L-氨基酸生产方法

专利名称：L-氨基酸生产方法
技术领域：
本发明涉及使用微生物的L-氨基酸生产方法。L-氨基酸用于调味料、食品添加剂、饲料添加剂、化 学制品、医药品等各种领域。
背景技术：
L-苏氨酸、L-赖氨酸等L-氨基酸通过使用具有这些L-氨基酸生产能力的埃希氏菌属细菌等L-氨基酸生产菌的发酵法进行工业生产。作为这些L-氨基酸生产菌，使用从自然界分离的菌株、该菌株的人工突变株、或通过基因重组而增强了 L-氨基酸生物生产酶活性的重组体等。L-苏氨酸生产法包括例如专利文献I 4中记载的方法。另外，L-赖氨酸生产法可以以专利文献5 8记载的方法为例。L-氨基酸的发酵生产使用糖类，即葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物等作为碳源。在非专利文献I中记载了大肠杆菌野生株可以使用12碳以上的长链脂肪酸作为唯一碳源生长，非专利文献2显示其在以豆蘧酸、棕榈酸、油酸作为唯一碳源的培养基上可以生长。此外，在非专利文献I和非专利文献3中记载了脂肪酸同化借助由fadL、fadD、fadE、fadB、fadA、fadj、fadl组成的基因群编码的酶经由称为β酸化的同化途径进行，并且这群fad基因受到fadR编码的转录因子的抑制。此外，如非专利文献4所示，关于缺失了 fadR基因的菌株有很多报道。然而，如非专利文献5所示，已知脂肪酸溶解度一般极低，迄今为止尚无以脂肪酸作为主要碳源使用直接发酵法进行物质生产的实例。因此，为了用脂肪酸作为L-氨基酸生产的碳源，通过物理处理使培养基中的脂肪酸易于利用，同时提高发酵菌的脂肪酸同化能力，都是非常重要的。关于涉及脂肪酸同化的基因的缺失或扩增对以脂肪酸作为碳源的物质生产的影响，迄今为止还没有研究的实例。在专利文献9中公开了使用染色体上fadR基因缺失的微生物生产L-苏氨酸的方法。此外，在专利文献10中公开了通过增强能量获取效率高的呼吸链途径，或缺失能量获取效率低的呼吸链途径来进行物质生产的方法。然而，两者都是用葡萄糖作为碳源，不能预见其使用脂肪酸作为碳源会有显著的效果。专利文献I :特开平5-304969号公报专利文献2 :国际公开第98/04715号小册子专利文献3 :特开平05-227977号公报专利文献4 :美国专利申请公开第2002/0110876号说明书专利文献5 :特开平10-165180号公报专利文献6 :特开平11-192088号公报专利文献7 :特开2000-253879号公报专利文献8 :特开2001-057896号公报专利文献9 :特开2004-129666号公报专利文献10 :特开2002-017363号公报非专利文献I :Clark，D. P.和 Cronan，J. Ε· Jr. 1996. 343-357 页·于F.D.Neidhardt(编)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition，American Society for Microbiology Press,Washington, D. C非专利文献2 :Weeks，G.等 1969. Control of Fatty Acid MetabolismI. Induction of the Enzymes of Fatty Acid Oxidation in Escherichia coli.J. Bacteriol. 97 :827-836非专利文献3 :Campbell J. W.等 2003. A new Escherichia coli metaboliccompetency growth on fatty acids by a novel anaerobic beta-oxi dation pathway.Mol. Microbiol. 47 :793-805.非专利文献4 ；Cronan, J. E. Jr.和 Subrahmanyam，S. 1998. FadR, transcriptionalco-ordination of metabolic expediency. Mol. Microbiol. 29 :937-943非专利文献5 :Vorum，H.等 1992. Solubility of long-chain fatty acids in phosphate buffer at pH 7.4.Biochimica et Biophysica Acta， Lipids and LipidMetabolism 1126 :135-14
发明内容
与历来主要以糖类作为碳源利用微生物进行的L-氨基酸发酵生产方法相对，本发明提供了一种使用脂肪酸或油脂水解物等新原料，使用对其具有高同化能力的微生物，高效、廉价的L-氨基酸制造方法。本发明人为解决上述课题进行了勤奋研究，结果发现，通过在以历来被认为作为发酵原料时细菌生长迟缓、利用困难的脂肪酸作为碳源的培养基中，培养具有L-氨基酸生产能力且提高了脂肪酸的同化能力的属于肠杆菌科的细菌，可以高效地生产L-氨基酸。基于该知识完成了本发明。具体而言，本发明如下所述(I). 一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，在包含脂肪酸或油脂的水解物的培养基中培养提高了脂肪酸同化能力且具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌，从而在培养基或菌体内生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集L-氨基酸。(2).上文所述的方法，其中，所述细菌是通过修饰选自参与脂肪酸同化的基因群中的I种或2种以上的基因而提高了脂肪酸同化能力的细菌。(3).上文所述的方法，其中，所述细菌是通过弱化fadR基因的表达或者使fadR基因缺损而提高了脂肪酸同化能力的细菌。(4).上文所述的方法,其中，所述细菌是通过增强选自fadl、fadj、fadL、fadE、fadD、fadB和fadA中的I种或2种以上的基因的表达而提闻了脂肪酸同化能力的细囷。(5).上文所述的方法，其中，所述基因是fadB和fadA。(6).上文所述的方法，其中，所述基因是fadl和fadj。(7).上文任一项所述的方法，其中，所述细菌是通过增强cyoAB⑶E操纵子的表达而提高了脂肪酸同化能力的细菌。(8).上文任一项所述的方法，其中，所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。 (9).上文任一项所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。(10).上文任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自L-苏氨酸、L-赖氨酸和L-色氨酸中的I种或2种以上的氨基酸。根据本发明，能够使用新的碳源高效率地生产L-氨基酸。发明的
具体实施例方式下面对本发明进行详细说明<1>本发明的L-氨基酸生产方法本发明的方法是以通过在含有脂肪酸或油脂水解物的培养基中培养属于肠杆菌科，提高了脂肪酸的同化能力，且具有L-氨基酸生产能力的细菌，从而在培养基或菌体内生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养基或菌体中收集L-氨基酸为特征的L-氨基酸生产方法。本文中本发明的方法可以使用分批培养(batch culture)、分批补料培养(Fed-batchculture)、连续培养法(continuous culture)中的任何方式,培养基中的脂肪酸或油脂水解物可以包含于初始培养基中、或流加培养基中、或两者中都含有。 在本文中，本发明所述的分批补料培养，是指向培养容器中连续地或间歇地流加培养基，在培养结束前不将该培养基从容器中移除的培养方法。此外，连续培养是指向培养容器中连续地或间歇地流加培养基，并且从容器中移除培养基(通常与流加的培养基等量)的方法。此外，初始培养基意为在分批补料或连续培养中，在流加流加培养基前用于分批培养的培养基(培养开始的培养基)，而流加培养基意为在进行分批补料培养或连续培养时向发酵槽供给的培养基。此外，分批培养意为每次准备新的培养基，在其中接种菌株，并在收获前不再添加培养基的方法。脂肪酸是指可由通式CnHniCOOHG^U m+1分别表示脂肪酸中含的碳原子数和氢原子数)表示的长链烃一价羧酸。一般大多把碳原子数12以上的称为长链脂肪酸。脂肪酸由于其碳原子数和不饱和度不同存在各种种类。此外，脂肪酸是油脂的组成成分，已知根据油脂种类不同，脂肪酸的组成亦不同。豆蘧酸(C13H27COOH)是碳原子数14的饱和脂肪酸，存在于椰子油和棕榈油中。棕榈酸(C15H31COOH)是碳原子数16的饱和脂肪酸，通常大量存在于植物油脂中。硬脂酸(C17H35COOH)是碳原子数18的饱和脂肪酸，大量存在于动物性脂肪和植物性油中。油酸(C17H33COOH)是碳原子18的一价不饱和脂肪酸，大量存在于动物性脂肪和植物性油中。亚油酸(C17H31COOH)是碳原子数18，且9位和12位具有两个顺式双键的多价不饱和脂肪酸。脂肪酸亦可使用上述长链脂肪酸的混合物。当使用脂肪酸混合物作为碳源时，关于脂肪酸的混合比例，只要是本发明方法所使用的细菌能够作为碳源进行同化的浓度比例即可。亦可利用从油脂水解物去除甘油而得到的脂肪酸混合物。在本发明的方法中，亦可使用油脂水解物。油脂是脂肪酸与甘油的酯，亦称为甘油三酯(triglyceride)。对于油脂，只要能够进行水解反应，无论是脂肪油(oil)(指常温下为液体者)抑或脂肪(fat)指(指常温下为固体者)均可加以使用。此外，所有来自动物(包括鱼类)的油脂以及来自植物的油脂均可使用，亦可I种或2种以上组合使用。作为原料使用的油脂，可以是纯油脂，也可以是含有油脂以外物质的化合物。当油脂是来自植物时，可以例举含有油脂的植物提取物或其级分。作为动物油脂，可以例举黄油、猪脂、牛脂、羊脂等、鲸油、沙丁鱼油、鲱油等。作为植物油脂，可以举出椰子油、橄榄油、菜种油、大豆油、米糠油、核桃油、芝麻油、花生油，但是并不仅限于此。棕榈油是从油棕榈中提取的油，近年来作为生物柴油(biodiesel)燃料广为使用，生产量不断上升。油棕榈(oil palm)是分类上为椰子科油棕榈属(Elaeis)的植物总称。粗棕榈油一般而言指榨油工厂生产的未纯化椰子油，作为粗棕榈油交易。此外，已知在微藻类中亦蓄积油脂(Chisti，Y. 2007. Biotechnol Adv. 25 :294-306)，亦可从藻体抽提。藻体内除油脂以外虽还含有糖类、蛋白质、氨基酸等有机物，但将含有这些的混合物水解作为碳源使用也毫无问题。就油脂而言，由于通过水解产生的脂肪酸种类作为碳源能够被本发明方法中使用的细菌同化，因此这些物质含量较高的油脂是理想的。具有L-氨基酸生产能力的细菌能够同化的长链脂肪酸包括例如月桂酸、豆蘧酸、软脂酸、硬脂酸、油酸。在本发明中所说的油脂水解物是指上述油脂通过化学方法或酶水解所得之物，是脂肪酸和甘油的混合物。工业上的水解法一般是在高温(2 50-260°C )、高压(5-6MPa)下，将油脂与水交流接触的连续高温水解法。此外，使用酶在低温(30°C左右)进行的反应在工业上亦有使用。(Jaeger,K. E.等 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15 :29-63)。所述酶可使用催化油脂水解反应的酶，即脂肪酶。脂肪酶在工业上是重要的酶，有多种产业上的用途(Hasan，F.等 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39 :235-251)。油脂水解物是脂肪酸与甘油的混合物，已知相对于棕榈油等一般的油脂的水解物中含有的脂肪酸，甘油的重量比为10%左右。油脂水解物只要含有脂肪酸即可，并没有特别的限制。举例而言，可以将油脂水解物直接使用，亦可去除部分脂肪酸、甘油后使用，或添加脂肪酸和甘油后使用。此时甘油对脂肪酸的重量比优选5 20 100，更优选7. 5 15 100。就本发明方法使用的培养基中含有的脂肪酸或油脂水解物的量而言，只要本发明方法中使用的细菌能够将其作为碳源同化，任何量都是可以的，不过，在作为单独的碳源添加到培养基时，优选含量为10W/V%以下，优选5W/v%以下，更优选2W/v%以下。此外，作为单独的碳源添加到培养基时，期望含量为0. 2W/v%以上，优选0. 5W/v%以上，更优选I. Ow/
以上。此外，在作为流加培养基使用时，在作为单独的碳源向流加培养基中添加的场合，流加后培养基中所含的浓度优选为5W/v%以下，优选2W/v%以下，更优选lW/v%以下。此夕卜，作为单独的碳源向流加培养基中添加时，优选将量控制在0. 01w/v%以上，优选0. 02w/v%以上,更优选0. 05w/v%以上。而且,脂肪酸的浓度可通过质谱法(Hashimoto, K.等1996. Biosci. Biotechnol.Biochem. 70 :22-30)和 HPLC(Lin, J. T.等 1998. J. Chromatogr. A. 808 :43-49)测定。关于向培养基添加的脂肪酸或存在于油脂水解物中的脂肪酸，期望以可将水胶束化的与钠或者钾等形成的碱金属盐的形式使用。然而，有些情况下甚至脂肪酸的钠盐和钾盐的溶解度亦不足以作为发酵原料使用。因此，为了使得具有L-氨基酸生产能力的细菌可以更加高效地同化作为碳源的脂肪酸，优选增加乳化操作等促进均一化的步骤。举例而言，作为乳化方法，可以考虑添加乳化促进剂或表面活性剂。在本文中，乳化促进剂可举出磷脂和类固醇。此外，表面活性剂可举出非离子表面活性剂，如聚(氧乙烯)山梨醇单油酸酯(Tween 80)等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、正辛基β _D_糖苷等烷基糖苷、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯等。两性离子型表面活性剂可例举属于烷基甜菜碱的N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。此外，亦可使用Triton X-100、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(Brij-58)和壬基苯酚乙氧化物(Tergitol NP-40)等生物学领域通常使用的表面活性剂。而且，为了促进脂肪酸乳化和均一化的操作亦为有效。对于这样的操作，只要是促进脂肪酸乳化和均一化的操作即可。具体而言可以例举匀浆处理、均匀搅拌(homomixer)处理、超声波、高压处理、高温处理等，更优选匀浆处理、超声波以及两者的组合。特别优选将上述表面活性剂处理与匀浆处理和/或超声波处理组合。这些处理期望在脂肪酸更稳定的碱性条件下进行。碱性条件优选为PH9以上，较优选pHIO以上。而且，本发明方法中使用的培养基除了脂肪酸或油脂水解物之外，还可以添加其他的碳源。优选的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物和生物质水解所得的糖液等糖类，乙醇等醇类，以及富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸。而且，使用其他碳源时，碳源中的脂肪酸或油脂水解物的比率优选为10%重量以上，优选30%重量以上，更优选50%重量以上。而且，在本发明中，就脂肪酸或油脂水解物而言，可于培养的所有步骤中均含有一定浓度的脂肪酸或油脂水解物，亦可仅在流加培养基或者初始培养基中添加脂肪酸或油脂水解物，而且只要其他碳源充足，亦可存在一段时间的脂肪酸或油脂水解物不足的期间。所谓一段时间，例如在发酵整体时间的最大30%的时间内脂肪酸或油脂水解物不足亦可。这样，如下所述的情形就包括在本发明的“用含脂肪酸或油脂水解物培养基培养”的字面意义范围内在此情形中脂肪酸浓度有时会暂时变为0，但存在使用含脂肪酸或油脂水解物培养基的培养期间。向培养基中添加的除碳源以外的成分可使用氮源、无机盐以及视需要的其他有机成分。本发明培养基中含有的氮源可使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等，用于调节PH的氨气或氨水亦可作为氮源使用。此外，亦可利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。培养基中只含有这些氮源中I种亦可，含有2种以上亦可。这些氮源可用于初始培养基或流加培养基。此外，初始培养基和流加培养基可使用相同的氮源，流加培养基使用的氮源与初始培养基不同亦可。在本发明的培养基中，除碳源、氮源外，优选含有磷酸源、硫源。作为磷酸源，可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸聚合物等。此外，作为硫源，只要含有硫原子即可，但优选为硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等硫酸盐，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，其中尤其优选硫酸铵。此外，在培养基中，除了上述成分外，可以含有生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。生长促进因子可使用微量金属类、氨基酸、维生素、核酸、以及含有这些物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解物等。微量元素可以举出铁、锰、镁、钙等，维生素可以举出维生素BI、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12等。这些生长促进因子可包含于初始培养基中，亦可包含于流加培养基中。此外，使用生长中需要氨基酸等的营养缺陷型时，优选在培养基中补充所需的营养素。就L-赖氨酸生产菌而言，大多如后所述强化了 L-赖氨酸生物合成途径并弱化了L-赖氨酸分解能力，因而最好是添加选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的I种或2种以上。初始培养基和流加培养基的组成可以相同，亦可以不同。此外，初始培养基和流加培养基的硫浓度可以相同，亦可以不同。而且，在分多个阶段进行流加培养基的流加时，每阶段的流加培养基组成可以相同，亦可以不同。、
培养优选发酵温度20 45°C，特别优选在33 42°C进行通气培养。在本文中，氧浓度调节为5 50%，优选10%左右。此外，优选将pH控制在5 9进行通气培养。在培养基中如果PH值下降，可以例如添加碳酸钙，或者用氨气或氨水等碱进行中和。在这样的条件下，经过优选10 120小时左右的培养，在培养液中蓄积大量的L-氨基酸。就蓄积的L-氨基酸的浓度而言，只要是可以从培养基中收集或回收的浓度即可，但可以为50g/l以上，优选75g/l以上，特别优选100g/l以上。关于培养结束后从培养液收集L-氨基酸的方法，可以遵循公知的回收方法进行。举例而言，从培养液通过离心分离除去菌体后，浓缩结晶来进行收集。在本发明中，为了保证L-氨基酸蓄积到一定量以上，可将细菌培养分为种子培养和主培养进行，可使用烧瓶振荡培养或分批培养进行种子培养而以流加培养或连续培养方式进行主培养，或者可以种子培养和主培养均使用分批培养。在本发明中，在进行流加培养或者连续培养时，可以间歇地流加流加培养基，使得脂肪酸或其他碳源的流加暂时地停止。此外，流加培养基供应的停止优选在流加进行时间 的最多30%以下，期望20%以下，特别期望10%以下。当间歇地流加流加培养基时，可进行下述控制添加流加培养基一定的时间，从第二次添加起，在用计算机检测到添加期之前的一段添加停止期中发酵培养基中碳源耗尽而PH上升或溶解氧浓度上升时开始进行添加，从而使得培养槽内的基质浓度总是自动保持较低水平(美国专利5，912，113号说明书)。关于在流加培养中使用的流加培养基，优选含有脂肪酸或油脂水解物和其他碳源以及具有生长促进效果的营养素(生长促进因子)的培养基，可将发酵培养基中的脂肪酸浓度控制在一定值以下。添加至流加培养基中的其他碳源优选葡萄糖、蔗糖、果糖，生长促进因子优选氮源、磷酸、氨基酸等。氮源可使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐。此外，磷酸源可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，氨基酸优选补充在使用营养缺陷型变异体时所需的营养素。此外，流加培养基可为I种，亦可为2种以上培养基的混合物。在使用2种以上的培养基时，可将这两者混合，通过一个加料罐流加，亦可用多个加料罐流加。在本发明中使用连续培养法时，移除和流加可同时进行，亦可在移除部分后进行流加。此外可使用移除含有L-氨基酸和细胞的培养液，而仅将细胞回送到发酵槽中对菌体进行再利用的连续培养法(参照法国专利2669935号说明书)。连续或者间歇的流加营养源的方法可使用与流加培养同样的方法。对菌体进行再利用的连续培养法，是当达到预定的氨基酸浓度时，将发酵培养基间歇或者连续的移除，仅取出L-氨基酸，将含有菌体的过滤残留物再循环到发酵槽中的方法，举例而言，可参照法国专利2669935号说明书进行实施。在本文中，在间歇地移除培养液的场合，当达到预定的L-氨基酸浓度时，可以将部分L-氨基酸移除，重新流加培养基进行培养。此外，添加的培养基的量优选设定为与最终移除之前的培养液量为相同的量。在本文中，相同的量意为移除前培养液量的93 107%左右的量。在连续地移除培养液的场合，期望的是在流加营养培养基的同时，或者在流加之后开始移除。举例而言，移除开始时间可以是流加开始后5小时以内，期望为3小时以内，特别期望为I小时以内。此外，移除的培养液量优选与移除与流加的量为相同的量。〈2>在本发明中使用的细菌在本发明中，使用属于肠杆菌科、提高了脂肪酸同化能力、并具有L-氨基酸生广能力的细囷。肠杆囷科细囷包括属于埃希氏囷属、肠杆囷属、欧文氏囷属、克雷伯氏囷属、泛菌属、光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森菌属等属的细菌。尤其优选在根据NCBI (National Centerfor Biotechnology Information)的数据库(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwta x. CRiyyid = 91347)的分类法,归类为肠杆菌科的细菌。属于埃希氏菌属的细菌无特别的限制，意为根据微生物学专家所知的分类法归类为埃希氏菌属的细菌。在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌虽可举出大肠杆菌(E. coli)，但并不限于此。可以在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌无特别的限制，包括，例如， Bachmann 等著作的表 I (Bachmann, B. J. 1996. 2460-2488 页· In F. D. Neidhardt (编)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition,American Society for Microbiology Press, Washington, D. C)中所记载的系统的细菌。具体而言，可以举出源自原型野生菌株K12的大肠杆菌W3110(ATCC 47076)。这些菌株例如可从美国典型培养物保藏中心(地址P.O. Box 1549 Manassas, VA20108,United States of America)通过分售获得。S卩，各菌株被赋予了对应的登录号，可以利用该登录号通过分售获得。对应于各菌株的登录号见美国典型培养物保藏中心的目录。所谓属于泛菌属的细菌，是指所述细菌依据微生物学专家知晓的分类法被归类在泛菌属。作为泛菌属细菌的代表性菌株，可举出Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、朽1 樣泛菌(Pantoea citrea)。成团肠杆菌的某些种，最近基于16S rRNA碱基序列分析等被重新分类为成团泛菌、Pantoea ananatis、斯氏泛菌等(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43 :162-173)。在本发明中，这样重新分类于泛菌属的细菌也包括在属于泛菌属的细菌中。作为肠杆菌属细菌，可举出成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。作为欧文氏菌属细菌，可举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora);作为克雷伯氏菌属细菌，可举出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。所谓“提高了脂肪酸同化能力”意指在细菌增殖以及L-氨基酸的生产中，作为构成菌体成分或者L-氨基酸的碳来源的脂肪酸的贡献实质上提高。举例而言，用添加了脂肪酸的培养基进行培养时，与未修饰株相比细菌生长更加良好，或者与非修饰株相比L-氨基酸的生产量提高，因而评价为脂肪酸同化能力提高。在本发明中，“提高脂肪酸同化能力”，例如，通过修饰参与脂肪酸同化的基因或者cyoAB⑶E基因而达成。在本发明中，所谓“参与脂肪酸同化的基因”，意为受fadR基因和fadR控制的基因群(以下称 fad 基因群),具体而言，包含 fadR、fadA、fadB、fadI、fadJ、fadL、fadE、和 fadD
坐寸ο〈2-DL-氨基酸生产能力的赋予
在本发明中，所谓具有L-氨基酸生产能力的细菌，是指具有在含脂肪酸或油脂水解物的培养基中培养时，生产L-氨基酸并将其分泌到培养基中能力的细菌。此外，优选的是能够在培养基中蓄积优选O. 5g/L以上，更优选I. Og/L以上量的目标L-氨基酸的细菌。L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。更优选L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸，特别优选L-苏氨酸以及L-赖氨酸。在本发明方法中可使用迄今为止有报道的L-氨基酸生产菌，只要其能够通过提高脂肪酸同化能力，同化脂肪酸或油脂水解物而生产L-氨基酸即可。下面，对在本发明方法中可使用的各个L-氨基酸生产菌进行说明。 L-苏氨酸生产菌作为优选的具有L-苏氨酸生产能力的微生物，可举出增强了 L-苏氨酸生物合成系统酶中的I种或2种以上酶的活性的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可例举天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、thr操纵子编码的天冬氨酸激酶I(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号内为该基因的简记符号(对于下面的记载亦同样)。在这些酶中，特别优选天冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶以及苏氨酸合酶。L-苏氨酸生物合成系统基因可以导入苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，可例举例如苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH6株(特开2001-346578号)等。L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，最好对L-苏氨酸生物合成系统酶基因进行修饰以使其不受L-苏氨酸的反馈抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构，苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且通过弱化作用其表达受抑制。这种修饰可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现(参照 Lynn，S. P.等 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69 ;国际公开第 02/26993 号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。苏氨酸操纵子上游存在天然启动子，但亦可用非天然启动子将其取代(参考国际公开第98/04715号小册子)，亦可构建其中参与苏氨酸生物合成的基因的表达受到λ卩遼菌体的阻遏蛋白及启动子的调控的苏氨酸操纵子(参考欧洲专利第0593792号说明书)。此夕卜，为了对细菌进行修饰使其不受L苏氨酸的反馈抑制，亦可以选择对α -氨基-β -羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株。对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主中拷贝数增加，或者是其连接于强启动子而表达量提高。拷贝数的增加除了借助质粒的扩增，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等将苏氨酸操纵子转移到基因组上来达成。理想的是，除了 L-苏氨酸生物合成系统酶之外，亦增强糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、或糖摄取基因。这些对L-苏氨酸生产有效应的基因可例举转氢酶基因(PntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。此外，增强赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或赋予宿主L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，亦为理想的。赋予抗性的基因可例举rhtA基因(Res. Microbiol. 154 :123-135 (2003))、rhtB 基因(欧洲专利申请公开第 0994190 号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)、yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法可参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子记载的方法。作为L-苏氨酸生产菌和用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可例举大肠杆菌 TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利第 5，175，107 号、美国专利第 5, 705, 371号)、大肠杆菌472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美国专利第5，631，157号)、大肠杆菌 NRRL-21593 (美国专利第5，939，307号)、大肠杆菌FERM BP-3756 (美国专利第5，474，918号)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520 (美国专利第5，376，538号)、大肠杆菌MG442 (Gusyatiner 等，1978. Genetika (俄语)，14 :947-956)、大肠杆菌 VL643 和 VL2055 (欧洲专利申请公开第1149911号)等属于埃希氏杆菌属的菌株，但不限于此。TDH-6菌株缺失thrC基因，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏(leaky)突变。该菌株亦在rhtA基因上有突变，该突变赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌株携带PVIC40质粒，该质粒是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到来自RSF1010的载体中而获得的。这种突变的thrA基因编码基本上已解除了苏氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。B-3996菌株在1987年11月19日以保藏号RIA 1867 保藏于 All-Union Scientific Center of Antibiotics (全联盟抗生素科学中心)(Nagatinskaya Street 3_A, 117105 Moscow, Russia)。该菌株亦于 1987 年 4 月 7 日以保藏号B-3996保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection ofIndustrial Microorganisms (VKPM), (I Dorozhny proezd. , I Moscow 117545, Russia)。亦可以使用大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株。就B-5318菌株而言，它是非异亮氨酸营养缺陷型的，pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域被温度敏感型λ噬菌体Cl阻遏蛋白以及PR启动子取代。VKPMΒ-5318于1990年5月3日以保藏号VKPM Β-5318国际保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (I Dorozhny proezd. , I Moscow 117545, Russia)。编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经得到阐明(核苷酸编号 337 2，799，Genbank 登录号 NC_000913. 2，gi :49175990)。thrA 基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL基因和thrB基因之间的位置。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经得到了阐明(核苷酸编号2801 3733，GenBank登录号NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrA基因和thrC基因之间。编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因已经得到了阐明(核苷酸编号3734 5020，GenBank登录号NC_000913. 2，gi :49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体thrB基因和yaaX开放阅读框之间。这三个基因全部作为单一的苏氨酸操纵子而起作用。为了增加苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子上除去影响转录的弱化子区域(国际公开第2005/049808号、国际公开第2003/097839号)。编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因，可以从公知存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996株中的pVIC40质粒作为一个操纵子获得。PVIC40质粒详细描述于美国专利No. 5，705，371。大肠杆菌的rhtA基因，存在于靠近编码谷氨酰胺输送系统重要组分的glnHPQ操纵子的大肠杆菌染色体18分的位置。rhtA基因与ORFl (ybif基因，核苷酸编号764 1651，GeneBank 登录号 AAA218541，gi :440181)是同一的，位于 pexB 基因和 ompX 基因之间。表达由ORFl编码的蛋白质的单元称为rhtA 基因(rht :高丝氨酸以及苏氨酸抗性)。此外，弄清了 rthA23突变是在相对ATG起始密码子的_1位上G_>A的取代(ABSTRACTSofthe 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology inconjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry andMolecularBiology, San Francisco, California August 24-29,1997, abstract No. 457,EP 1013765 A)。大肠杆菌的asd基因已经得到了阐明(核苷酸编号3572511 3571408，GenBank登录号NC_000913. 1，gi :16131307)，使用基于该基因的碱基序列制备的引物进行PCR，可获得该基因(参照White，T. J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))。亦可用同样方法获得其他微生物的asd基因。此外，大肠杆菌的aspC基因也已经得到了阐明(核苷酸编号983742 984932，GenBank登录号NC_000913. 1，gi :16128895)，可通过PCR获取该基因。亦可用同样方法获得其他微生物的aspC基因。L-赖氨酸生产菌作为属于埃希氏菌属的L-氨基酸生产菌的实例,可例举对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但该抑制作用在L-赖氨酸共存于培养基中时全部或部分解除。作为L-赖氨酸类似物的实例，可例举氧化赖氨酸、赖氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等，但不限于此。对于这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株，可以通过对属于埃希氏菌属的细菌实施常规的人工突变处理来获得。作为对L-赖氨酸生产有用的菌株的具体实例，可例举大肠杆菌AJl 1442 (FERM BP-1543、NRRL Β-12185 ;参照美国专利第4346170号)以及大肠杆菌VL611。这些微生物中L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制已解除。WC196株可作为大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌使用。该菌株是通过对来自大肠杆菌Κ-12的W3110株赋予AEC耐性而选育得到的。该株命名为大肠杆菌AJ13069，于1994年12月6日以保藏号FERM Ρ-14690保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、〒305-8566日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)，于1995年9月29日基于布达佩斯条约移至国际保藏，获得保藏号FERMBP 5252 (美国专利第5，827，698号)。作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举L-赖氨酸生物合成系统酶中I种或2种以上的酶的活性增强的株。这样的酶可例举二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氢卩比唳二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利第6，040, 160号)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶(dapE)以及天冬氨酸酶(aspA) (EP 1253195A)，但不限于此。这些酶中，特别优选二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶。此夕卜，亲本株可提高涉及能量效率的基因(cyo) (EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利第5，830, 716号)、ybjE基因(W02005/073390)或这些组合的表达水平。L-赖氨酸生产菌或为了衍生该菌的亲本株的实例还包括催化从L-赖氨酸生物合成途径分歧生成L-赖氨酸以外化合物的反应的酶的活性降低或缺失的菌株。作为催化从L-赖氨酸生物合成途径分歧生成L-赖氨酸以外化合物的反应的酶，可例举高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第5，827，698号以及苹果酸酶(W02005/010175)。作为优选的赖氨酸生产菌，可例举大肠杆菌WC196 Δ cadA Δ Idc/ pCABD2(AJ110692/pCABD2) (W02006/078039)。该菌株是向编码赖氨酸脱羧酶的cadA以及IdcC基因破坏的W196株(大肠杆菌WC196AcadAAldcC :AJ110692株)中导入美国专利第6040160记载的pCABD2质粒而获得的株。pCABD2包含来自具有解除了 L-赖氨酸所导致的反馈抑制的变异的编码来自大肠杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的变异体dapA基因、具有解除了 L-赖氨酸所导致的反馈抑制的变异的编码来自大肠杆菌的天冬氨酸激酶III的变异体IysC基因、编码来自大肠杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因以及编码来自乳发酵短杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。L-半胱氨酸生产菌作为L-半胱氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利6，218，168，俄罗斯专利申请2003121601)、具有过表达编码适于从细胞排出有毒物质的蛋白质的基因的大肠杆菌W3110 (美国专利5，972，663)、半胱氨酸脱巯基酶(cysteinedesulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)、由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(国际公开第0127307号)等属于埃希氏菌属的株，但不限于此。L-亮氨酸生产菌作为L-亮氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利第6，124，121号))或对β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等亮氨酸类似物有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)、通过国际公开第96/06926号中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株、大肠杆菌Η-9068(特开平8-70879号)等属于埃希氏菌属的株，但不限于此。用于本发明的细菌可以通过增加至少一种参与L-亮氨酸生物合成的基因的表达来加以改进。作为这些基因的实例，可优选举出以编码解除了 L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变IeuA基因(美国专利第6，403，342号)为代表的IeuAB⑶操纵子基因。而且，可以通过增加至少一种编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表达来改进用于本发明的细菌。这类基因的实例可例举b2682和b2683基因(ygaZH基因)(欧洲专利申请公开第1239041号)。L-组氨酸生产菌作为L-组氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举大肠杆菌24株(VKPM B-5945、RU2003677)、大肠杆菌 80 株(VKPM B-7270、RU2119536)、大肠杆菌 NRRLB-12116-B12121(美国专利第 4,388,405 号)、大肠杆菌 H-9342(FERM BP-6675)以及H-9343 (FERM BP-6676)(美国专利第 6，344，347 号)、大肠杆菌 H-9341 (FERM BP-6674)(欧洲专利申请公开第1085087号)、大肠杆菌AI80/pFM201 (美国专利第6，258，554号)等属于埃希氏菌属的菌株，但并不限于此。作为L-组氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例亦可例举编码L-组氨酸生物合成系统酶的I种以上的基因的表达增强的株。相关基因的实例可例举ATP憐酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶基因(phosphoribosyIformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase) (hisA)、酉先胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱龜!酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成系统酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导可赋予对反馈抑制的抗性的突变，来有效地增加产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677以及2119536号)。作为具有L-组氨酸生产能力的菌株具体实例，可例举导入了携带编码L-组氨酸生物合成系统酶的DNA的载体的大肠杆菌FERM-P 5038和5048 (特开昭56-005099号)，导入了氨基酸输送的基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536号)
坐寸οL-谷氨酸生产菌作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举大肠杆菌VL334thrC+(EP 1172433)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。大肠杆菌VL334 (VKPMB-1641)是在thrC和ilvA基因中有突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利4，278，765)。利用在野生型大肠杆菌菌株K-12(VKPM B-7)细胞中增殖的噬菌体P1，通过常规转化方法来导入了 thrC基因的野生型等位基因。其结果，获得了 L-异亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL334thrC+(VKPM B-8961)。作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举L-谷氨酸生物合成系统酶中的I种或2种以上酶的活性得到增强的菌株，但不限于此。相关基因的实例可例举编码下列的基因谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异朽1檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA,acnB)、朽1檬酸合酶(gltA)、甲基柠檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA, pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA,pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醒-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果、糖二磷酸醒缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA, pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)等。在这些酶中，优选谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基柠檬酸合酶。作为柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因表达升高的修饰菌株，可例举在EP1078989A、EP955368A以及EP952221A中公开的菌株。作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，亦可例举催化从L-谷氨酸生物合成途径分歧而合成L-谷氨酸以外的化合物的酶的活性降低或缺损的菌株。作为这样的酶的实例，可例举2_氧代戊二酸脱氢酶(α-酮戊二酸脱氢酶(sucA))、异柠檬酸裂合酶(aceA)、α -酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟基酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰转移酶(Pfl)、乳酸脱氢酶(Idh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)等。α-酮戊二酸脱氢酶活性缺损、或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于埃希氏菌属的细菌及其获取方法记载于美国专利第5，378，616号和第5，573，945号。作为具体例子，可以举出
大肠杆菌W3110sucA: :Kmr大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)大肠杆菌W31 IOsucA : :Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的α -酮戊二酸脱氢酶基因(以下也称“sucA基因”)而得到的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺损。作为L-谷氨酸生产菌的其他实例，可例举属于埃希氏菌属且对天冬氨酸代谢拮抗物质有抗性的菌株。这些菌株可以缺失α-酮戊二酸脱氢酶，可例举大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利第5，908，768号)，以及还降低了 L-谷氨酸分解能力的 FFRM P-12379(美国专利第 5,393,671 号)；AJ13138 (FERM BP-5565)(美国专利第6，110，714号)等为例。作为Pantoea ananatis L-谷氨酸生产菌的实例，可例举Pantoea ananatisAJ13355株。该菌株是从静R县磐田市的土壤中作为能够在低pH下在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株而分离出来的菌株。Pantoea ananatis AJ13355于1998年2月19日以保藏号FERM P-16644保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址〒305-8566日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6);于1999年I月11日以保藏号FERM BP-6614转为基于布达佩斯条约的国际保藏。而且，该菌株虽在分离出来时鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans),并作为成团肠杆菌AJ13355保藏,但近年来通过16S rRNA的碱基序列解析等,重新分类为Pantoea ananatis。此外，作为属于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可例举α-酮戊二酸脱氢酶(aKGDH)活性缺失或者a KGDH活性降低的属于泛菌属的细菌。作为这样的菌株为缺失AJ13355株的a KGDH-El亚单位基因(sucA)而得到的AJ13356 (美国专利第6，331，419号)，以及从AJ13355株中作为粘液质低生产突变菌株选择出来的SC17株衍生的sucA基因缺失株SC17sucA(美国专利第6，596，517号)。AJ13356于1998年2月19日以保藏号FERM P-16645保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、〒305-8566日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)，并于1999年I月11日以保藏号FERM BP-6616转为基于布达佩斯条约的国际保藏。AJ13355以及AJ13356在上述保藏机构是作为成团肠杆菌保藏的，但是在本说明书中，将其描述为Pantoea ananatis。此外，SC17sucA株的内部编号为AJ417,已于2004年2月26日以保藏号FERM BP-08646保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心。而且，作为属于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可例举SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株、AJ13601 株、NP 106 株以及 NAl 株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中导入包含来自大肠杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppsA)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及包含来自乳发酵短杆菌(Brevibacterium Iactofermentum)的朽1樣酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是从该SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作为在低pH下显示出对高浓度L-谷氨酸的抗性的菌株而选择出的。而NP106株是从AJ13601株脱落质粒RSFCPG+pSTVCB而得到的。AJ13601株于1999年8月18日以保藏号FERM P-17516保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)，并于2000年7月6日以保藏号FERM BP-7207转为基于布达佩斯条约的国际保藏。 L-苯丙氨酸生产菌作为L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物缺损的大肠杆菌AJ12739(tyrA::TnlO，tyrR) (VKPMB-8197) (W003/044191)、携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089 (ATCC 55371)(美国专利第5，354，672号)、大肠杆菌 MWEC101-b(KR8903681)、大肠杆菌 NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146 以及NRRLB-12147(美国专利第4，407，952 号)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。此夕卜，作为亲本株亦可使用携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAD] (FERM BP-12659)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)以及命名为 AJ12604 的大肠杆菌1(-12[胃3110(七7^)/ 81 -&1'064，pACMAB] (FERM BP-3579) (EP488424 BI)。而且,还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性增加的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473号以及2003/0157667、W003/044192 号)。L-色氨酸生产菌作为L-色氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举由突变的trpS基因编码而缺失了色氨酰-tRNA合成酶缺陷的大肠杆菌JP4735/pMU3028 (DSM10122)以及JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利5，756，345);具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因的大肠杆菌SV164 (pGH5)(美国专利
6,180, 373);色氨酸酶缺失的大肠杆菌 AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4，371，614);磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50, pACKG4_pps (W09708333，美国专利6,319,696)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。亦可使用增强了由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质活性的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。作为L-色氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，亦可例举选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3_脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇酸丙酮酸莽草酸 3_ 憐酸合酶(5-enolpyruvylshikimate_3-phosphate synthase) (aroA)、分支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的I种或2种以上酶活性增强的菌株。预苯酸脱水酶以及分支酸变位酶以双功能酶(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (CM/PDH))的形式由pheA基因编码。在这些酶中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制解除的突变。作为具有此类突变的菌株的具体实例，可例举具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164以及通过将包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因的质粒pGH5(国际公开94/08031)导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株。作为L-色氨酸生产菌或用于诱导该菌的亲本株的实例，亦可例举导入了包含编 码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号,美国专利第4，371，614号)。而且,可通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚单位组成，这两种亚单位分别由trpA和trpB基因编码。而且，可通过增强异柠檬酸裂合酶_马来酸合酶操纵子的表达来改善L-色氨酸生产能力(W02005/103275)。L-脯氨酸生产菌作为L-脯氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举缺失iIvA基因、能够生产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012) (EP1172433)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。在本发明中使用的细菌可通过增加至少一种参与L-脯氨酸生物合成的基因的表达来进行改良。作为L-脯氨酸生产菌优选基因的实例，可例举编码解除了 L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的ProB基因(德国专利第3127361号)。而且，在本发明中使用的细菌，可通过增加至少一种编码从细菌细胞中分泌L-氨基酸的蛋白质的基因的表达来进行改良。这样的基因包括例如b2682基因和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。作为具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的实例，可例举NRRLB-12403以及NRRL B-12404 (英国专利第2075056号)、VKPM B-8012 (俄罗斯专利申请2000124295)、德国专利第3127361号描述的质粒突变体、Bloom F. R等(The 15th Miamiwinter symposium, 1983, p. 34)描述的质粒突变体等大肠杆菌株。L-精氨酸生产菌L-精氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请公开2002/058315A1)及其带有突变N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请 2，001，112，869),大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926) (EP1170358A1)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acety I glutamate synthetase)的 argA 基因的精氨酸生产株(EP1170361A1)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。
作为L-精氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，亦可例举增加了至少I种编码L-精氨酸生物合成系统酶的基因的表达的菌株。相关基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argj)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥拍酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。L-缬氨酸生产菌作为L-缬氨酸生产菌或用于衍生 该菌的亲本株的实例，包括经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998，178),但不限于此。优选将弱化(attenuation)所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。而且，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。作为L-缬氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，亦可例举具有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利5，658，766)。举例而言，可使用在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变的大肠杆菌VL1970。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日以保藏号VKPM B-4411保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (I Dorozhny Proezd. , IMoscow 117545, Russia)ο而且,还可以将生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变株和/或缺失H+-ATPase的突变株(国际公开96/06926)作为亲本株使用。作为L-异亮氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)、对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧I亏酸等具有抗性的突变株、以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)，但不限于此。而且，亦可将用编码苏氨酸脱氨酶、乙酰轻酸合酶(acetohydroxate synthase)等参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白质基因转化的重组菌株作为亲本株使用(特开平2-458号，FR0356739，以及美国专利第5，998，178号)。L-甲硫氨酸生产菌作为L-甲硫氨酸生产菌或用于衍生该菌的亲本株的实例，可例举L-苏氨酸营养缺陷株、对正亮氨酸有抗性的突变株(特开2000-139471号)，但不限于此。而且，亦可将缺损了甲硫氨酸阻遏物的菌株、或者用编码高丝氨酸转琥珀酰酶、胱硫醚Y-合酶等参与L-甲硫氨酸生物合成的蛋白质基因转化过的重组菌株作为亲本株使用(特开2000-139471号)。而且，在通过基因重组来培育上述L-氨基酸生产菌时，使用的基因并不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，只要不损害所编码蛋白质的功能，亦可使用该基因的同源物和人工修饰体等具有保守突变的基因。即，亦可为这样的基因，其编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中一个或数个位置上包含一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的序列的蛋白质。有关“保守突变”，后述关于参与脂肪酸同化的基因的记载亦适用于上述基因。<2-2>提高脂肪酸同化能力的性状的赋予在本发明方法中使用的细菌，是如上所述具有L-氨基酸生产能力的细菌经修饰而增加了脂肪酸同化能力的细菌，优选指该细菌被赋予了下述性状中一种以上的性状fadR基因的表达弱化或缺损、fadl基因的表达增强、fadj基因的表达增强、fadL基因的表达增强、fadE基因的表达增强、fadD基因的表达增强、fadB基因的表达增强、fadA基因的表达增强、fadBA操纵子的表达增强、fadlJ操纵子的表达增强、cyoAB⑶E的表达增强。在本发明中所谓“fadR”基因，意为这样的基因，其编码见于肠杆菌科细菌的具有脂肪酸代谢调节DNA结合能力的转录因子FadR(DiRusso，C. C.等1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C.等 1993. Mol. Microbiol. 7 :311-322)。具体而言，作为大肠杆菌的fadR基因，可例举位于大肠杆菌基因组序列(GeneBank登录号U00096)的碱基编号1234161 1234880，具有SEQ ID NO :1所示的碱基序列的基因。SEQ ID NO :2显示了该基因编码的氨基酸序列。为了降低fadR转录因子的活性，可弱化fadR基因的表达或使该基因缺损。具体而言，通过使染色体上编码fadR的基因，具体地说fadR基因编码区域的一部分或全部缺损，或者对启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰等而实现。此外,通过修饰表达调节序列以外的非翻译区域，亦可使基因的表达量变低。而且，可将包括染色体 上基因前后序列在内的基因整体缺失。此外，亦可通过基因重组，在染色体上编码fadR的区域中导入氨基酸取代(错义突变)、以及导入终止密码子(无义突变)或导入添加、缺失I 2 个碱基的移码突变而实现(Wang, J. P.等 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405-9410 ；Winkler, ff. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594-602 ；Qiu, Z.和 Goodman, M. F. 1997.J. Biol. Chem. 272 :8611-8617 ；Wente, S. R.和 Schachman, Η. K. 1991. J. Biol. Chem. 266 20833-20839)。优选的是，利用同源重组，使染色体上基因的表达调节序列如启动子区域、编码区域、或者非编码区域的一部分或全部缺损，或在这些区域中插入其他的序列，而使细胞内fadR的转录调节活性降低。然而，亦可通过用X射线或紫外线照射、或者N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍等诱变剂的常规诱变处理而修饰，只要所述修饰使得转录抑制活性降低。对于表达调节序列的修饰，优选为I个碱基以上，更优选2个碱基以上，特别优选3个碱基以上。此外，在缺失编码区域时，只要产生的FadR的转录调节机能降低或缺失，缺失的区域可为N末端区域、内部区域、C末端区域中任一区域，优选是含有DNA结合域的区域，亦可为全部编码区域。通常，缺失的区域越长越可有把握地使基因失活。而且，优选缺失的区域上游和下游的阅读框不一致。在编码区域中插入其他序列时，可以在基因的任何区域；缺失的区域越长，越可有把握地使编码转录因子的基因失活。优选的是，插入部位前后的序列阅读框不一致。作为其他的序列，只要使转录因子机能降低或缺损即可，没有特别的限制，可例举搭载抗生素抗性基因和对L-氨基酸生产有用的基因的转座子。如上所述对染色体上的基因的修饰，例如，可通过下述方法实现制备基因部分序列缺失从而不产生具有正常机能的酶蛋白质的缺失型基因，用含该基因的DNA转化细菌，使缺陷型基因和染色体上的基因发生同源重组，从而使得缺陷型基因置换染色体上的基因。由缺失型基因编码的转录因子，即使生成，也具有与野生型转录因子相异的立体结构，从而机能降低或消失。这样利用同源重组进行基因置换的基因破坏，可通过Red驱动整合(Red-driven integration)法、Red驱动整合法和来自λ卩遼菌体的切出系统组合方法等使用直链DNA的方法、使用含温度敏感性复制起点的质粒和可接合传递的质粒的方法以及利用在宿主内不携带复制起点的自杀载体(suicide vector)的方法(美国专利第6303383号、或特开平05-007491号)等进行。fadR基因的表达减弱可通过Northern印迹、RT-PCR等确认，fadR基因缺损可通过Southern印迹确认(Sambrook, J.和Russell,D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York)。上述关于转录因子活性减弱的描述，亦适用于前述其他酶的“活性减弱”或其他基因的“破坏”。在本发明中所谓“fadL基因”，意为这样的基因，其编码见于肠杆菌科细菌、具有摄入长链脂肪酸能力的外膜转运蛋白。(Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268 15469-15476 ；Stenberg, F. et al.2005. J. Biol. Chem. 280 :34409-34419)。由于fadL基因表达增强而导致的fadL活性增强，可以通过对fadL基因增强前的细菌和增强后的细菌的长链脂肪酸摄入活性进行比较来加以确认。举例而言，对于油酸 摄入活性，可依照例如 Kumar 和 Black 的方法(Kumar, G. B.和 Black, P. N. 1993. J. Biol.Chem. 268 :15469-15476)来进行测定。测定可以这样进行将在培养后收集的细胞与3H标记的油酸反应，洗净后，比较摄入的放射线量。摄入活性以相对于细胞总蛋白质一分钟时间内摄入的3H油酸量(nM)表示。与亲本株比较，期望摄入活性提高优选I. 5倍以上、较优选2倍以上，更优选3倍以上。可以测定FadL与长链脂肪酸的结合活性，也可以通过Western印迹等方法确认 FadL 蛋白质的表达(Kumar, G. B.和 Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268 15469-15476)。此外，可通过 Northern 印迹、RT-PCR 等(Sambrook, J.和 Russell,D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York)确认 fadL 基因的 mRNA 量的增加。就编码FadL的基因而言，具体地说，大肠杆菌的fadL基因的例子包括位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)碱基编号2459322 2460668的位置、具有SEQID NO :3所示碱基序列的基因。SEQ IDNO :4显示编码该基因的氨基酸序列。在本发明中所谓“fadD基因”，意为这样的基因，其编码见于肠杆菌科细菌、催化从长链脂肪酸生成脂酰-辅酶A的脂酰-辅酶A合成酶(faty acyl-CoA synthetase)活性、同时将其透过内膜摄入的酶(Dirusso, C.C.和 Black，P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279 49563-49566 ；SchmeIter,T.et al.2004.J. Biol. Chem. 279 :24163-24170)。脂酰-Cok合成酶活性指具有下列反应(EC 6. 2. I. 3)的催化活性辅酶A+脂肪酸+ATP =酰基辅酶A+ 二磷酸+AMP由于fadD基因表达增强而导致的FadD活性增强，可以通过比较fadD基因增强前的微生物与fadD基因增强后的微生物的长链脂肪酸摄入活性进行比较来加以确认。举例而言，油酸的摄入活性可依照例如Schmelter等的方法(Schme I ter, T.等· 2004.J. Biol. Chem. 279 =24163-24170)来测定。可通过从在培养后收集的细胞，制备内膜的囊泡(vesicle),捕获(trap) ATP和辅酶A (coenzyme A)后,添加3H油酸,洗净后比较摄入的放射线量而测定。摄入活性，以相对于细胞总蛋白质在一分钟时间内摄入的3H油酸量(nM)来表示。与亲本株比较，期望摄入活性提高优选I. 5倍以上，较优选2倍以上，更优选3倍以上。可测定针对长链脂肪酸的脂肪酰-辅酶A合成酶活性的增加，亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外,亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认fadD基因的mRNA量的增加。关于编码FadD的基因的具体实例，以大肠杆菌的fadD基因为例，包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号1887770 1886085(互补链)的位置，具有SEQ ID NO :5所示碱基序列的基因。SEQ ID NO :6显示了编码该基因的氨基酸序列。在本发明中，所谓“fadE基因”，意为这样的基因，其编码见于肠杆菌科细菌、催化氧化脂酰-辅酶A的酰基-辅酶A脱氢酶(acyl-CoA dehydrogenase)活性的酶(O' Brien,ff. J.和 Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132 :532-540 ；Campbell, J. W.和 Cronan,J. E. 2002. J. Bacteriol. 184 :3759-3764)。酰基-辅酶A脱氢酶活性是指催化下述反应(EC1. 3. 99. 3)的活性。酰基辅酶A+FAD = FADH2+ Δ 2_烯酰辅酶A 由fadE基因表达增强而导致的FadE活性的增强，可以通过对fadE增强前的细菌与增强后的细菌酰-辅酶A氧化活性进行比较来加以确认。举例而言，油酰辅酶A的氧化活性可依照例如Brien和Frerman的方法(O' Brien, ff. J.和Frerman, F. E. 1977.J. Bacteriol. 132 =532-540)来测定。活性测定，可通过从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四唑氢溴酸盐)和油酰辅酶A的反应液，根据546nm处的浊度测定还原的MTT的量。酰基-辅酶A脱氢酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内氧化的油酰辅酶A量(nM)来表示。与亲本株比较，期望FadE活性提高优选I. 5倍以上，较优选2倍以上，更优选3倍以上。亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外,亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认fadE基因的mRNA量的增加。关于编码FadE的基因的具体实例，以大肠杆菌的fadE基因为例，包括位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号243303 240859(互补链)，具有SEQ ID NO :7所示碱基序列的基因。SEQ ID NO :8显示了编码该基因的氨基酸序列。在本发明中所谓“fadB基因”，意为这样的基因，其编码见于肠杆菌科细菌、作为脂肪酸氧化复合体(fatty acid oxidation complex)的α部分、且催化烯酰辅酶 A 水合酶(enoyl-CoA hydratase)、3_ 轻基酸基辅酶 A 脱氧酶(3-hydroxyacyI-CoAdehydrogenase)、3_ 轻基酸基辅酶 A 差向异构酶(3-hydroxyacyI-CoA epimerase)、Δ 3_ 顺-Δ 2_ 反-烯酸辅酶 A 异构酶(Δ 3_cis_ Δ 2-trans-enoyl-CoA isomerase)四种活性的酶(Pramanik, A.等 1979. J. Bacteriol. 137 :469-473 ；Yang, S. Y. and Schulz, Η. 1983.J. Biol. Chem. 258 :9780-9785)。烯酰辅酶A水合酶活性是指催化下述反应(EC4. 2. I. 17)的活性H2O+反-2-烯酰辅酶A = L-3-羟基酰基辅酶A3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性是指催化下述反应(EC I. I. I. 35)的活性NAD++L-3-羟基酰基辅酶A = NADH+3-酮酰辅酶A3-羟基酰基辅酶A差向异构酶活性是指催化下述反应(EC 5. I. 2. 3)的活性D-3-羟基酰基辅酶A = L-3-羟基酰基辅酶AΛ 3-顺-Λ 2-反-烯酰辅酶A异构酶活性是指催化下述反应(EC 5. 3. 3. 8)的活性
顺-3-烯酰辅酶A =反-2-烯酰辅酶A由fadB基因表达增强导致的FadB活性增强，可通过例如对fadB增强前的细菌与增强后的细菌巴豆酰辅酶A (crotonyl-CoA)水合活性和乙酰乙酰辅酶A的还原活性进行比较来加以确认。FadB的四种活性可依照例如Binstock和Schulz的方法(Binstock, J. F.和Schulz, H. 1981. Methods EnzymoI. 71 (Pt C) :403-411)来测定。烯酰辅酶A水合酶活性的测定可通过例如下述方式进行从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含巴豆酰辅酶A的反应液， 根据263nm处浊度测定水合的巴豆酰辅酶A的量。烯酰辅酶A水合酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内巴豆酰辅酶A的水合量(nM)来表示。此外，3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性的测定可通过下述方式进行从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含乙酰乙酰辅酶A和NADH的反应液，根据340nm处浊度测定脱氢的NADH的量。3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内NADH的氧化量(nM)来表示。与亲本株比较，期望FadB活性提高优选I. 5倍以上，较优选2倍以上，更优选3倍以上。亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外,亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认fadB基因的mRNA量的增加。作为编码FadB的基因的实例，以大肠杆菌的fadB基因为例，包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号4028994 4026805 (互补链)的位置、具有SEQ ID NO :9所示碱基序列的基因。SEQ ID NO :10显示了该基因编码的氨基酸序列。在本发明中，所谓“fadA基因”，意为这样的基因，其编码见于肠杆菌科细菌、作为脂肪酸氧化复合体的β部分、且催化3-酮酰辅酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)活性的酶(Pramanik, A.等 1979. J. Bacteriol. 137 :469-473)。3-酮酰辅酶A硫解酶活性是指催化下述反应(EC 2. 3. I. 16)活性。3-酮酰辅酶A+辅酶A =酰基辅酶A+乙酰辅酶A由于fadA基因表达增强导致的FadA活性增强，可以通过例如对fadA增强前的细菌与增强后细菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性进行比较来加以确认。FadA活性，举例而言，可依照例如 Binstock 和 Schulz 的方法(Binstock, J. F.和 Schulz, H. 1981. MethodsEnzyrmoI. 71 (Pt C) :403-411)来测定。3-酮酰辅酶A硫解酶活性的测定可通过例如下述方式进行从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含乙酰乙酰辅酶A、镁盐和辅酶A的反应液，根据303nm处浊度测定作为底物的镁离子与烯醇酸复合体减少的量来进行。3-酮酰辅酶A硫解酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内乙酰乙酰辅酶A的减少量(nM)来表示。与亲本株比较，期望FadA活性提高优选I. 5倍以上,较优选2倍以上,更优选3倍以上。亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外,亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认fadA基因的mRNA量的增加。作为编码FadA的基因的具体实例，以大肠杆菌的fadA基因为例，包括大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号4026795 4025632 (互补链)的位置上具有SEQ ID NO: 11所示碱基序列的基因。SEQ ID NO :12显示了该基因编码的氨基酸序列。对于肠杆菌科细菌的脂肪酸氧化复合体而言，已知FadB和FadA形成复合体，且其基因亦形成 fadBA 操纵子(Yang, S. Y.等 1990. J. Biol. Chem. 265 :10424-10429)。因而，亦可扩增整个fadBA操纵子。在本发明中，所谓“cyoABCDE”，是编码见于肠杆菌科细菌的末端氧化酶中的一
种-细胞色素bo型氧化酶复合体(cytochrome bo terminal oxidase complex)中
的各个亚基的一群基因，其中cyoB是编码亚基I的基因、cyoA是编码亚基II的基因、cyoC是编码亚基III的基因、cyoC是编码亚基IV的基因、cyoE是编码催化血红素O合酶(heme O synthase)活性的酶的基因(Gennis, R. B.和 Stewart, V. 1996. p. 217-261.In F. D. Neidhardt (编)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition,American Society for Microbiology Press,Washington,D. C ； Chepuri 等 1990. J. Biol. Chem. 265 :11185-11192)。细胞色素bo型氧化酶复合体的末端氧化酶(terminal oxidase),是指下述反应(ECI. 10. 2.-以及I. 10. 3. _)，用从泛醇(ubiquinol)接受的电子将氧还原的活性，以及每I个电子排除2个质子的作为质子泵的机能(Puustinen, A.等1991. Biochemistry 30 3936-3942)。2 泛醇 +02+4H+ = 2 泛醌 +2H20+4H+由于cyoAB⑶E基因表达增强而导致的末端氧化酶活性增强，可以通过，例如，对增强前的微生物与增强后微生物的泛醇氧化酶活性进行比较来加以确认。泛醇氧化酶活性可依照例如 Kita 等的方法(Kita, K.等 1986. Methods Enzymol. 126 :94-113)来测定。可从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含泛醇的反应液，通过氧电极测定同样作为底物的氧的减少量。泛醇氧化酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内泛醇的减少量(PM)来表示。与亲本株比较，期望泛醇氧化酶活性提高优选I. 5倍以上，较优选2倍以上，更优选3倍以上。亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外,亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认各基因的mRNA量的增加。作为编码C1Ok的基因的具体实例，以大肠杆菌的cyoA基因为例，包括位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号450834 449887 (互补链)、具有SEQ ID NO : 13所示碱基序列的基因。SEQ IDNO :14显示了该基因编码的氨基酸序列。作为编码cyoB的基因的具体实例，以大肠杆菌的cyoB基因为例，可包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号449865 447874 (互补链)、具有SEQ ID NO : 15所示碱基序列的基因。SEQ IDNO :16显示了该基因编码的氨基酸序列。作为编码cyoC的基因的具体实例，以大肠杆菌的cyoC基因为例，可包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号447884 447270 (互补链)、具有SEQ ID NO : 17所示碱基序列的基因。SEQ IDNO :18显示了该基因编码的氨基酸序列。作为编码cyoD的基因的具体实例，以大肠杆菌的cyoD基因为例，可包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号447270 446941 (互补链)、具有SEQ ID NO : 19所示碱基序列的基因。SEQ IDNO :20显示了该基因编码的氨基酸序列。作为编码cyoE的基因的具体实例，以大肠杆菌的cyoE基因为例，可包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号446929 446039 (互补链)，具有SEQ ID NO :21所示碱基序列的基因。SEQ IDNO :22显示了该基因编码的氨基酸序列。在本发明中所谓“fadj基因”，意为这样的基因，其与fadj基因具有同源性，编码作为在厌氧和有氧条件下有功能的脂肪酸氧化复合体的α部分(CampbelI，J.W.等2003.Mol. Microbiol. 47 (3) :793-805)、催化烯酰辅酶A水合酶、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶、3-羟基酰基辅酶A差向异构酶、Δ 3-顺-Δ 2-反-烯酰辅酶A异构酶四种活性的酶(Pramanik,A.等 1979. J. Bacteriol. 137 :469-473 ；Yang, S. Y.和 Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258 9780-9785)。烯酰辅酶A水合酶活性是指催化下述反应(EC 4. 2. I. 17)的活性H2O+反-2-烯酰辅酶A = L-3-羟基酰基辅酶A3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性是指催化下述反应(EC I. I. I. 35)的活性NAD++L-3-羟基酰基辅酶A = NADH+3-酮酰辅酶A3-羟基酰基辅酶A差向异构酶活性是指催化下述反应(EC 5. I. 2. 3)的活性D-3-羟基酰基辅酶A = L-3-羟基酰基辅酶AΛ 3-顺-Λ 2-反-烯酰辅酶A异构酶活性是指催化下述反应(EC 5. 3. 3. 8)的活性顺-3-烯酰辅酶A =反-2-烯酰辅酶A由于fadj基因表达增强而导致的FadJ活性增强，可以通过例如对fadj增强前的细菌与增强后的细菌巴豆酰辅酶A水合活性和乙酰乙酰辅酶A的还原活性进行比较来加以确认。FadJ的四种活性可依照例如Binstock和Schulz的方法(Binstock, J. F.和Schulz,H. 1981. Methods EnzymoI. 71 (Pt C) :403-411)来测定。烯酰辅酶A水合酶活性的测定可通过例如下述方式进行从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含巴豆酰辅酶A的反应液，根据263nm处的浊度测定水合的巴豆酰辅酶A的量。烯酰辅酶A水合酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内巴豆酰辅酶A的水合量(nM)来表示。此外，3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性的测定，可通过从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含乙酰乙酰辅酶A和NADH的反应液，根据340nm处浊度测定脱氢的NADH的量来进行。3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内NADH的氧化量(nM)来表示。与亲本株比较，期望FadJ活性提高优选I. 5倍以上，较优选2倍以上，更优选3倍以上。亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外,亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认fadj基因mRNA量的增加。作为编码FadJ的基因的具体实例，以大肠杆菌的fadj基因为例，包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号2457181 2455037 (互补链)的位置，具有SEQ ID NO :37所示碱基序列的基因。SEQ ID NO :38显示了该基因编码的氨基酸序列。在本发明中，所谓“fadl基因”，是指这样的基因，其与fadA基因有同源性，编码作为在厌氧条件和有氧条件下有功能的脂肪酸氧化复合体的β部分(Campbell，J. ff.等2003. Mol. Microbiol. 47 (3) :793-805)、催化 3-酮酰辅酶 A 硫解酶活性的酶(Pramanik,A.等 1979.J. Bacteriol. 137 :469-473)。3-酮酰辅酶A硫解酶活性是指催化下述反应(EC 2. 3. I. 16)活性。3-酮酰辅酶A+辅酶A =酰辅酶A+乙酰辅酶A由于fadl基因表达增强而导致的FadI活性增强，可以通过例如对fadl增强前的细菌与增强后细菌的乙酰乙酰辅酶A硫解活性进行比较来加以确认。FadI活性，举例而言，可依照，例如，Binstock 和 Schulz 的方法(Binstock, J. F.和 Schulz, H. 1981. MethodsEnzymoI. 71 (Pt C) :403-411)来测定。3-酮酰辅酶A硫解酶活性的测定可通过例如下述方式进行从培养后收集的细胞制备粗酶提取液，添加含乙酰乙酰辅酶A、镁盐和辅酶A的反应液，根据303nm处浊度测定作 为底物的镁离子与烯醇酸复合体减少的量。3-酮酰辅酶A硫解酶活性用相对于粗酶提取液蛋白质在一分钟时间内乙酰乙酰辅酶A的减少量(nM)来表示。与亲本株比较，期望FadI活性提高优选I. 5倍以上,较优选2倍以上,更优选3倍以上。亦可通过Western印迹等方法确认蛋白质表达的增加。此外，亦可通过Northern印迹、RT-PCR等确认fadl基因mRNA量的增加。作为编码FadI的基因的具体实例，以大肠杆菌的fadl基因为例，包括例如位于大肠杆菌基因组序列(Genbank登录编号U00096)的碱基编号2458491 2457181 (互补链)、具有SEQ ID NO :39所示碱基序列的基因。SEQID NO :40显示了该基因编码的氨基酸序列。就见于肠杆菌科细菌的脂肪酸氧化复合体而言，FadI和FadJ形成复合体，且其基因亦形成 fadlJ 操纵子(Yang, S. Y.等 1990. J. Biol. Chem. 265 =10424-10429)。因而，亦可扩增整个fadlJ操纵子。就所述fadR基因、fadL基因、fadE基因、fadD基因、fadB基因、fadA基因、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE基因、fadj基因、fadl基因(下面总称为本发明的基因)而言，只要无损于其编码的蛋白质活性(即机能)，亦可使用这些基因的同源物和人工修饰物等具有保守突变的基因。具体地说，可以是这样的基因，其编码具有通过在公知蛋白质的氨基酸序列或野生型蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，38，40)中I或数个位置上取代、缺失、插入或添加I个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列的保守变体。在本文中，所谓I个或者数个根据氨基酸残基在蛋白质立体构造中的位置和种类而不同，但优选I 20个，较优选I 10个，特别优选I 5个。这样的变体，只要保持各蛋白质的机能，可与SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，38，或40的氨基酸序列具有80%以上，优选90%以上，较优选95%以上，特别优选98%以上的同一性(identity)。上述保守突变的代表是保守取代。所谓保守取代，为当取代部位是芳香族氨基酸时，是在Phe、Trp、Tyr间，当取代部位是疏水性氨基酸时，是在Leu、lie、Val间相互取代的突变，当取代部位是极性氨基酸时，是在Gin、Asn间相互取代的突变，当取代部位是碱性氨基酸时，是在Lys、Arg、His间相互取代的突变，当取代部位是酸性氨基酸时，是在Asp、Glu间相互取代的突变，当取代部位是携带羟基的氨基酸时，是在Ser、Thr间相互取代的突变。更具体而言，可例举Ala到Ser或Thr的取代,Arg到GlruHis或Lys的取代,Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，Asp到AsruGlu或Gln的取代，Cys到Ser或Ala的取代，Gln 到 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 的取代，Glu 到 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 的取代，Gly 到 Pro 的取代，His 到 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 的取代，Ile 到 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代，Leu 到 lie、Met、Val 或 Phe 的取代，Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 的取代，Met 到Ile、Leu、Val 或 Phe 的取代，Phe 到 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 的取代，Ser 到 Thr 或 Ala 的取代，Thr到Ser或Ala的取代，Trp到Phe或Tyr的取代,Tyr到His、Phe或Trp的取代以及Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸取代、缺失、插入、附加或倒位等亦包括基于携带本发明基因的微生物的个体差异，以及种间差异等天然产生的突变(突变体或变体)而产生的取代、缺失、插入、附加或倒位。此外，可以用易于本发明的基因要分别导入的宿主使用的密码子来取代。同样，就本发明的基因而言，其编码的蛋白质的N末端和/或C末端可以延长或削截，只要有功能即可。举例而言，延长的长度为氨基酸残基50个以下，优选20个以下，较优选10个以下，特别优选5个以下。如上所述保守的变体的编码基因，例如，通过位置特异性的诱变法，可对编码的蛋 白质的喊基序列修饰使得特定部位包含氣基酸残基的取代、缺失、摘入或添加而获得。此夕卜，亦可由向来已知的突变处理来获得。作为突变处理，可例举将本发明的基因用羟胺等体外处理的方法，以及将携带该基因的微生物，例如埃希氏菌属的细菌，用紫外线或N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍或者こ基甲磺酸(EMS)等作为常规突变处理使用的诱变剂处理的方法。此外，对于如上所述氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位等，亦包括基于携带本发明基因的微生物的个体差异，种的不同等情况天然产生的突变(突变体或变体)所产生的氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位等。这些基因是否编码FadL、FadE, FadD, FadB, FadA或细胞色素bo型氧化酶复合体可通过，例如，将这些基因导入微生物，并测定各蛋白质的活性来加以确认。本发明的基因可为具有上述碱基序列(SEQ ID NO : 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，37，39)的DNA，或可与从具有这些碱基序列的DNA制备探针在严格条件下杂交，且编码FadL、FadE> FadD> FadB> FadA> FadJ> FadI 或细胞色素 bo 型氧化酶复合体的 DNA。在本文中，所谓“严格条件”，是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性的杂交体的条件。将该条件明确的数值化是困难的，但举一例，具有高同源性的DNA之间，例如，具有80 %以上，较优选90 %以上，特别优选95 %以上同源性的DNA之间发生杂交，而低于此同源性的DNA之间不发生杂交的条件，或者，可例举相当于通常Southern杂交的洗涤条件，即 60°C、1XSSC、0. I % SDS,优选 O. I XSSC,O. I % SDS,更优选 68°C>O. I XSSC,O. I %SDS的盐浓度和温度下，洗涤I次，较优选2 3次的条件。而且，在本说明书中，“同源性，，(homology)可以指“同一性，，(identity)。 探针可具有本发明基因的一部分序列。这样的探针可通过本领域技术人员熟知的方法，以基于各个基因的碱基序列制备的寡核苷酸作为引物，以含有各个基因的DNA片段作为模板通过PCR反应来制备。而且，对探针使用长300bp左右的DNA片段吋，作为按照上述条件杂交后洗涤的条件，可例举50°C、2XSSC、0. 1% SDS0涉及上述保守变体的描述，亦适用就前述L-氨基酸生产能力的赋予所记述的酶和基因。
如上所述为了增强本发明基因表达而进行的修饰，可以使用与就L-氨基酸生产能力的赋予所记述的增强基因表达的方法同样的方法来实施。本发明的基因可以携带其的微生物染色体DNA作为模板通过PCR法获取。举例而言，大肠杆菌的fadL基因可用基于SEQ ID NO :3的碱基序列制备的引物，例如SEQ ID NO :25、26所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR法(polymerase chain reaction)法(參照 White, T. J.等 1989. Trends Genet. 5 :185-189)获取。大肠杆菌的fadD基因可用基于SEQ ID NO :5的碱基序列制备的引物，例如SEQ IDNO 27,28所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。大肠杆菌的fadE基因，可用基于SEQ ID NO 7的碱基序列制备的引物，例如SEQID NO 29,30所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。大肠杆菌的fadB基因，可用基于SEQ ID NO 9的碱基序列制备的引物，例如SEQID NO :31、32所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。大肠杆菌的fadA基因，可用基于SEQ ID NO 11的碱基序列制备的引物，例如SEQID NO 33,34所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。大肠杆菌的fadBA操纵子，可用基于SEQ ID NO 9和11的碱基序列制备的引物，例如SEQ ID NO :35、36所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。此外，大肠杆菌的cyoAB⑶E基因，可用基于SEQ ID NO 13和21的碱基序列制备的引物，例如SEQ ID NO :37、38所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。大肠杆菌的fadlj操纵子，可用基于SEQ ID NO 37和39的碱基序列制备的引物，例如SEQ ID NO :41、42所示的引物，通过以大肠杆菌染色体DNA为模板的PCR获取。来自其他微生物的本发明基因亦可通过将基于上述各个基因的序列信息以及该微生物中公知的基因或蛋白质的序列信息而制备的寡核苷酸作为引物的PCR法，或将基于前述序列信息而制备的寡核苷酸作为探针的杂交法，从微生物的染色体DNA或染色体DNA文库获取。此外，染色体DNA可通过，例如，斋藤和三浦的方法(Saito，H.和Miura，K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta，72，619-629 ;參照《生物工程实验书》，日本生物工学会编，97 98页，培风馆，1992年)等来从DNA供体微生物制备。本发明基因(fadL、fadE、fadD、fadB、fadA、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE、fadj、fadl)以及L-氨基酸生物合成系基因表达的增強，可利用如上所述的方法，通过转化或同源重组提高本发明基因的拷贝数，修饰本发明基因表达调节序列等方法来实现。此外，本发明基因表达的增强，亦可通过对可提高本发明基因表达的激活子进行扩增，和/或对可降低本发明基因的表达的调节子进行缺失或弱化来实现。下面，就增强基因表达的方法加以说明。第一种方法，是提高目的基因拷贝数的方法。举例而言，将目的基因克隆到合适的载体上，用所得载体转化宿主细菌，可使该基因拷贝数提高。转化用的载体可例举在适用的微生物中可自主复制的质粒。举例而言，作为在属于肠杆菌科细菌的微生物中可自主复制的质粒，可例举PUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29 (pHSG、pSTV 可得自 TakaraBio 公司)、、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW 可得自 Nippongene 公司)。而且，亦可使用噬菌体DNA代替质粒作为载体。转化法包括，例如，用氯化钙处理受体细菌增加DNA透过性的方法，如据报道用于大肠杆菌 K-12 的(Mandel, M.和 Higa，A. J. Mol. Biol. 1970,53 :159-162)、从增殖阶段的细胞制备感受态细胞而导入DNA的方法，如据报道用于枯草杆菌的(Duncan，C. H. ,Wilson,G. A.和Young，F. E. 1997. Gene 1:153-167)。或者，亦可应用将DNA受体细胞变为容易摄入重组DNA的原生质体(protoplast)或球状体(spheroplast)状态而将重组DNA导入DNA受体的方法，如已知用于枯草杆菌、放线菌类和酵母的(Chang，S.和Choen，S. N. 1979.Mol. Gen. Genet. 168 111-115 ；Bibb, M. J. , Ward, J. M.和 Hopwood, 0. A. 1978. Nature274 :398-400 ；Hinnen, A.，Hicks, J. B.和 Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 1929-1933)。此外，亦可通过电脉冲法(特开平2-207791号公报)进行微生物转化。基因拷贝数的提高亦可通过向微生物染色体DNA上导入目的基因的多个拷贝而实现。向微生物染色体DNA上导入基因的多个拷贝，可利用在染色体DNA上存在多个拷贝 的序列作为目标，通过同源重组法(Millerl, J. H. Experiments in Molecular Genetics,1972, Cold Spring Harbor Laboratory)来进行。作为在染色体DNA上存在多个拷贝的序列，可利用重复(repetitive)DNA和转座元件端部存在的反向重复序列(invertedrepeat)。或者，亦可如特开平2-109985号公报所公开的那样，将目的基因搭载在转座子上，使其转移，从而在染色体DNA上导入多个拷贝。而且,亦可使用Mu噬菌体(特开平2-109985号)将目的基因掺入宿主染色体。可通过将目的基因一部分作为探针，进行Southern杂交来确认该基因转移到了染色体上。此外，在提高基因拷贝数时，只要能够增强目的基因产物的活性，则对拷贝数并无特别的限制，在该微生物本来就具有目的基因吋，优选为2个拷贝以上。此外，微生物本来不具有本发明基因吋，导入的基因拷贝数是I个亦可，2个以上亦可。第二种方法，是将染色体DNA上或质粒上目的基因的启动子等表达调节序列用适当强度的相应序列取代，从而增强目的基因表达的方法。举例而言，thr启动子、Iac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子、tac启动子等是已知的常用启动子。启动子强度的评价法和强启动子的实例记载于Goldstein和Doi的论文(Goldstein, Μ. Α.和Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotecnnol. Annu. Rev.，1，105-128)等。此外，如在国际公开W000/18935中公开的，亦可向基因的启动子区域导入数个碱基的碱基取代，从而将其修饰为适当强度的启动子。表达调节序列的取代，例如，可与使用温度敏感型质粒的基因取代同样的方法进行。可在大肠杆菌和Pantoea ananatis中使用的具有温度敏感型复制起点的载体包括例如WO 99/03988号国际公开小册子所述的温度感受性质粒PMAN997及其衍生物等。此外，亦可通过使用λ噬菌体的Red重组酶，称为“Red驱动整合”的方法(Datsenko, K. A.和 Wanner, B. L. , 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 6640-6645)和Red驱动整合法与来自入噬菌体的切出系统(Cho, E. H.，Gumport, R. I.，和Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184 :5200-5203)的组合方法(參照 W02005/010175 号)等使用直链DNA的方法，进行表达调节序列的取代。而且，表达调节序列的修饰，可与如上所述提高基因拷贝数的方法组合使用。
而且，已知核糖体结合位置与起始密码子之间的间隔区(spacer)，特别是紧邻起始密码子上游的序列中数个核苷酸的取代对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可通过修饰它们来提高翻译量。对于编码细胞色素bo型氧化酶的cyo操纵子(cyoABCDE)，可以个别地增强其编码各个亚基的基因，亦可将它们作为多顺反子(polycistron)同时增強。此外，用载体将基因导入微生物时，可以将编码各个 亚基的基因装载在单ー载体上，亦可将它们分别装载在不同载体上。同样，将基因插入到染色体中时，编码各个亚基的基因既可同时插入染色体上同一部位，也可以各别插入不同的位置。
实施例以下通过实施例对本发明作更具体的说明。在实施例中，作为代表性的脂肪酸，使用油酸(C17H33COOH)的钠盐(Nacalai Tesque公司生产)。〔实施例I〕构建缺损fadR的大肠杆菌L-赖氨酸生产菌〈l-l>fadR基因缺损株的构建调节大肠杆菌脂肪酸代谢的转录因子FadR由fadR基因(SEQ ID N0:1)编码(DiRusso, C.C.等 1992. J. Biol. Chem. 267 :8685-8691)。该基因破坏的亲本株使用国际专利公报W02006/078039中记载的大肠杆菌L-赖氨酸生产株WC196 Λ cadA Λ I dcC株(AJl 10692 FERM BP-11027)。该株是在 WC196 株(FERM BP-5252)中破坏了 cadA 基因和IdcC基因而成的株。AJ110692株于2008年10月7日以保藏号FERM BP-11027基于布达佩斯条約国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址〒305-8566日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)。调节脂肪酸代谢的转录因子的编码基因fadR的缺失是借助由Datsenko和Wanner最初开发的称为“Red区动整合”的方法(Datsenko, K. A.和Wanner, B. L. 2000. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)和来源于 λ 噬菌体的切出系统(Cho, E. H.，Gumport,R. I.和Gardner，J. F. 2002. J. Bacteriol. 184 :5200-5203)来进行的。根据“Red驱动整合”，可以使用5’侧设计为目标基因的一部分、3’侧设计为抗生素抗性基因的一部分的合成寡核苷酸作为引物，使用所得的PCR产物ー步构建基因破坏株。而且，通过与来源于λ噬菌体的切出系统组合使用，可从基因破坏株中去除掺入的抗生素抗性基因(特开2005-058227)。作为PCR 的模板，使用质粒 pMW118-attL-kan_attR(特开 2005-058227)。pMW118-attL-kan-attR是在pMW118 (TakaraBio公司生产)中插入了作为附着位点(attachment site)的attL和attR基因以及作为抗生素抗性基因的kan基因而得到的质粒，插入顺序是attL-kan-attR。使用SEQ ID NO :23和24所示的合成寡核苷酸作为引物进行PCR，其中上述引物在3’末端具有对应于该attL和attR两端的序列，在5’末端具有对应于作为目的基因的fadR基因一部分的序列。扩增后的PCR产物用琼脂糖胶纯化,通过电穿孔法(electroporation)将其导入含具有温度敏感性复制能力的质粒PKD46的大肠杆菌AJl 10692株。质粒pKD46 (Datsenko,K. A.和 Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)包含 λ 噬菌体总计2154碱基的DNA片段(GenBank/EMBL登录号J02459、第31088号 33241号)，该片段包含由阿拉伯糖诱导性ParaB启动子控制的λ Red同源重组系统中的Red重组酶编码的基因(Y > β > exo基因)。质粒pKD46对于将PCR产物重组入AJ110692株而言是必须的。电穿孔用的感受态细胞如下所述制备。即，将在含100mg/L的氨苄青霉素(ampicillin)的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中30°C培养过夜的大肠杆菌WC196株，用含氨苄青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(IOmM)的5mL LB培养基稀释100倍。使所得的稀释物在30°C通气条件下生长到0D600为约O. 6后，浓缩100倍，用10%甘油洗涤三次而使其可用于电穿孔。电穿孔用70μ L的感受态细胞和约IOOng的PCR产物进行。向电穿孔后的细胞中添加ImL的SOC培养基(Sambrook，J.和Russell，D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York), 37°C培养 I 小时后，在 37°C在含 Km(卡那霉素)(40mg/L)的LB琼脂培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L、琼脂15g/L)上平板培养，选择Km抗性的重组体。接着，为了去除pKD40质粒，在含Km的LB琼脂培养基上，42V传代两次，测试所得菌落的氨苄青霉素抗性，获得了脱落PKD46的氨苄青霉素敏感株。针对借助卡那霉素抗性基因可识别的突变体，通过PCR确认了其fadR的缺失。将 所得的fadR缺损株命名为AJl 10692 Δ fadR: : att-kan株。接着，为了去除导入到fadR基因内的att-kan基因，使用上述的辅助质粒(helperplasmid) pMW-intxis-ts (特开 2005-058227)。pMW-intxis-ts 是携带了 λ 卩遼菌体的整合酶(integrase) (Int)的编码基因和切离酶(excisionase) (Xis)的编码基因，具有温度敏感型复制能力的质粒。遵循常规方法制备如上所述所得的AJ110692 Δ fadR: : att-kan株的感受态细胞，用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，于30°C在含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行平板培养，选择氨苄青霉素抗性株。接着，为了去除pMW-intxis-ts质粒，在LB琼脂培养基上，在42°C两次传代，测试所得菌落的氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性，获得对卡那霉素和氨苄青霉素敏感的株，即att-kan和pMW-intxis-ts脱落的fadR破坏株。将该株命名为AJ110692 Δ fadR。<1-2>将赖氨酸生产用质粒导入AJl 10692 Δ fadR株将41110692ムデ&(11 株用携带(1& 4、(1& 8、1780以及ddh基因的赖氨酸生产用质粒PCABD2 (W095/16042)按照常规方法进行转化，得到 AJl 10692 Δ fadR/pCABD2 株。将如上所述制备的菌株用25mg/L含链霉素的LB培养基在37°C培养至0D600为约0. 6之后，添加与培养液等量的40%甘油溶液，搅拌后以合适的量等分，在-80°C下以甘油保存液形式保藏。[实施例2]fadR缺损L-赖氨酸生产株的培养将AJl 10692 Δ fadR/pCABD2株和对照株AJ110692/pCABD2株的甘油保存液融解，各取100 μ L均匀涂布在含25mg/L链霉素的LB琼脂培养基平板上，在37°C下培养24小吋。将所得平板的约1/8量的菌体接种在500mL容量的坂ロ烧瓶内的20mL含25mg/L链霉素如下所述的发酵培养基中，置于往复振荡培养装置中37°C培养48小时。在主培养中，作为碳源，使用葡萄糖或油酸钠。对于油酸钠，以终浓度0.5% (w/v)添加了作为乳化促进剂的聚(氧こ烯)山梨醇单油酸酯(Tween 80 Nacalai Tesque公司生产)后加以使用。总碳源量为葡萄糖40g/L，油酸钠20g/L。通过其他途径确认了这样的菌株无法同化TWeen80。培养用的培养基组成如下所示[埃希氏菌属细菌L-赖氨酸生产培养基]碳源葡萄糖40g/L或油酸钠20g/LTween 805g/L其他成分
(NH4)2SO424g/LKH2PO4lg/LMgSO4 7H20lg/LFeSO4 7H200. Olg/LMnSO4 7H200. Olg/L酵母提取物2g/LCaCO3 (日本药局方)30g/L用KOH调整至pH7. 0，在120°C下进行20分的蒸汽灭菌。但碳源和MgSO4 *7H20系单独杀菌后混合。CaCO3在干热灭菌后添加。在48小时后，通过Biosensor-BF-5 (王子计测机器)测定培养上清中L-赖氨酸的量。生长度在葡萄糖培养的场合利用浊度(OD)测定，在用脂肪酸作为碳源的场合则将适当稀释后的培养液在LB平板上涂布，测定活菌数。每次使用两个烧瓶培养结果的平均值表不于表I (对于葡萄糖培养)和表2 (油酸钠培养)中。在用葡萄糖作为碳源时，fadR缺损株(AJl 10692 A fadR/pCABD2)的L-赖氨酸生产不及亲本株(AJ110692/pCABD2)。然而，在用油酸钠作为碳源时，fadR缺损株(AJ110692 AfadR/pCABD2)与亲本株(AJ110692/pCABD2)相比显示了显著的生长提高和L-赖氨酸生产。[表 I]表I :fadR缺损L-赖氨酸生产菌以葡萄糖作为碳源的培养结果
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菌株O.D.L-赖氨酸(g/L)AJ110692/pCABD216.714.8AJl 10692AfadR/pCABD2 17.4 14.3表2 fadR缺损L-赖氨酸生产菌以油酸钠作为碳源的培养结果
菌株活菌数L-赖氨酸(g/L)
(108/mL)-
AJ110692/pCABD242.53.0
AJl 10692AfadR/pCABD2 65.0_3A_
〔实施例3〕扩增了fad基因群的L-赖氨酸生产菌的构建<3-l>fad基因群扩增株的构建脂肪酸P 氧化途径的酶由 fadL(SEQ ID NO 3)、fadD(SEQ ID NO 5)、fadE(SEQID NO 7)、fadB(SEQ ID NO 9)、fadA(SEQ ID NO :11)所组成的基因群编码(Clark,D. P.和Cronan Jr. , J. E. 1996. 343-357 页 于 F. D. Neidhardt(编)，Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society forMicrobiology Press, Washington, D. C)。此外，fadB 和 fadA 形成由 fadBA 组成的操纵子。fadL基因用SEQ ID NO :25、26所示的引物、fadD基因用SEQ ID NO :27、28所示的引物、fadE基因用SEQ ID NO :29、30所示的引物、fadB基因用SEQ ID NO :31、32所示的引物、fadA基因用SEQ ID NO :33、34所示的引物、fadBA操纵子用SEQ ID NO :35、36所示的引物，以大肠杆菌野生株W3110株染色体DNA作为模板通过PCR法获得。<3-2>fadL基因扩增质粒的构建 使用SEQ ID NO 25所示的具有EcoRI位点的引物与SEQ ID NO 26所示的具有HindIII位点的引物以W3100株染色体DNA作为模板进行PCR，得到含fadL基因的PCR产物。将经纯化的PCR产物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadL基因的基因片段。将经纯化的fadL基因片段与用EcoRI和HindIII消化的pTWV228载体(TakaraBio公司生产)相连接，构建了用于扩增fadL基因的质粒pTWV-fadL。<3-3>fadD基因扩增质粒的构建使用SEQ ID NO 27所示的具有EcoRI位点的引物与SEQ ID NO 28所示的具有HindIII位点的引物，以W3100株染色体DNA作为模板进行PCR，得到含fadD基因的PCR产物。将经纯化的PCR产物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadD基因的基因片段。将经纯化的fadD基因片段与用EcoRI和HindIII消化的pTWV228载体(TakaraBio公司生产)连接，构建了用于扩增fadL基因的质粒pTWV-fadD。<3-4>fadE基因扩增质粒的构建使用SEQ ID NO 29所示的具有EcoRI位点的引物与SEQ ID NO 30所示的具有HindIII位点的引物以W3100株染色体DNA作为模板进行PCR，得到含fadE基因的PCR产物。将经纯化的PCR产物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadE基因的基因片段。将经纯化的fadE基因片段与用EcoRI和HindIII消化的pTWV228载体(TakaraBio公司生产)相连接，构建了用于扩增fadE基因的质粒pTWV-fadE。<3-5>fadB基因扩增质粒的构建使用SEQ ID NO 31所示的具有EcoRI位点的引物与SEQ ID NO 32所示的具有HindIII位点的引物以W3100株染色体DNA作为模板进行PCR，得到含fadB基因的PCR产物。将经纯化的PCR产物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadB基因的基因片段。将经纯化的fadB基因片段与用EcoRI和HindIII消化的pTWV228载体(TakaraBio公司生产)相连接，构建了用于扩增fadB基因的质粒pTWV-fadB。<3-6>fadA基因扩增质粒的构建如前所述用SEQ ID N0:33和SEQ ID NO :34所示的引物以W3100株染色体DNA作为模板进行PCR，得到含fadA基因的PCR产物。将经纯化的PCR产物与将载体pTWV228 (TakaraBio公司生产)经SalI纯化所得的质粒片段用In-Fusion Dry-Down PCRCloning Kit (Clonetech公司生产)相连接，构建了用于扩增fadA基因的质粒pTWV-fadA。<3-7>fadBA操纵子扩增质粒的构建使用SEQ ID NO 35所示的具有EcoRI位点的引物与SEQ ID NO 36所示的具有HindIII位点的引物以W3100株染色体DNA作为模板进行PCR，得到含fadBA操纵子的PCR产物。将经纯化的PCR产物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadBA操纵子的基因片段。将经纯化的fadBA操纵子片段与用EcoRI和HindIII消化的pTWV228载体(TakaraBio公司生产)相连接，构建了用于扩增adBA操纵子的质粒pTWV-fadBA。<3-8>向AJ110692株导入赖氨酸生产用质粒作为大肠杆菌的L-赖氨酸生产株，使用上述AJ110692/pCABD2株。将AJ110692株用前项中制备的携带fad基因群的质粒pTWV-fadL、pTWV-fadD、pTWV-fadE、pTWV-fadB、pTWV-fadA、pTWV-fadBA、以及对照载体pTWV228遵循常规方法转化，分别得到AJ110692/pCABD2/pTWV-fadL, AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadD, AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadE,AJ110692/pCABD2/pTWV-fadB,AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadA, AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadBA、以及 AJ110692/pCABD2/pTWV228 株。将如上所述制备的菌株用含50mg/L的氨苄青霉素与20mg/L的链霉素的LB培养基37°C培养到0D600为约0. 6之后，添加与培养液等量的40%甘油溶液搅拌之后，以合适的量等分，在_80°C下以甘油保存液形式保藏。[实施例4]fad基因群扩增L-赖氨酸生产株的培养将在实施例3中得到的fad基因群扩增株的甘油保存液融解，各取IOOii L均匀涂布在含50mg/L氨苄青霉素和20mg/L的链霉素的LB平板上，在37°C下培养24小时。将所得平板上的约1/2量的菌体接种在AGC Techno Glass公司制的试管(直径x长度x壁厚(mm) = 25x200x1. 2)内的5mL含50mg/L氨节青霉素和20mg/L链霉素如下所述的发酵培养基中，置于往复振荡培养装置中37°C培养72小时。作为主培养中的碳源，向油酸钠中以终浓度0.5% (w/v)添加作为乳化促进剂的聚(氧乙烯)山梨醇单油酸酯(Tween 80:Nacalai Tesque公司生产)后加以使用。总碳源量为油酸钠10g/L。培养用的培养基组成如下所示[埃希氏菌属细菌L-赖氨酸生产培养基]碳源油酸钠10g/LTween 805g/L其他成分(NH4)2SO424g/LKH2PO4lg/LMgSO4 7H20lg/LFeSO4 7H200. Olg/LMnSO4 7H200. Olg/L酵母提取物2g/LPIPES (pH7. 5)20g/L用KOH调整至pH7. 5，在115°C下进行10分的蒸汽灭菌。但碳源、MgSO4 7H20及PIPES单独杀菌后混合。在72小时后,通过BioTech Analyzer (Sakura精机)测定培养上清中L-赖氨酸的量。对于主培养基，将培养液与等量10% Tween80溶液混合测定浊度(OD)，以确定生长度。每次使用三个烧瓶培养结果的平均值，在表3中表示。相对于导入载体pTWV228 的对照株，fadL、fadD、fadE、fadB、fadA、fadBA 基因导入株显示L-赖氨酸生产显著升高。[表3]表3 :fadR基因群扩增L-赖氨酸生产菌培养结果 菌株O.D.L-赖氨酸(g/L)
AJ110692/pCABD2/pTWY2288,53.2
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadL7.74.7
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadD104.6
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadE8.25.0
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadB11.33.9
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadA9.73.9
AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadBA9.54.3
--7-〔实施例5〕扩增了fad基因群的L_苏氨酸生产菌的培养作为L-苏氨酸生产菌，使用EP 0593792所述的大肠杆菌VKPM B-5318株。用在实施例〈3-1>中制备的携带fad基因群的质粒pTWV-fadL、pTWV-fadD、pTWV-fadE、以及对照载体PTWV228 遵循常规方法转化B-5318 株，分别得到 B-5318/pTWV-fadL、B_5318/pTWV-fadD、B-5318/pTWV-fadE 以及 B_5318/pTWV228 株。将如上所述制备的菌株用含50mg/L的氨苄青霉素与20mg/L的链霉素的LB培养基37°C培养到0D600为约0. 6之后，添加与培养液等量的40%甘油溶液，搅拌之后以合适的量等分，在_80°C下以甘油保存液形式保藏。[实施例6]fad基因群扩增L-苏氨酸生产株的培养将B-5318/pTWV-fadL 株、B-5318/pTWV-fadD 株、B-5318/pTWV-fadE 株以及B-5318/pTWV228株的甘油保存液融解，各取100 u L均匀涂布在含50mg/L氨苄青霉素和25mg/L的链霉素的LB平板上，在37°C下培养24小时。将所得平板约1/4量的菌体接种在容积500ml的带挡流板三角烧瓶内的40mL含50mg/L氨节青霉素和25mg/L链霉素如下所述的发酵培养基中，置于往复振荡培养装置中40°C培养48小时。主本培养中，作为碳源，向油酸钠中以终浓度0.5% (w/v)添加作为乳化促进剂的聚(氧乙烯)山梨醇单油酸酯(Tween80 =Nacalai Tesque公司生产)后使用。总碳源量为油酸钠10g/L。培养用的培养基组成如下所示[埃希氏菌属细菌L-苏氨酸生产培养基]
碳源油酸钠10g/LTween 805g/L其他成分(NH4)2SO416g/LKH2PO4lg/L
权利要求
1.一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，在包含脂肪酸或油脂的水解物的培养基中培养提高了脂肪酸同化能力且具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌，从而在培养基或菌体内生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集L-氨基酸。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述细菌是通过修饰选自参与脂肪酸同化的基因群中的I种或2种以上的基因而提高了脂肪酸同化能力的细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细菌是通过弱化fadR基因的表达或者使fadR基因缺损而提高了脂肪酸同化能力的细菌。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细菌是通过增强选自fadl、fadj、fadL、fadE、fadD、fadB和fadA中的I种或2种以上的基因的表达而提高了脂肪酸同化能力的细菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述基因是fadB和fadA。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述基因是fadl和fadj。
7.根据权利要求I 6中任一项所述的方法，其中，所述细菌是通过增强cyoABCDE操纵子的表达而提高了脂肪酸同化能力的细菌。
8.根据权利要求I 7中任一项所述的方法，其中，所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
9.根据权利要求I 8中任一项所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。
10.根据权利要求I 9中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自L-苏氨酸、L-赖氨酸和L-色氨酸中的I种或2种以上的氨基酸。
全文摘要
通过将属于肠杆菌科，提高了脂肪酸同化能力，具有L-氨基酸生产能力的细菌以脂肪酸或油脂水解物作为碳源在培养基中培养，在培养物中生产蓄积L-氨基酸，自该培养物收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。
文档编号C12P13/08GK102741420SQ20098011858
公开日2012年10月17日 申请日期2009年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者土井秀高, 寺下优, 星野康, 臼田佳弘 申请人:味之素株式会社