAMarker;1:20000cfu;2:2000cfu;3:200cfu;4:20cfu;5:2cfu;6:0.2cfu;图13:不同反应温度LAMP检测鼠疫菌电泳结果，B:空白对照；M:DL2000DNAMarker;1:53°C;2:55°C;3:60°C;4:63°C;5:65°C;6:68°C。具体实施例方式实施例l:YP0392内外引物对的比例条件优化实验LAMP的大多数产物由FIP和BIP扩增，内引物在引导DNA的反应过程中起着重要作用，而外引物主要在环状结构DNA的形成起作用，内引物对反应的影响更大，固定外引物的量(0.2uM)，选择外引物内引物在k2-1:12的范围内进行条件优化；具体内外引物比例条件优化反应体系见表2，内外引物比例用量见表3。表2YP0392内外引物比例条件优化反应体系试剂总量(ul)超纯水70.810x緩沖液20甜菜碱402.5mMdNTPs20F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶6总量164.8表3.YP0392内外引物比例条件优化内引物用量表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果YP0392引物对在1:2即可出现扩增，内引物浓度过高抑制扩增反应，外引物内引物在1:8开始扩增强度开始减弱，因此，优选外引物内引物=1:2-1:10，优选l:4-1:8，更优选l:5-1:7，最优选l:6，1:6.5。实施例2:YP2088内外引物对的比例M优化实验使用酶浓度条件优化后的值再进行YP2088内外引物对比例条件实验，内外引物比例条件优化反应体系见表4，内外引物比例用量同表3。表4.YP2088内外引物比例条件优化反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果YP2088引物对在1:6开始出现扩增条带，优选外引物内引物的比例范围为l:6-1:10,更优选l:7-1:9，最优选1:8，1:8.5，1:8.8。实施例3:YP0392的Mg2+条件优化实验BstDM聚合酵酉己送的1xThermo1緩沖液含有2mMMg2+,为了保证反应的有效性，增强实验的灵敏度，选择Mg2+浓度在2mM-10mM(空白B，2mM，4Mm，5mM，6mM,8mM，10mM)进行单因素条件实验，反应操作1.2.7.1,反应体系配制好后进行分装，每管15ul,注明标号，反应体系用量见表5，Mg2+加样量见表6。表5.YP0392Mg2+条件实验反应体系用量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表6JVIgh条件实验反应Mgh用量表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例4、YP2088的Mg2+^Hf实验选择Mg2+浓度在2mM-lOmM(空白B,2mM，4Mm，5mM，6mM,8mM，lOmM)进行单因素条件实验，反应体系配制好后进行分装，每管15ul，注明标号，反应体系用量见表7，Mg2+加样量同表6。表7.YP2088Mgh条件实验反应体系用量试剂名总量(ul)超纯水9.210x緩冲液20甜菜碱402.5mMdNTPs20FIP引物6.4BIP引物6.4F3引物4B3引物4Bst,聚合酶10总量120结果Mg^作为BstDNA聚合酶的辅酶，对聚合酶的活性有着重要作用，緩冲液中Mg2+浓度为2mM，选择2mmol/L10mmol/L进行LAMP扩增，结果见图3，4mmol/LMg^扩增效果最佳。实施例5:YP0392的甜菜碱对比实验YP0392甜菜碱对比实验甜菜碱有稳定DNA的作用，LAMP反应涉及复杂的呈环过程，甜菜碱理论上有增强反应强度的作用，但也做过对比试验甜菜碱的加入不能很好的进行LAMP反应，因此先进行甜菜碱对比实验，再针对结果考虑进行甜菜碱单因素条件优化的必要性。将鼠疫菌疫苗林EV76染色体DNA分别稀释至1(T1，10—2,实验分加入甜菜碱组(100，10匿1，10—2，Bl)，不加甜菜碱组(100，10-1,l(T2，B2)与空白对照，反应体系配制好后进行分装，每管23ul。实施例6、甜菜碱条件优化实验选择甜菜碱终浓度在0.2M-1.2M(B，0.2M,0.4M，0.6M,0.8M，1.0M,1.2M)范围内进行LAMP反应，反应体系配制好后进行分装，每管23ul，反应体系用量见表8。14表8.YP0392甜菜碱条件优化反应体系试剂名总量(ul)超纯水49.210xbuffer202.5函NTPs20Mg2+16FIP引物6.4BIP引物6.4F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶10总量136结果加入不同浓度甜菜碱，确定反应最优条件。实验结果如图4。两引物对在甜菜碱浓度0.2M-1.2M均出现梯度扩增，YP2088在0.6M开始扩增亮度基本一致。实施例7:dNTPs浓度单因素优化实验1)YP0392dNTPs浓度单因素优化实验选择dNTPs浓度在lOOuM-600uM(反应管分别为空白B，100uM，200uM，300uM，400uM，500uM，600uM)进行单因素条件实验，反应体系配制好后进行分装，每管23ul，反应体系用量见表9，dNTPs加样量见表IO。表9.YP0392dNTPs浓度条件优化反应体系试剂名总量(ul)超纯水54.410xbuffer.20甜菜石成32Mg2+8FIP引物4.8BIP引物4.8F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶6总量13615表10.YPG392dNTPs条件优化dNTPs加才羊量B123456dNTPs(ul)终浓度(uM)—110022003300440055006600ddH20(ul)654321—2)YP0288dNTPs浓度单因素优化实验选择dNTPs浓度在100uM-600uM(反应管分别为空白B，lOOuM，200uM,300uM,400uM,500uM,600uM)进行单因素条件实验，反应体系配制好后进行分装，每管23ul，反应体系用量见表ll，dNTPs加样量同表10。表11.YP2088dNTPs浓度条件优化反应体系试剂名总量(ul)超纯水45.210xbuffer20甜菜械24Mg2+16FIP引物6.4BIP引物6.4F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶10总量136结果dNTPs作为核酸反应扩增的原料，浓度过低将降低反应的灵敏度，出现假阴性，浓度过高将抑制反应的进行或出现非特异扩增，在dNTPs浓度为100uM-600uM浓度范围进行LAMP扩增，YP0392实验结果见图11,YP2088实验结果见图5;YP0392引物对在dNTPs浓度为lOOuM-500uM浓度间出现梯度扩增，400uM处条带最清晰，YP2088引物对在dNTPs浓度为lOOuM-400uM浓度间出现梯度扩增，400uM条带最清晰。实施例8、反应温度单因素优化实验1)YP0392反应温度单因素优化实验选择在53。C-68°C(反应管分别为空白B,53°C，55°C，58°C,60°C，63°C,68°C)进行单因素条件实验，反应体系配制好后进行分装，每管23ul，反应体系用量见表12。表12.YP0932反应温度单因素优化反应体系试剂名总量(ul)超纯水68.410xbuffer20甜菜碱322.5mMdNTPs32Mg2+8FIP引物4.8BIP引物4.8F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶6总量1842)YP2088反应温度条件优化实验选择在53°C-68°C(反应管分别为空白B，53。C，55°C，58°C，60°C，63°C，68°C)进行单因素条件实验，反应体系配制好后进行分装，每管23ul，反应体系用量见表13。表13.YP2088反应温度单因素优化反应体系试剂名总量(ul)超纯水61.210xbuffer20甜菜碱242.5薩NTPs32Mg2+16FIP引物6.4BIP引物6.417F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶10结果BstDNA聚合酶在80。C几分钟即可失活，且反应不宜在高于70。C下进行，LAMP反应在60°C-65。C均可反应，在53。C-68。C范围进行LAMP扩增，确定反应最优温度，YP0392实验结果见图13，YP2088实验结果见图6，YP0392引物对在53-65。C均有扩增，58-63。C扩增强最高，YP2088引物对在60-65。C出现扩增条带，63。C条带最清晰。两引物对均选择63。C作为反应最佳温度。实施例9、特异性实验用优化结果分别检测YP0392,YP2088引物对LAMP反应的特异性，选择耶尔森菌属不同菌基因组DNA进行LAMP反应，特异性实验所用菌林共18抹(包括7林鼠疫耶尔森菌环境阳性分离抹，鼠疫杆菌疫苗抹EV76,假结核耶尔森菌，中间耶尔森菌，弗氏耶尔森菌，阿氏耶尔森菌，罗氏耶尔森菌，伯氏耶尔森菌，克氏耶尔森菌，鲁氏耶尔森菌，莫氏耶尔森菌，小肠结肠炎耶尔森菌)；YP0392反应体系用量如表14，YP2088反应体系用量如表15。表14.YP0392特异性实验反应体系试剂名总量(ul)超纯水205.210xbuffer60甜菜械962.5mMdNTPs96Mg2+24FIP引物14.4BIP引物14.4F3引物12B3引物12BstDNA聚合酶18总量55218表15.YP2088特异性实验反应体系试剂名总量(ul)超纯水159.610xbuffer60甜菜石咸962.5mMdNTPs96Mg2+48FIP引物19.2BIP引物19.2F3引物12B3引物12Bst腿聚合酶30总量552结果使用建立的LAMP反应体系进行特异性反应，选择耶尔森菌属不同菌基因组DNA进行LAMP扩增，YP0392引物对实—睑结果见图7a，7b;YP2088引物对实验结果见图8a,8b,8c。YP0392引物对特异性不好，只能分辨一部分耶尔森菌属细菌，YP0392引物对可用于LAMP分辨耶尔森菌属；YP2088引物对特异性很好，无非特异性扩增。实施例10、方法灵敏度实验为了检验LAMP反应的灵敏性和LAMP反应用于检测所需要的最低模板量，对基因组DNA、细菌纯培养物进行LAMP反应，同时以外引物F3，B3作为常规PCR引物，对两者结果进行比较分析。1)基因组DNA灵敏度实验将鼠疫杆菌EV76基因组DNA10倍稀释为10—^10—7，按两套引物对各自反应体系的优化结果进行基因组DNA灵敏度实验，鼠疫杆菌EV76基因组DNA原浓度经ND法测定为74.4ng/ul，反应操作同1.2.7.1，YP0392引物对基因组DNA灵萄文度实验反应体系量见表16，YP2088见表17,体系配制后分装10管，每管23ul，模板DNA加入量2ul。2)细菌纯培养物灵敏度实验经平板计数，原始菌液浓度为6.8xl09cfu/ml,将原液稀释至lxl08cfu/ml。IO倍倍比稀释菌液至10—1-1(T8进行LAMP检测，反应操作同1.2.7.1，YP0392引物对基因组DNA灵敏度实验反应体系量同表16，YP2088同表17,体系配制后分装10管，每管23ul,模板DNA加入量为2ul。表16.YP0392基因组灵敏度实验反应体系试剂名总量(ul)超纯水85.510xbuffer25甜菜碱402.5mMdNTPs40Mg2+10FIP引物6BIP引物6F3引物5B3引物5Bst飄聚合酶7.5总量2308基因组灵敏度实验反应体系试剂名总量(ul)超纯水72.510xbuffer25甜菜碱402.5mMdNTPs40Mg2+16FIP引物8BIP引物8F3引物4B3引物4Bst腿聚合酶12.5总量230结果1)基因组DNA灵敏度为检测LAMP技术灵敏度，将鼠疫杆菌疫苗抹EV76DNA10倍稀释至l(T1-10—7，取2ul上清液作为模板进行LAMP扩增进行LAMP反应，反应产物5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，YP0392引物实验结果如图9，YP2088引物实验结果如图10，鼠疫杆菌基因组DNA原液浓度74.4ng/ul。结果显示YP0392引物出现实验室污染，全部出现扩增条带，查找污染原因；YP2088引物对空白对照没有非特异扩增，电泳孔道1-4号出现扩增条带，灵敏度达10—3,即148pg/tube。2)细菌培养物LAMP灵敏度实验将培养经过计数调整为lxl07cfu/ml菌液，用煮沸法提:f又DNA然后依次稀释至10—1-l(T，取2ul上清液作为模板进行LAMP扩增，反应产物5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳4企测，IIOV，40min,电泳结果经过凝胶成像系统处理后，YP0392引物实验结果如图11,YP2088引物实验结果如图12。结果显示YP0392引物对出现污染现象，空白与第7号电泳管道没有扩增条带，其余均出现扩增条带，YP2088引物对在1-3号电泳管道均出现扩增条带，LAMP最低检测值为105,经平板计数可知，最低才企测量200cfu/tube。对染色体基因组DNA检测限为14.88pg/tube,细菌纯培养物为200cfu/tube,灵敏度较高，与常规PCR相当，但略低于文献[l]报道的10fg/tube和100cfu/tube，可能是文献采用质粒上的毒力基因的拷贝数比染色体高。LAMP技术可用于检测土壤样品的鼠疫菌，而常规PCR不能检出。检测灵敏度较低，可能是试剂盒提取率低，或土壤中含有干扰成分抑制核S吏扩增反应。徐菲莉，孙石，赵飞.PCR检测鼠疫pla基因的敏感性及特异性试验.地方学通报，1998，13(1):18-20.(LAMP特异性与常规PCR一致)权利要求1、一种测定鼠疫杆菌的新方法，其中包括(1)鼠疫杆菌疫苗株EV76DNA的提取；(2)LAMP引物设计和合成，其中LAMP引物包括两个外引物和两个内引物，内引物FIP(上端内引物)包含F1c序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5，-F1c-F2；内引物BIP(下端内引物)包含B1c(B1区域的互补序列)和B2序列，即5，-B1c-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合靶序列上的6个特异区域；(3)在所选酶浓度、Mg2+条件、dNTPs浓度、反应温度条件下进行反应。2、权利要求l所述的方法，其中，所述引物设计为下列引物YP0392159TCCAGCAGGCGGGTAAGTGGCAGCATGTyGAGTTGGAAGACTGGAAG;GCCF3F2210ACAGTCAGGATCTGATCATCAAAGTGAA^GGTGTTGATGATCGGGAAGCCGCFlc262GAATTTACTGACTAATTGCGAAATTATCGTAGATTACAACTCCCTGCATTGGAABlc316GAGGATGATTACTACTGGAAAGACCTTATGGGTTGCCAAGTAGTAACCACCACB2B3369GGGTTATGAACTGGGTAAAATCATCGATATGATGGAAACCGGTTCTAACGATG4422TCATGGTCGTGAAGGCAAATCTGAAAGATGCATTCGGTATGA序列l.根据鼠疫杆菌YP0392基因设计的引物，用于引物设计的序列区域用箭头表示，两端的数字为对应的YP0392的位置。3、权利要求l所述的方法，其中，所述引物设计为下列引物YP2088FlcBlc758AGCGCGGTAGTGACGATAATGTCTACTTCTGCGGCTTGCGCAGCAAACAGTTCCATB3870CTTCCTCTTCAAAATCCAACTCAAG898序列2.根据鼠疫杆菌YP2088基因设计的引物，用于引物设计的序列区域用箭头表示，两端的数字为对应的YP2088的位置。4、权利要求l所述的方法，其中，对于YP0392引物，外引物内引物=1:2-1:10。5、权利要求4所述的方法，其中，外引物内引物=1:4-1:8。6、权利要求4所述的方法，其中，外引物内引物=1:5-1:7。7、权利要求4所述的方法，其中，外引物内引物=1:6。8、权利要求l所述的方法，其中，对于YP2088引物，外引物内引物=比例范围为1:6-1:10。9、权利要求8所述的方法，其中外引物内引物=1:7-1:9。10、权利要求8所述的方法，其中，外引物内引物=最优选1:8。全文摘要本发明涉及一种新的检测鼠疫杆菌的方法，其中采用环介导等温扩增技术。本发明对环介导等温扩增方法进行了实质性改进，提高了检测特异性和灵敏度。文档编号C12Q1/68GK101665832SQ20091009003公开日2010年3月10日申请日期2009年7月29日优先权日2009年7月29日发明者姚李四,孙肖红,张晓龙,文海燕,宇杨,静王,龙冬伶申请人:中国检验检疫科学研究院