专利名称：检测食品中转基因成分的方法
技术领域：
本申请涉及生物技术领域。具体地说，本申请涉及检测食品中转基因成分的方法和试剂盒。
背景技术：
随着转基因技术的发展，通过导入外源基因可以实现对植物和动物原有基因的改造，从而得到营养成分改善、抗逆性能提高、性状优良的植物和动物。目前，越来越多的转基因植物和动物被批准进入商品化生产。与此同时，这类通过转基因技术得到的动植物及其加工产品(如食品)的使用安全性问题也日益引起了人们的关注。因此，转基因食品成分的检测成为转基因食品安全评估的基础。目前国际上对食品中转基因成分的检测主要采用PCR法，以及在此基础上发展出的实时定量PCR法及多重PCR法。所检测的靶基因大多是已知商品化的转基因食品成分中的几种，主要是抗虫、抗除草剂成份。但是，对于正在研发阶段的抗逆、品质改良、生长发育等转基因植物成分的检测则基本未涉及。
发明内容
本发明建立了高效、快速、灵敏、特异的多重PCR(Multiplex PCR)-LDR(连接酶检测反应)-UA(通用芯片)检测方法，将有助于转基因食品成分的检测，有利于在此基础上进一步评估新型转基因食品成分的安全性。本发明可被食品安全检测机构应用于食品中转基因成分的检测。本发明第一方面提供了一种用于检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性 Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21基因、Irp基因和osvte基因的引物对。本发明另一方面提供了一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)提取所述食品的DNA ；b)用第一引物组对所述提取的DNA进行PCR扩增，所述第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；用第二引物组对提取的DNA 进行PCR扩增，所述第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21 基因、Irp基因和osvte基因的引物对；c)检测所述PCR扩增产物，从而确定所述食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。本发明还有一个方面提供了一种用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包含以下两组探针1)鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；和2)通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。本发明还有一个方面提供了一种检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该方法包括以下步骤a)提供核酸混合物；b)在核酸混合物中加入通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；其中，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与Zip探针序列互补的序列；所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记；c)使步骤b)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，检测杂交结果，从而确定核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。本发明以转基因水稻为例，提供了一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该检测方法具有高效、快速、灵敏、特异的优点。本发明的方法有助于检测市场上是否有未经批准的转基因水稻流入，以满足消费者对于转基因产品的知情权和选择权，同时为进一步评估新型转基因食品成分的安全性奠定了基础。本发明的其它方面、优点或益处可通过下文详细描述结合附图得知。
图1显示了用PCR检测Bt/CpTl双价抗虫转基因水稻及其亲本(未转基因水稻) 中的启动子和终止子的结果，其中1 空白对照；2 未转基因水稻，3 :Bt/CpTl转基因水稻。图2显示了转AGLU/RCH10基因水稻及其亲本中肌动蛋白、18s rRNA和nos终止子的PCR扩增结果，其中1 未转基因水稻；2-7 转AGLU/RCH10基因水稻的几个株系。图3显示了 PCR检测转基因水稻中的AGLU/RCH10基因的结果，其中1 未转基因水稻；2-4 转AGLU/RCH10基因水稻的几个株系。图4显示用多重PCR检测转基因水稻中外源基因的启动子、终止子及内源标志基因的结果。图5显示用多重PCR检测转基因水稻中的外源基因的结果。图6显示转基因水稻初筛芯片杂交结果。A，转基因水稻；B，非转基因水稻。每个株系均包括转基因水稻及其亲本转)(a21基因抗白叶枯病水稻，Bt/CpT I双价抗虫水稻， RCH10/AGLU双价抗纹枯病水稻，转Bar基因抗除草剂水稻，转四菱豆高赖氨酸蛋白质(Irp) 水稻，转OSVTEl基因耐旱水稻。图7显示转基因水稻外源基因芯片杂交结果。A，转基因水稻；B，非转基因水稻。 每个株系均包括转基因水稻及其亲本转叙21基因抗白叶枯病水稻，Bt/CpT I双价抗虫水稻，RCH10/AGLU双价抗纹枯病水稻，转Bar基因抗除草剂水稻，转四菱豆高赖氨酸蛋白质 (Irp)水稻，转OSVTEl基因耐旱水稻。
具体实施例方式本发明将多重PCR(Multiplex PCR)与连接酶检测反应(Ligationdetectionreaction，LDR)_ 通用芯片(universal array,UA)技术相结合，从而建立了一种高效、快速、灵敏、特异的植物源性转基因成分检测方法。首先，本发明提供了一种用于检测食品(例如水稻加工产品)中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21基因、Irp基因和osvte 基因的引物对。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含以下引物对CaMV 35s €云力〒 iE[n| agactggcgaaccagttcatacaga (SEQ ID NO 5)Jxt^ gcaatggaatccgaggaggt (SEQ ID NO 6)nos 终止子正向 tgaatcctgttgccggtctt(SEQ ID NO 7)Jx ( aaatgtataattgcgggactctaatc(SEQ ID NO 8)FMV 35s 启动子正向 cagcattccagattgggttca (SEQ ID NO 9)反向 cttttggctaatggtttggagac(SEQ ID NO 10)Bartgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO 11)反向 ctgccagaaacccacgtcat (SEQ ID NO 12)Bt正向 aacctgtgggagaatccttgc (SEQ ID NO :13)反向 cttgccatccgctgtttaca(SEQ ID NO :14)Cptl正向 ctaaatcaatacctcctcaatgcca (SEQ ID NO :15)反向 cttactcatcatcttcatccctgga(SEQ ID NO :16)RchlO正向 cagcacaacccaaagccata (SEQ ID NO :17)Jx (r] gcgaagcccgagtaggagct (SEQ ID NO :18)Xa21正向 cagcacaacccaaagccatat (SEQ ID NO : 19)Jx (r] gcgaagcccgagtaggagc (SEQ ID NO :20)IrpJEt^ gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO :21)Jx.[n] gcagagaacaacaggacgaaga (SEQ ID NO :22)osvte正向 cagtggctcctgctatcctttaca (SEQ ID NO :23)Jx (r] caaagcagcaccaccaactatg (SEQ ID NO :24)。在一个优选的实施方案中，所述第一引物组和所述第二引物组混合在一起。在另一实施方案中，所述第一引物组和所述第二引物组分开放置。在另一优选的实施方案中，所述试剂盒还包含用于同时扩增多目的基因的PCR反应体系。作为本发明的一个具体实施例，所述PCR反应体系为DNA模板(即提取的DNA) 各lOOng，10XPCR缓冲液10 μ 1，dNTP各10mmol/L 2 μ 1，上、下游引物混合物各5 μ mol/L 1μ l，Taq酶2μ 1，双蒸水补足至100 μ 1。所述PCR反应条件为95°C模板变性5min，95°C 变性30s，55°C退火40s，72°C延伸lmin，共40个循环，最后72°C延伸lOmin。当然，上述条件仅仅是适用于本发明方法的一个具体实验条件，本领域技术人员完全能够在不影响PCR 扩增的情况下对上述步骤或反应条件进行变化或改动，所有的这些改动均在本发明的等同范围内。在另一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含连接酶检测基因芯片系统。因此，本发明的另一方面还提供了一种连接酶检测基因芯片系统，所述系统包含连接酶反应体系；基因芯片，所述芯片上连接了 Zip探针序列；鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述Zip探针序列互补的序列；通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。所述连接酶反应体系包含耐高温的DNA连接酶。本领域技术人员可以根据现有技术选择适用于本发明的具体种类的DNA连接酶。适用于本发明方法的一个具体的反应体系是10μ L经消化的多重PCR产物，20mM Tris-HCKpH 7. 6), IOmM DTT，ImM NAD,0. 1% Triton X-100，每种鉴别探针各 lpmol，每种通用探针各 lpmol，40U/yL Taq DNA 连接酶 0.5 μ L。LDR 反应条件为 94°C 30s，63°C 4min， 共40个循环。连接酶是一种封闭DNA/RNA链上缺口(Nick)的酶，借助NAD+或ATP水解提供的能量催化2条核酸单链的3'端羟基和5'端磷酸基团反应形成磷酸二酯键。在连接酶催化两段探针连接过程中，连接酶识别位点3'端5个碱基之内任何一个位置的碱基发生错配都会导致连接探针不能正常连接。因此，在本发明的方法中，鉴别探针和通用探针被设计成了分别与目标基因中的两个毗邻的片段互补。当PCR扩增产物中存在待测基因时，连接酶就能将两端探针连接起来，随后通过鉴别探针中的cZip探针序列(与Zip探针序列互补) 与基因芯片上的Zip探针序列结合而固定在芯片上。利用各种检测手段检测通用探针上的可检测标记从而实现检测目的。在一个优选的实施方案中，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO :25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO 37-48所示的探针序列。在另一优选的实施方案中，所述可检测标记例如可以是荧光团、发色团、放射活性原子(例如32P和125I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(Tiffi)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以也应属于本发明范围内的等价方案。因此，本发明还有一个方面提供了一种用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包含以下两组探针1)鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；和2)通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。所述待检测的核酸混合物中可能含有待检测的转基因成分。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒可用于检测水稻外源基因的启动子(如CaMV 35S启动子、FMV35S启动子)、终止子(如nos终止子)和及内源标志基因(如肌动蛋白基因)以及外源基因(如 Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21基因、Irp基因和osvte基因)。在这一情况下，所述核酸混合物可以是用本发明所述的多重PCR方法获得的PCR扩增产物。此时，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO :25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO 37-48所示的探针序列。本发明另一方面提供了一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)提取所述食品的DNA ；b)用第一引物组对所述提取的DNA进行PCR扩增，所述第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；用第二引物组对提取的DNA 进行PCR扩增，所述第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21 基因、Irp基因和osvte基因的引物对；c)检测所述PCR扩增产物，从而确定所述食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。所述步骤a)可以采用本领域技术人员熟知的各类DNA提取技术或市售的DNA提取试剂盒来进行。在一个优选的实施方案中，可采用购自DNA提取试剂盒(TakaraCat. No. D9093)。在一个优选的实施方案中，在所述步骤b)中采用以下引物对对提取的DNA进行 PCR扩增CaMV 35s €云力〒 iE[n| agactggcgaaccagttcatacaga (SEQ ID NO 5)Jxt^ gcaatggaatccgaggaggt (SEQ ID NO 6)nos 终止子正向 tgaatcctgttgccggtctt (SEQ ID NO 7)反向 aaatgtataattgcgggactctaatc (SEQ ID NO 8)FMV 35s 启动子正向 cagcattccagattgggttca (SEQ ID NO 9)反向 cttttggctaatggtttggagac(SEQ ID NO 10)Bar!￡( tgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO :11)反向 ctgccagaaacccacgtcat (SEQ ID NO 12)Bt正向 aacctgtgggagaatccttgc (SEQ ID NO :13)反向 cttgccatccgctgtttaca(SEQ ID NO :14)Cptl正向 ctaaatcaatacctcctcaatgcca (SEQ ID NO :15)反向 cttactcatcatcttcatccctgga(SEQ ID NO :16)RchlO正向 cagcacaacccaaagccata(SEQ ID NO :17)Jx (r] gcgaagcccgagtaggagct (SEQ ID NO :18)Xa21 正向 cagcacaacccaaagccatat (SEQ ID NO :19)Jx.[n] gcgaagcccgagtaggagc (SEQ ID NO :20)Lrp !￡( gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO :21)Jx.[n] gcagagaacaacaggacgaaga (SEQ ID NO :22)Osvte 正向 cagtggctcctgctatcctttaca (SEQ ID NO :23)Jxt^ C￡l￡l￡lgC￡lgC￡lCC￡lCC￡l￡lCt￡ltg(SE;Q ID NO :24)。所述步骤b)中的PCR反应体系为提取的DNA各lOOng，10XPCR缓冲液10 μ 1， dNTP各l(toimol/L 2 μ 1，上、下游引物混合物各5 μ mol/L 1 μ 1，Taq酶2 μ 1，双蒸水补足至 100 μ 1 ；所述PCR反应条件为95°C模板变性5min，95°C变性30s，55°C退火40s，72°C延伸lmin，共40个循环，最后72°C延伸lOmin。所述步骤b)中的两个扩增反应可以分开进行，也可以同时进行。在本发明的另一优选实施方案中，在所述步骤C)中，采用连接酶检测基因芯片系统检测所述PCR扩增产物，所述系统包含连接酶反应体系；基因芯片，所述芯片上连接了 Zip探针序列；鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述Zip探针序列互补的序列；通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。具体而言，所述连接酶反应和基因芯片检测步骤如下a)提供待检测样品，例如PCR扩增产物；b)用蛋白酶(如LPK)消化PCR扩增产物；c)在扩增产物中加入设计好的各种通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；d)使步骤C)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，从而使芯片上的Zip探针序列与鉴别探针中的cZip探针序列(即与所述Zip探针序列互补的序列)杂交，然后检测杂交结果。作为一个本发明的具体实例，所述步骤C)的连接酶反应体系如下10yL经消化的多重 PCR 产物，20mM Tris-HCl (pH 7. 6), IOmM DTT，ImM NAD，0. 1% TritonX-100，每种鉴别探针各Ipmol，每种通用探针各lpmol，40U/y L Taq DNA连接酶0. 5 μ L。LDR反应条件为 940C 30s, 630C 4min，共 40 个循环。在本发明的另一优选方案中，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO :25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO 37-48所示的探针序列。在本发明的另一优选方案中，将对应于外源基因调控元件(例如CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子)的Zip探针固定于第一基因芯片上，将对应于外源基因 (例如Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21基因、Irp基因和osvte基因)的 Zip探针固定于第二基因芯片上，从而能够实现用前者来初步筛选食品中是否存在转基因成分，用后者来确定食品中存在哪种转基因成分。本发明上述的连接酶检测基因芯片系统检测也可以用于检测通过其它方法从水稻或水稻加工产品获得的核酸混合物。因此，本发明另一方面提供了一种检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该方法包括以下步骤a)提供待检测样品，例如核酸混合物(例如从水稻或水稻加工产品获得的核酸混合物)；b)在待检测样品中加入通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；其中，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记；c)使步骤b)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，从而使芯片上的Zip探针序列与鉴别探针中的cZip探针序列(即与所述Zip探针序列互补的序列)杂交，然后检测杂交结果，从而确定核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。在一个优选的实施方案中，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO :25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO 37-48所示的探针序列。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、 重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷 (D. N. Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B. D. Hames 和S. J. Higgins编辑· 1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag, N. Y.)， 以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Wfeir和C. C. Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。1.转基因作物样本的收集本发明者收集了 8种转基因水稻样本(表1)，这些样本的性状包括抗病、抗虫、 抗除草剂、抗逆、品质改良。表1收集的转基因水稻样本
权利要求
1.一种用于检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV35S启动子、 nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21基因、Irp基因和osvte基因的引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述试剂盒包含以下引物对 CaMV 35s 启动子正向 agactggcgaaccagttcatacaga(SEQ ID NO 5)gcaatggaatccgaggaggt (SEQ ID NO 6) nos 终止子正向 tgaatcctgttgccggtctt (SEQ ID NO 7)反向 aaatgtataattgcgggactctaatc (SEQ ID NO 8) FMV 35s 启动子正向 cagcattccagattgggttca(SEQ ID NO 9)反向 cttttggctaatggtttggagac (SEQ ID NO: 10) Bar正向 tgcaccatcgtcaaccactaca (SEQ ID NO :11)反向 ctgccagaaacccacgtcat (SEQ ID NO 12) Bt正向 aacctgtgggagaatccttgc (SEQ ID NO :13)反向 cttgccatccgctgtttaca (SEQ ID NO :14) Cptl正向 ctaaatcaatacctcctcaatgcca(SEQ ID NO :15)反向 cttactcatcatcttcatccctgga (SEQ ID NO :16) RchlO正向 cagcacaacccaaagccata (SEQ ID NO 17)gcgaagcccgagtaggagct(SEQ ID NO 18) Xa21正向 cagcacaacccaaagccatat (SEQ ID NO :19)gcgaagcccgagtaggagc (SEQ ID NO 20) Irpgagaagaccgactgctacacct (SEQ ID NO 21)gcagagaacaacaggacgaaga(SEQ ID NO :22) osvte正向 cagtggctcctgctatcctttaca(SEQ ID NO :23)caaagcagcaccaccaactatg (SEQ ID NO :24)。
3.如权利要求1或所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含连接酶检测基因芯片系统，所述系统包含连接酶反应体系；基因芯片，所述芯片上连接了 Zip探针序列；鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述 Zip探针序列互补的序列；通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述鉴别探针包含如SEQID NO :25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO 37-48所示的探针序列。
5.一种用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包含以下两组探针1)鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；和2)通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述鉴别探针包含如SEQID NO :25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO :37-48所示的探针序列。
7.—种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)提取所述食品的DNA；b)用第一引物组对所述提取的DNA进行PCR扩增，所述第一引物组包含特异性扩增 CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；用第二引物组对提取的DNA进行 PCR扩增，所述第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cptl基因、RchlO基因、Xa21基因、Irp基因和osvte基因的引物对；c)检测所述PCR扩增产物，从而确定所述食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤b)中采用以下引物对对提取的 DNA进行PCR扩增CaMV 35s fn^J]^ IEt^ agactggcgaaccagttcatacaga(SEQ ID NO 5)Jxt^ gcaatggaatccgaggaggt(SEQ ID NO 6) nos 终止子正向 tgaatcctgttgccggtctt (SEQ ID NO :7)Jxt^ aaatgtataattgcgggactctaatc(SEQ ID NO :8) FMV 35s 启动子正向 cagcattccagattgggttca(SEQ ID NO :9)反向 cttttggctaatggtttggagac (SEQ ID NO :10) Bar!￡( tgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO :11)反向 ctgccagaaacccacgtcat (SEQ ID NO 12) Bt JEt^ aacctgtgggagaatccttgc(SEQ ID NO :13)反向 cttgccatccgctgtttaca (SEQ ID NO :14) Cptl 正向 ctaaatcaatacctcctcaatgcca (SEQ ID NO :15) 反向 cttactcatcatcttcatccctgga (SEQ ID NO :16) RchlO 正向 cagcacaacccaaagccata (SEQ ID NO :17) Jxt^ gcgaagcccgagtaggagct(SEQ ID NO :18) Xa21 正向 cagcacaacccaaagccatat (SEQ ID NO :19)Jxt^ gcgaagcccgagtaggagc(SEQ ID NO :20) Lrp !￡( gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO :21) Jxt^ gcagagaacaacaggacgaaga(SEQ ID NO :22) Osvte 正向 cagtggctcctgctatcctttaca(SEQ ID NO :23) Jxt^ caaagcagcaccaccaactatg(SEQ ID NO :24)
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)中，采用连接酶检测基因芯片系统检测所述PCR扩增产物，所述系统包含连接酶反应体系；基因芯片，所述芯片上连接了 Zip探针序列；鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述 Zip探针序列互补的序列；通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。
10. 一种检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该方法包括以下步骤a)提供核酸混合物；b)在核酸混合物中加入通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应； 其中，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在芯片上的Zip探针序列互补的序列；所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记；c)使步骤b)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，检测杂交结果，从而确定核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。
全文摘要
本发明提供了检测食品中转基因成分的方法及其试剂盒。本发明的试剂盒所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对。本发明还提供了用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒和方法。本发明的方法和试剂盒能高效、快速、灵敏、特异性地检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。
文档编号C12Q1/68GK102453749SQ20101050989
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者乐颖影, 刘晓蕾, 秦胜营 申请人:上海交通大学, 中国科学院上海生命科学研究院