专利名称：一种适用于核盘菌菌株抗药性检测试剂盒及检测核盘菌菌株抗药性的方法
技术领域：
本发明属于植物病原真菌抗药性快速检测技术领域，具体涉及一种植物病原真菌核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌株抗药性快速、简单实用的检测技术，适用于核盘菌对大田常用杀菌剂的快速抗性检测及分析。
背景技术：
核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum (Lib.) de Bary]在全世界广泛分布，可以侵染65科540多种植物，包括油菜、大豆、向日葵等主要的油料作物和莴苣、大白菜、芹菜、胡萝卜等重要的蔬菜作物，引起植物菌核病(Boland and Hall, 1994 ；Bolton et al. ,2006) 油菜菌核病是我国油菜生产中的首要病害，在长江流域广大油菜种植区尤其严重。一般年份油菜菌核病发病率为10% 30%，严重时发病率达到80%，造成油菜产量减少10% 70%，含油量降低 5%，给广大农民造成高达数亿元的经济损失。由于迄今为止没有发现对其具有明显抗病性的种质资源，没有抗病品种可以利用，目前仍多采用化学农药进行菌核病的控制。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治，如多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌灵等，作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用， 解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，获得较为理想的效果。多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂主要作用于病原菌的微管蛋白，通过与构成纺锤蛋白的亚单位(微管蛋白)结合，破坏纺锤丝的功能，使细胞分裂不能正常进行(潘以楼等，1998 ；李红霞等，2002)，由于其对病原菌的毒理机制单一，活性较高，因此病原菌很容易对该类药剂产生抗药性。我国从上世纪九十年代初开始对江苏省大部分地区油菜核盘菌对多菌灵的抗药性进行了监测，并于1996 年在江苏丘陵地区镇江农科所油菜试验田中，检测到世界上首例菌核病病菌对多菌灵的田间抗药性菌株。目前，在江苏、浙江、湖北、安徽、四川、陕西、黑龙江等省部分地区的油菜菌核病对多菌灵的抗药性监测表明，油菜菌核病对多菌灵的抗药性菌株已经产生，其中以江苏省的病菌抗性频率最高。石志琦和史建荣(2000)发现1997年江苏省通州地区某些田块的菌株抗药性比例达100%。由于多菌灵抗药性的出现，二甲酰亚胺类杀菌剂如菌核净作为多菌灵的替代药剂被用来进行油菜菌核病的防治。但抗药性问题也已经开始出现，灰霉菌(Botrytis spp.) 群体内已经检测到抗菌核净的菌株出现(Pommer et al.，1982)，2006和2007年在江苏省也检测到了抗菌核净的核盘菌菌株(马慧霞等，2008)。检测核盘菌群体内抗药性菌株出现的频率不仅是延缓抗药性生理小种的发展，防止抗药性病害流行危害最有效的措施，也将为合理选用农药控制菌核病、为农业的安全生产提供保证。目前，常用的抗药性检测方法包括两种，即以菌丝生长抑制为基础的传统的菌落直径法和基于基因突变的PCR技术。传统的菌落直径法需要将田间采集的病原菌进行无菌分离，获得纯培养，然后在添加一系列浓度的农药的培养基上进行培养，检测农药对菌丝生长的效应，根据EC5tl(抑制中浓度)或(最低抑制浓度MIC)鉴别抗药性，鉴别浓度采用Yarden的标准，即以5. Omg/L作为区分多菌灵敏感菌株和抗性菌株的标准(潘以楼等， 1996 ；杨敬辉，2004)。β -微管蛋白基因编码第198或200位氨基酸的密码子发生点突变是田间大多数病原真菌对多菌灵产生抗药性的主要原因。根据突变碱基设计特异引物，以核盘菌的基因组DNA为模板，可以通过PCR技术对对核盘菌菌株的抗药性进行定性检测(李红霞等，2002 ；周明国等，2004)，在此基础上设计的高通量实时定量PCR技术均可以快速、 准确检测，省时高效(周明国等，2008)。对菌核净的抗性检测主要也是基于MIC值法，鉴别剂量采用Giulia的标准，即以5. Omg/L为鉴别剂量。显然传统的菌丝对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作，因此难以早期发现抗药性菌株的存在，菌株在含高浓度药剂的培养基上生长与否的判断易受研究者的主观影响；基于PCR技术尤其是高通量实时定量PCR技术的检测方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员技术要求较高，难于在地市县等农业部门推广。因此研究、开发操作简便、结果明了、便于推广应用的、灵敏快速的核盘菌抗药性检测技术对保障我国油菜产业的健康、稳定发展具有重要的意义。
发明内容
传统的菌丝对药剂的敏感性测定方法耗时，工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作，因此难以早期发现抗药性菌株的存在，并且在判断菌株生长与否时易受研究者的主观影响；基于PCR技术尤其是高通量实时定量PCR技术的检测方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员技术要求较高，难于在基层农业部门大力推广。本发明的第一个目的在于克服现有技术检测周期长、工作量大、对结果的判断受主观影响大及PCR技术对仪器和人员技术要求高的缺陷，提供一种基于微生物学的方便、 灵敏、结果判断直观的核盘菌菌株抗药性检测方法，可以保证基层技术员在简单无菌操作条件下，4天内获得客观、可靠的检测结果。本发明的第二个目的是研制与上述目的配套使用的专用试剂盒，使地市县等基层农业部门的技术人员实时掌握本地、当年核盘菌菌株的抗(耐)药性情况，为油菜菌核病的化学防治提供正确的指导。实现本发明的技术方案包括下列步骤一株核盘菌菌株抗药性检测试剂盒，其由下列培养基构成1)PDA/溴酚蓝基本培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g和少量蒸馏水煮制15min左右，过滤弃去马铃薯残渣，收集滤液，补充蒸馏水定容至1000ml，定容后按 0. lg/1000ml培养基的比例添加溴酚蓝，充分溶解后，于121°C高压灭菌20min，于4°C下保存，备用；2)抗药性筛选培养基1 以PDA/溴酚蓝基本培养基为基本培养基，附加多菌灵 5mg/L，于4°C下保存备用；3)抗药性筛选培养基2 以PDA/溴酚蓝基本培养基为基本培养基，附加菌核净 5mg/L，于4°C下保存备用；4)在无菌条件下，上述三种培养基凝固前添加500mg/L的头孢曲松钠，将其分别分装于内径为22mm，外径为25mm，高为96mm塑料螺旋管中，于4°C下保存；
上述培养基中的多菌灵购自Sigma公司。用0. lmol/L Tris-HCl溶液充分溶解， 配制浓度为10000mg/L的母液，过滤除菌(滤膜孔径22um)。菌核净购自浙江省温州农药厂。用甲醇充分溶解，配制成浓度为1000mg/L的母液，过滤除菌(滤膜孔径22um)。头孢曲松钠购自海联邦制药股份有限公司。3.核盘菌菌核的制备在湖北省武汉市洪山区狮子山地区华中农业大学教学试验农场的甘蓝型油菜田间发病的茎秆上采集的核盘菌菌核(采集该菌核是本领域的常用方法，任何地区的核盘菌菌核都可以作为本发明实施例的试验材料)，晾干后，以手术刀片徒手切片，切片厚度0. 5mm,每菌核至少切6片。4.核盘菌抗药性检测采用火焰灭过菌的刀片，将上述步骤2中管装的三种培养基削成厚度为2mm的培养基圆片，置无菌培养皿中。将菌核切片在70%浓度的乙醇溶液中表面消毒2min后，于无菌水清洗一次，再用无菌水清洗一次，然后移至制备好的抗药性筛选培养基1或抗药性筛选培养基2片上，每培养基片放置1片。培养皿置室温(20-25°C ) 下培养。5.结果记录培养4天，观察、记录核盘菌菌核在各培养基片上的萌发情况和菌丝块的颜色PDA/溴酚蓝基本培养基片上菌核萌发，抗药性筛选培养基片上菌核不萌发者为敏感菌株(见图3) ；PDA/溴酚蓝生长培养基片上菌核萌发，抗药性筛选培养基片上菌核也萌发且菌落黄色者为抗药性菌株(图4) ；PDA/溴酚蓝生长培养基片上菌核不萌发，抗药性筛选培养基片上菌核也不萌发者表明菌核已失活，失去萌发能力，为无效样本(图5)。本发明试剂盒的检测原理核盘菌菌核萌发及菌丝延伸过程中产生一定量的草酸等酸性毒素，该酸性物质可以降低PDA培养基片的pH值，而含有溴酚蓝的PDA琼脂片在pH 值为3-4时显示黄色。当将各个核盘菌菌株的菌核片分别接种于含有多菌灵或菌核净药剂的PDA/溴酚蓝培养基片上时，如果培养基片显示黄色，则表明该菌株是抗药性菌株，否则为敏感菌株。本发明的优点及效果本发明以田间采集的核盘菌菌核为材料，以药剂对菌核萌发的抑制作用为指标，以培养基颜色变化为依据的检测方法，能在前季油菜收获后及时检测核盘菌的抗药性，在4天内进行大量、简便的检测。根据颜色变化辨别抗药性菌株，排除了判断实验结果时的主观因素，结果直观、明显；准确率高，可以达到100%，而基于PCR技术的方法的检测准确率为96% ；对实验仪器、操作人员和无菌条件的要求低，适宜于在基层农业部门推广，对采取有效措施控制来年油菜菌核病具有实用价值。此外，将该方法与基于 PCR技术的方法结合，可能获得抗药机理不同的抗药性菌株，为研究核盘菌的抗药性机理提供菌株材料(见实施例4)。与以往的检测方法相比，该方法除用来检测核盘菌对多菌灵的抗药性以外，还适宜于检测对菌核净等其他常用药剂的抗药性检测(见实施例5)。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO 1是本发明的β _微管蛋白基因的核苷酸序列。图1核盘菌菌丝块在含溴酚蓝的PDA (即PDA/溴酚蓝生长培养基)培养基上菌落颜色变化。依次为培养2天、3天、4天和11天。
图2本发明提供的核盘菌菌株抗药性检测试剂盒及应用。其中A为PDA/溴酚蓝基本培养基⑴、抗药性筛选培养基1⑵和抗药性筛选培养基2 (3) ；B为试剂盒检测结果。图3核盘菌敏感菌株在抗药性筛选培养基1和2上的培养结果。图4核盘菌多菌灵抗性菌株在抗药性筛选培养基1上的培养结果。图5核盘菌无效样本在抗药性筛选培养基1和2上的培养结果。图6核盘菌敏感菌株和抗多菌灵菌株的PCR检测。图中A 为ITS4/ITS5引物对扩增的结果；B 为S-TR/SS-1引物对扩增的结果；C 为S-TS/SS-1引物对扩增的结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但不是对本发明的限制。实施例1核盘菌抗药性监测药剂浓度的筛选为了研究适宜的抗性菌株的筛选指标，对检测的浓度进行了筛选研究。1. PDA/溴酚蓝基本培养基(制备见《发明内容》)2.多菌灵抗药性筛选培养基以PDA/溴酚蓝基本培养基为基本培养基，附加多菌灵分别为 lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L 和 10mg/L ；3.菌核净抗药性筛选培养基以PDA/溴酚蓝基本培养基为基本培养基，附加菌核净分别为 lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L 和 10mg/L。4.随机选取采集自湖南省、湖北省、安徽省、青海省和江苏省油菜发病的茎秆上的核盘菌菌核50份，晾干后，以手术刀片徒手切片，切片厚度0. 5mm，每菌核至少切6片。5.将菌核切片在70%浓度的乙醇溶液中表面消毒2min后，于无菌水清洗两次，然后移至制备好的含多菌灵或菌核净的PDA/溴酚蓝培养基上。培养皿置室温(20-25°C )下培养。培养4天，观察、记录核盘菌菌核在各培养基片上的萌发情况和菌丝块的颜色。6.结果见表1，结合实验结果和文献报道(潘以楼等，1996;杨敬辉，2004)和国际通用的鉴别剂量标准，将多菌灵和菌核净的检测浓度设定为5mg/L。表1核盘菌菌株对多菌灵和菌核净敏感性
------1-
^r_多菌灵mg/L_菌核净mg/L
药剂 ---
_123456 10 123456 10
菌核萌发率
、222000 O 2 0 0 0 0 0 O
(%)_
--1~实施例2试剂盒培养基的制备1.PDA/溴酚蓝生长培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g和少量蒸馏水煮制15min左右，过滤弃去马铃薯残渣，收集滤液，补充蒸馏水定容至1000ml，定容后按 0. lg/1000ml培养基的比例添加溴酚蓝，充分溶解后，于121°C高压灭菌20min，备用；2.抗药性筛选培养基1 以PDA/溴酚蓝培养基为基本培养基，附加多菌灵5mg/L ；3.抗药性筛选培养基2 以PDA/溴酚蓝培养基为基本培养基，附加菌核净5mg/L ；4.在无菌条件下，上述三种培养基凝固前添加500mg/L的头孢曲松钠，将其分别分装于内径为22mm，外径为25mm，高为96mm塑料螺旋管中，于4°C下保存；多菌灵购自Sigma公司，用0. lmol/L Tris-HCl溶液充分溶解，配制浓度为 10000mg/L的母液，过滤除菌(滤膜孔径22um)；菌核净购自浙江省温州农药厂，用甲醇充分溶解，配制成浓度为1000mg/L的母液，过滤除菌(滤膜孔径22um)；头孢曲松钠购自海联邦制药股份有限公司。实施例3核盘菌在PDA/溴酚蓝生长培养基上的培养特性试验将核盘菌菌株Ep-1PNA367(Huiquan Liu et al.，2009)于PDA 培养基于 20°C下连续活化2-3次；取活化的核盘菌的菌丝块接种于PDA/溴酚蓝培养基(制备见《发明内容》) 上，于20°C下培养15天，逐天记录菌落形态和颜色。结果见图1，核盘菌菌落生长并产生草酸，将培养基的PH值降至3-4 (Marciano et al.，1983)，溴酚蓝遇酸发生颜色变化，使含有溴酚蓝的PDA培养基由蓝色变为黄色，4天后，由于草酸开始降解，培养基pH值回升，逐渐恢 M- 'iTn.^j. O实施例4核盘菌对多菌灵抗药性检测试验1. PDA/溴酚蓝生长培养基和抗药性筛选培养基1的制备见《发明内容》。2.核盘菌菌核切片的制备2008_2009年自湖北、湖南、安徽、青海和江苏省发病油菜茎杆采集核盘菌菌核，每茎杆的菌核为一份样品，共2777份(见表2)。晾干后，以手术刀片徒手切片，切片厚度0. 5mm，每菌核至少切6片。表2抗药性检测的核盘菌菌株及来源
权利要求
1.一株核盘菌菌株抗药性检测试剂盒，其特征包括下列培养基DPDA/溴酚蓝基本培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g和少量蒸馏水煮制15min左右，过滤弃去马铃薯残渣，收集滤液，补充蒸馏水定容至1000ml，定容后按0. lg/1000ml培养基的比例添加溴酚蓝，充分溶解后，于121°C高压灭菌20min，备用，在无菌条件下于培养基凝固前添加500mg/L的头孢曲松钠，将其分装于内径为22mm，外径为25mm，高为96mm塑料螺旋管中，于4°C下保存；2)抗药性筛选培养基1以PDA/溴酚蓝基本培养基为基本培养基，附加多菌灵5mg/L， 过滤除菌，滤膜孔径22um，于4°C下保存；3)抗药性筛选培养基2以PDA/溴酚蓝基本培养基为基本培养基，附加菌核净5mg/L， 过滤除菌；滤膜孔径22um，于4°C下保存。
2.权利要求1所述的试剂盒在核盘菌菌株抗多菌灵检测中的应用。
3.权利要求1所述的试剂盒在核盘菌菌株抗菌核净检测中的应用。
全文摘要
本发明属于植物病原真菌抗药性快速检测技术领域，具体涉及一种植物病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌株抗药性快速、简单实用的检测试剂盒，适用于核盘菌对大田常用杀菌剂多菌灵或菌核净的快速抗性检测及分析。本发明以田间采集的核盘菌菌核为材料，以药剂对菌核萌发的抑制作用为指标，以培养基颜色变化为依据的检测方法，能在前季油菜收获后及时检测核盘菌的抗药性，在4天内进行大量、简便的检测，根据颜色变化辨别抗药性菌株，结果直观、明显，准确率可以达到100％，对采取有效措施控制来年油菜菌核病具有实用价值。此外，将该方法与基于PCR技术的方法结合，可能获得抗药机理不同的抗药性菌株，为研究核盘菌的抗药性机理提供菌株材料。
文档编号C12Q1/02GK102453742SQ20101051479
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者付艳苹, 姜道宏, 张霞, 程家森, 谢甲涛 申请人:华中农业大学