专利名称：一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉抑制酸乳发酵及储藏的技术领域，具体涉及从酪蛋白酶解液分离得到的 具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的生物活性单肽及其应用。
背景技术：
酸乳是指在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的作用下，使用添加(或不添加)乳 粉(全脂或脱脂)的乳进行乳酸发酵而得到的凝固乳制品，最终产品中必须含有大量的活 菌。乳酸菌的发酵作用可以使乳白蛋白变成微细的凝乳粒，易于消化吸收，发酵过程中乳酸 菌可以产生机体营养所必需的维生素、烟酸和叶。酸乳除了保留了牛奶的全部营养外，其 与鲜奶最显著的差异就是在于它还含有大量的乳酸及易于人体肠道健康的活性乳酸菌。我国酸乳生产中所用的乳酸菌大多为国外购进的直投式发酵剂(Direct-to vat caulture，简称DVS)，继代式酸乳菌种的应用量相当小。与液体菌种相比，直投式发酵剂的 潜伏期要长得多。其发酵时间通常比使用传统的翻代液体发酵剂要延长2 3小时左右， 对于大型乳品厂，这是一个不容忽视的影响因素。因此，如何缩短直投式菌种的发酵时间， 提高生产效率，以及如何采取有效手段在减少发酵剂使用量，同时保证产品品质，来降低成 本也是重要的研究方向。在酸乳发酵过程中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌具有生长互补的作用或称为共 生(Mutualism)，球菌的生长同时会促进杆菌的生长，而杆菌生长形成的代谢产物又保证球 菌的生长。乳杆菌对酸乳的贡献是分解蛋白质、产酸，链球菌对酸乳的良好风味和感官品质 具有重要作用。酸乳在货架期必须保持微生物活性和良好的质构和风味。即使冷藏在0 5°C条件下，乳酸菌的新陈代谢导致的后酸化现象依然存在，这造成过乳清析出、酸味过重 甚至产生涩味。以上现象严重影响酸乳的品质导致其保质期被大大缩短。因此，通过在酸乳中添加具有含有益生功能因子的酪蛋白生物活性肽，有效地促 进酸乳发酵缩短发酵时间并且抑制酸乳再储藏期间产生后酸化延长酸乳保质期，对酸乳行 业具有重大的经济价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种有牛乳来源的、高安全性 的、具有可产业化的酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用。为实现上述目的，本发明采用以 下技术方案。—种酪蛋白活性单肽的制备方法与应用，包括如下步骤
(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解
液；
(2)当水解度达到9% 10%时，90 95°C加热15 20min灭酶，终止酶解反应以控 制生物活性肽的分子量；
(3)将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。上述的制备方法，步骤(3)中将灭酶活的酶解液在4°C下以6000 g离心20分钟，将 上清液经超滤(取分子量小于3000道尔顿的组分)后，采用大孔树脂NKA-II，收集10-20% (w/w)乙醇洗脱液，接着采用S^hadex (葡聚糖凝胶)G-25，流动相为去离子水，检测波长 220nm，按吸收峰顺序收集；经S印hadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效 液相色谱分离纯化，分离条件为5_40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm， 按吸收峰顺序收集。本发明还提供了由上述制备方法制得的具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的 酪蛋白活性单肽。上述酪蛋白活性单肽，通过液相色谱-电喷雾串联质谱测定其分子量为801. 4道 尔顿，该活性单肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。所述的酪蛋白活性单肽可应用于酸乳发酵中，促进酸奶发酵，抑制酸奶后酸化。本发明采用了以上技术方案，具有如下优点和效果
1、本发明通过对酪蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了氨基酸序列为NPSKENL的 肽，该活性肽具有明显缩短酸乳发酵时间和抑制酸乳后酸化作用。2、本发明分离纯化所得的生物活性肽是从酪蛋白中分离得到的乳源性肽，可以安 全的添加的到酸乳中。
图1为S印hadex G-25对酪蛋白酶解液的初步分离图； 图2为RP-HPLC对生物活性肽的分离纯化图3为实施方式中添加50ppm (w/w)生物活性单肽对酸乳发酵周期和空白对照对应酸 乳发酵周期的影响曲线；
图4为实施方式中添加50ppm (w/w)生物活性单肽对酸乳储存期产酸的影响曲线和空 白对照对应的影响曲线。图5为实施方式中添加50ppm (w/w)的生物活性单肽对酸乳储存期乳酸菌活菌数 的影响曲线和空白对照对应的影响曲线。
具体实施方案下面结合附图和实施例对本发明的具体实施作进一步说明。实施例1 利用酪蛋白酶解液生产具有显著的促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的 生物活性单肽
1、可控酶解在50°C，PH 6. 0的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。2、酶解液灭酶90°C加热15min灭酶，终止酶解反应。3、将灭酶活的酶解液离心(6000 χ g，4°C ) 20分钟，将上清液经超滤(取分子量小 于3000道尔顿的组分)后，采用大孔树脂NKA-II，收集10% (w/w)乙醇洗脱液，接着
采用S印hadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图1所示。 经S印hadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条 件为5% (w/w)乙腈和95% (w/w)去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集， 如图2所示。
实施例2 利用酪蛋白酶解液生产具有显著的促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的生物 活性单肽
1、可控酶解在55°C，pH 7. 5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。2、酶解液灭酶95°C加热20min灭酶，终止酶解反应。3、将灭酶活的酶解液离心(6000 χ g，4°C ) 20分钟，将上清液经超滤(取分子量小 于3000道尔顿的组分)后，采用大孔树脂NKA-II，收集20% (w/w)乙醇洗脱液，接着
采用Si^phadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图1所示。 经S^hadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条 件为40% (w/w)乙腈和60% (w/w)去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收 集，如图2所示。
实施例3 生物活性肽对酸乳发酵周期的影响
在酸乳发酵前添加50ppm (w/w)实施例1所得生物活性肽HAQQKE替换等蛋白的奶 粉，测定酸乳发酵周期，即TPH4.5，酸乳发酵到pH4. 5所需要的时间，单位为小时。如图3所 示，添加NPSKENL后酸乳发酵周期缩短了 23. 00%。实施例3 生物活性肽对酸乳储藏期的酸度变化的影响
测定按实施例2所发酵酸奶在28天储藏期间的滴定酸度即洁尼尔度T°变化。试验方法用5ml吸管取搅拌均勻的发酵乳5ml，加入含25ml蒸馏水锥形瓶中，滴 入3 4滴1%酚酞指示剂，用0. INNaOH滴定至浅红色，保持20s不退色。消耗NaOH溶液 的毫升数乘以20即为酸度T°。由图4可见，添加NPSKENL后酸乳储存28天后产酸量相对于空白样减少了 24. 07%，这表明50ppm的NPSKENL可明显抑制酸乳乳储存过程中产酸，有助于保持酸乳产品 风味，延长保质期。实施例4 生物活性肽对酸乳储藏期的乳酸菌活菌数变化的影响
测定按实施例2所发酵酸奶在28天储藏期间的乳酸菌活菌数变化，采用试管法。试验方法在无菌操作条件下，将酸乳充分搅拌均勻，移取1ml，加入含9ml稀释 液试管内，制成1 : 10的均勻稀释液，并在涡流仪上充分混勻。再从后者中吸取Iml于9ml 稀释液中，并依次做10倍递增稀释至10_6，ΙΟ"7两个稀释度。每个稀释度吸取Iml于灭菌试 管培养基中，做两个平行样，在37°C恒温培养箱中培养72h。图5表明，添加NPSKENL后，酸乳在储藏28天后乳酸菌活菌数是空白的2. 35倍， 结果表明生活活性肽NPSKENL能够显著促进乳酸菌生长繁殖，提高酸乳品质。
权利要求
一种酪蛋白活性单肽，该活性单肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.权利要求1所述一种酪蛋白活性单肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；(2)当水解度达到9% 10%时，90 95°C加热15 20min灭酶，终止酶解反应以控 制生物活性肽的分子量；(3)将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离 纯化，即得所述生物活性肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中将灭酶活的酶解液在4°C 下以6000 g离心20分钟，将上清液经超滤，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用大孔树 脂NKA-II，用10-20% (w/w)乙醇洗脱，收集洗脱液，接着采用Sephadex G-25，流动相为去 离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经S印hadex G-25分离得到的具有较强活性 的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗 脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集。
4.权利要求1所述的酪蛋白活性单肽应用于酸乳发酵中，促进酸奶发酵，抑制酸奶后 酸化。
全文摘要
本发明提供一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用，氨基酸序列为Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。本发明应用现代酶催化技术对酪蛋白进行酶解，利用生物分子分离纯化技术对具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的活性单肽进行氨基酸序列分析。该活性肽具有明显缩短酸乳发酵时间和抑制酸乳后酸化作用，可以安全的添加的到酸乳中，将该生物活性肽作为酸乳发酵添加剂提高酸乳产品质量。
文档编号A23C9/13GK101993476SQ201010277790
公开日2011年3月30日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者崔春, 张清丽, 赵海锋, 赵谋明 申请人:华南理工大学