专利名称：一种微生物发酵制备阿卡波糖的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，设计一种微生物发酵制备阿卡波糖的方法，特别涉及 一种在阿卡波糖的发酵过程中通过补加有效霉素A提高阿卡波糖产量的方法。
背景技术：
阿卡波糖外观为白色或灰白色粉末，可溶于水，pKa值为5. 1，分子式为C25H43NO18, 分子量645. 6，化学名0-{4，6_双去氧-4[(1S，4R，5S，6S)_4，5，6-三羟甲基-2环己烯 基]-α -D-吡喃葡萄糖基} - (1 — 4) -0- α -D-吡喃葡萄糖基-(1 — 4) -D-吡喃葡萄糖。分 子结构式如下式I所示
Valienamine
I由阿卡波糖化学结构式可见，它是一种复合的假四糖，结构上包含acarviose和 麦芽糖两部分，其中acarviose由具有不饱和C7-环多醇结构的valienamine和4_氨基_4， 6-二脱氧葡萄糖通过类似于N-糖苷键的氨基桥连接而成，该acarviose结构对α _糖苷酶 的抑制效果起主要作用。德国拜耳公司于1977年从游动放线菌SE50、SE82和SE18的代谢物中获得了阿卡 波糖，阿卡波糖在游动放线菌中的生物合成过程是由Acb基因簇编码的一系列酶的催化作 用下完成的，包括氨基环醇、4-氨基_4，6-二脱氧葡萄糖的合成和随后的糖基化作用。阿卡波糖1990年首先在德国上市，1996年获得FDA批准在美国上市，用于II型糖 尿病的治疗。阿卡波糖对肠道内的蔗糖酶、麦芽糖酶、糊精酶和葡萄糖淀粉酶都具有强烈的抑 制作用，并对α-淀粉酶有微弱的抑制作用，还具有良好的药动学性质和低毒性，大量临床 研究证明阿卡波糖能降低餐后血糖水平，对糖尿病治疗疗效确切、毒副作用小，在预防糖尿 病心血管并发症等方面也具有良好的效果。由于其高效、安全，阿卡波糖已被作为糖尿病的 治疗的一线药物。阿卡波糖具有的特点(1)减轻血糖波动。血糖波动性大，可加剧氧化应激反应，严重损害大血管。阿卡波糖不仅可以通过抑制碳水化合物的吸收减缓餐后血糖高峰，而且 不引起低血糖，即所谓消峰去谷，减轻血糖波动，进一步降低患心血管疾病的危险。(2)对代 谢有额外的益处。权威研究表明阿卡波糖可中等程度降低患者体重。另外，欧洲和亚洲 进行的研究显示，阿卡波糖还能提高胰岛素敏感性，改善高血糖诱导的内皮功能紊乱，减轻 机体炎症反应等。( 可预防心血管事件的发生。研究显示，阿卡波糖显著降低任何心血管 事件的发生率达35 %，其中心肌梗死的减少最显著，其他心血管事件亦有减少的趋势。阿卡 波糖对血糖、血脂和血压的改善作用显著，能显著降低糖化血红蛋白、空腹和餐后血糖、甘 油三酯和收缩压水平。(4)具有出色的安全性。由于阿卡波糖几乎不经肠道吸收，所以鲜见 全身不良反应，仅表现为轻至中度的局部胃肠道不适。若遵循“小剂量起始、逐渐加量”的 原则，可避免大多数胃肠道反应。此外，阿卡波糖单药治疗时无低血糖风险与其他药物(如 血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂等)合用时亦无药物间相互作用，因此安全性高， 尤其适合老年患者。阿卡波糖凭其独特的作用机制、平稳的降糖疗效、出色的安全性以及显著降低心 血管事件的发生，在高血糖的防治中取得了巨大成功。目前国内外对阿卡波糖工业化发酵过程的主要通过以下两个方面的研究来提高 阿卡波糖的发酵水平(1)控制发酵液中葡萄糖和麦芽寡糖的浓度。葡萄糖和麦芽寡糖既是能源物质又 是阿卡波糖的前体物质。葡萄糖在发酵早期就被消耗尽，而麦芽寡糖在整个发酵过程中缓 慢地被利用，并在葡萄糖耗尽之后，充当能源物质。因为麦芽糖会直接掺入阿卡波糖的结 构中，所以葡萄糖在早期的消耗会导致后期麦芽糖含量的减少，进而影响了阿卡波糖的产 量。因此必须严格控制葡萄糖的水平并保持麦芽糖在发酵液中的高浓度来促进阿卡波糖的 合成。( 控制发酵液中合适的渗透压。在阿卡波糖的发酵过程中，渗透压对其产量有着 关键的作用。控制培养液的渗透压有利于促进麦芽糖向细胞内的运输，从而提高阿卡波糖 收率。
发明内容
权利要求
1.一种微生物发酵制备阿卡波糖的方法，所述的方法为将阿卡波糖产生菌CCTCC NO =M 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度 20 32°C进行发酵培养96 192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波 糖，其特征在于，发酵培养进行0 48h之间，加入如式II所示的有效霉素A的水溶液，使 每升发酵培养基中加入有效霉素A的质量为0. 04 0. 4g ；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述有效霉素A的水溶液的浓度为1 IOOg/L0
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵培养进行O 12h之间，加入如式II 所示的有效霉素A的水溶液，所述有效霉素A的水溶液的加入方式为下列之一 (1) 一次性 加入；(2)分批间歇加入；(3)流动连续加入。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中，所述的碳源为下列之一 或几种任意组合葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇；所述的氮源为 下列之一或几种任意组合肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐，肽； 所述的无机盐为下列之一或几种任意组合Na盐、K盐、Ca盐、Mg盐、Fe盐、Mn盐、Zn盐、Co 盐或Ni盐。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基还含有氨基酸类、维生素和/ 或核酸类物质。
6.如权利要求1、4或5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基初始pH值为pH6. O 8. O。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下麦芽糖80.Og/L, 葡萄糖 20. Og/L，黄豆饼粉 10. 0，g/L，玉米浆 5. Og/L, FeCl3 0. lg/L，CaCl2 2. Og/L, CaCO3 6.(^/1，溶剂为水，初始？!1 7.0。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为无菌转移低温甘油管CCTCCNO M 209022菌株于新鲜、无菌固体平板上，28°C活化2 3天，挑取菌落接种至种子培养基， 在温度28°C，通风搅拌或震荡下培养24 96小时，得到种子液；将种子液与发酵培养基以 体积比1 10%的接种量接种至发酵培养基，在温度28°C，通风搅拌或震荡下进行发酵培 养96 192小时，在培养至0 12小时期间，加入6.3 12g/L有效霉素A的水溶液，所 述的有效霉素A的水溶液的加入量是使每升发酵培养基中加入有效霉素A的量为0. 04 0. 4g ；发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)无菌转移低温甘油管CCTCCNO =M 209022菌株于新鲜、无菌固体平板上，28°C活化 2 3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度28°C，通风搅拌或震荡下培养24 96小时， 得到种子液，所述种子培养基组成如下玉米淀粉15. Og/L，黄豆饼粉40. Og/L，甘油20. Og/ L，K2HPO4 0. lg/L，CaCO3 2. Og/L，溶剂为水，初始 pH7. 0 ；(2)将种子液与发酵培养基以体积比1 10%的接种量接种至发酵培养基，在温度 28°C，通风搅拌或震荡下进行发酵培养96 192小时，在培养至0 12小时期间，一次性 加入6. 3 12g/L有效霉素A水溶液，所述的有效霉素A的水溶液的加入量是使每升发酵 培养基中加入有效霉素A的量为0. 04 0. 15g ；所述发酵培养基组成如下麦芽糖80. Og/ L,葡萄糖 20. Og/L,黄豆饼粉 10. 0，g/L，玉米浆 5. Og/L, FeCl3 0. lg/L, CaCl2 2. 0g/L, CaCO3 6. 0g/L,溶剂为水，初始pH 7. 0 ；(3)发酵结束后，得发酵液提取分离，得所述阿卡波糖。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中发酵液按如下方法分离发 酵液调节PH值至3，然后进行离心或过滤，得到澄清的阿卡波糖滤液；采用强酸型阳离子交 换树脂吸附、洗脱；收集液经脱盐、高分辨率阳离子交换树脂精制，中和，冷冻干燥，制得阿 卡波糖。
全文摘要
本发明公开了一种微生物发酵制备阿卡波糖的方法，所述的方法为将阿卡波糖产生菌CCTCC NOM 209022，接种至适用于所述菌株的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，在温度20～32℃进行发酵培养96～192小时，发酵结束后，得发酵液提取分离，得到所述阿卡波糖，其特征在于，发酵培养进行0～48h之间，加入有效霉素A的水溶液，使每升发酵培养基中加入有效霉素A的质量为0.04～0.4g。本发明通过在阿卡波糖发酵过程中补加有效霉素A，提高了阿卡波糖的发酵水平。
文档编号C12P19/00GK102140485SQ20101060582
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月25日 优先权日2010年12月25日
发明者沈寅初, 王亚军, 王远山, 薛亚平, 郑裕国 申请人:浙江工业大学