专利名称：高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株bmb181的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物应用技术领域。具体地说，本发明涉及一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)突变株的分离、黑色素鉴定及该突变株作为宿主菌的转化性能和表达性能测定及应用。本发明与微生物农药技术领域有关。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌，它的一个显著特点就是能够在芽胞期产生对昆虫具有特异毒杀作用的晶体蛋白(Insecticidal crystal Proteins, ICPs),从而有别于分泌肠毒素的腊状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。由于苏云金芽胞杆菌对目标生物具有特异、高效、对人畜无毒、不污染环境、不杀伤昆虫天敌等优点，并且 用农副产品作原料易于工业化生产，目前苏云金芽胞杆菌已经成为世界上应用最广泛、最成功的生物杀虫剂(喻子牛，孙明，陈亚华，等.苏云金芽胞杆菌生物活性蛋白基因在动、植物病虫害防治中的应用综述.农业生物技术学报，1995，3 (2) :100-110)。黑色素由各种类型的酚类或吲哚单体组成，通常包含一些蛋白质分子或者掺杂一些碳水化合物分子，在微生物、动物、原生动物以及植物中均可产生。不同生物黑色素之间单体的类型可能存在差异，一些生物物质被划分为黑色素很大程度上依赖于其物理或化学性质(Nicolaus R A, Piatelli M and Fattorusso E. Thestructure of melanins andmelanogenesis-IV. On some natural melanins. Tetrahedron, 1964, 20 :1163-1172)。黑色素具有防止蛋白质降解、光子屏蔽、化学保护等作用，特别是它对紫外线和辐射具有抵抗性。苏云金芽胞杆菌能够形成具有杀虫活性伴胞晶体，作为广泛应用的生物杀虫剂有其自身的缺陷。其一，杀虫晶体蛋白在施用时易受到阳光中紫外线的破坏，影响效果，黑色素成为解决晶体蛋白阳光损害这一问题的有效办法；其二，B. thuringiensis可以形成多种晶体蛋白，但每一种都有其自身特定杀虫范围，人们期待按照需要构建具有特定杀虫活性的重组菌。因此，获得既产黑色素又可按照需要表达各种晶体蛋白的菌株成为解决这一问题的可行办法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，分离筛选高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株，并将该突变株作为宿主菌的转化性能和表达性能进行测定和应用。本发明的技术方案如下申请人:按照高温诱导产黑色素突变株操作流程，以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为出发菌株，获得一株在28°C条件下高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株，申请人将该菌株命名苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)BMB181 (为了方便叙述，在本说明书中将该菌株简称为苏云金芽胞杆菌BMB181)，苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种 BMB181 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki BMB181)于 2011年I月11日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为 CCTCC NO M2011016o本发明的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181具有下列明显特征(I)本发明的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181能够大量生产黑色素，该突变株最高产黑色素量比已经报道的苏云金芽胞杆菌产黑色素量均高，而且在没有额外添加底物酪氨酸的情况下仍然产生大量黑色素，并且这种性状可稳定遗传。(2)本发明的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181能够作为宿主菌，具有良好的转化性能和表达性能。(3)本发明的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181所产黑色素具有保护晶体蛋白免受紫外线破坏作用。
本发明的苏云金芽胞杆菌BMB181的菌学特征如下营养细胞粗短杆状，两端钝圆，周生鞭毛，能运动，通常2 4个连在一起，大多数为两连。个体大小为I. OX (2. 4 4. 4) u m，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近似椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在LB固体培养基上菌落边缘不整齐，成粗布状向外展开，略呈放射状；菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10_45°C，最适生长温度26-32°C，适宜pH6. 8-7. 4，兼性嫌气，无伴胞晶体生成，产生可溶性黑色素。该菌株按照常规甘油管保藏方法(王婭等，几种简易的菌种保存方法.青岛医药卫生，2009，41 (6) =451-452)保藏。更详细的技术方案参见实施例部分的描述。
序列表SEQ ID NO :1是本发明筛选的高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株BMB181的csab基因(编码多糖丙酮酸转移酶)的部分序列。图I :本发明的技术流程图。图2 :不同培养基上本发明的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181与出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171产黑色素情况比较。图中A :ICPM培养基，上部为出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171，下部为本发明分离的苏云金芽胞杆菌BMB181 ；B :LB培养基，上部为苏云金芽胞杆菌BMB171，下部为本发明分离的苏云金芽胞杆菌BMB181 ；C :LB+tyr0Sine培养基，上部为苏云金芽胞杆菌BMB171，下部本发明分离的苏云金芽胞杆菌BMB181 ；D :发酵培养基，左图为苏云金芽胞杆菌BMB171，右图为本发明分离的苏云金芽胞杆菌BMB181。图3 :苏云金芽胞杆菌BMB181黑色素红外谱图。图4:黑色素标准曲线图。图5 LB中苏云金芽胞杆菌BMB171与BMB181生长及产黑色素曲线图；图中生长曲线BMB171 ，BMB181 □;产黑曲线BMB171 ▲, BMB181X。图6 :质粒pHT304(6. 7kb)物理图谱，该质粒带有红霉素和氨苄青霉素抗性基因。图7 :质粒pBMB1251 (IOkb)物理图谱，该质粒带有红霉素、卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因，具有温度敏感性复制起点。图8 :质粒pBMB625(17kb)物理图谱，该质粒带有红霉素抗性基因，具有ori60复制起点。图9 :质粒pBMB292 (38kb)物理图谱，该质粒带有红霉素抗性基因，具有ori60复制起点。图10 BMB32晶体光学显微镜图。图 11 BMB32 杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 图。图中M，protein marker ; 1-3，小牛血清白蛋白;4-6，BMB32。图12 :小牛血清白蛋白标准曲线。
具体实施方案以下叙述是根据本发明实施方案的实施例，详细技术流程参照图I。应当说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品或试剂均参考J.萨姆布鲁克等著的《分子克隆实验指南》所描述的内容 (参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等等加以实施。实施例I I、苏云金芽胞杆菌高产黑色素突变菌株的分离筛选本发明以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)无晶体突变株BMB171 (李林等，苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171的转化和表达性能.应用与环境生物学报，1999,5(4) =395-399)为出发菌株，通过高温诱导，获得一株在28°C条件下高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株BMB181。具体方法以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为出发菌株接种LB液体培养基中(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 1(^，补充蒸馏水至10001^，调培养基的？11至7.0-7.2，在121°C下灭菌30min)，28°C培养转接一次，至对数期0D_为I左右，按1% (v/v)转接，42°C培养，培养至对数期(0D_为I左右转接，转接多次。取一定量菌液用无菌水按10倍系列梯度稀释，涂布于添加I % (w/v)的酪氨酸的LB平板，在28°C和42°C下分别筛选黑色素表型差异菌株。通过上述方法筛选得到的苏云金芽胞杆菌突变株的候选株，在28°C培养能够在多种培养基上产生黑色素，其结果见附图2。经实验测定，本发明突变菌株的候选株在LB液体培养基中黑色素产量可达4. 81mg/mL。在ICPM培养基(ICPM培养基配方蛋白胨6g，葡萄糖 5g，CaCO3Ig, MgSO4 7H20 0. 5_lg，KH2PO4O. 5_lg，补充蒸馏水至 lOOOmL，调 pH 至 7. 0，在115°C下高压蒸汽下灭菌20min)上产量达到3. 91mg/mL ;在发酵培养基(黄豆饼粉22. 5g，玉米浆20g，淀粉15g，CaCO3L 5g ;加蒸馏水至IOOOmL,调培养基的pH至7. 0，在121°C下灭菌30min)中黑色素产量达到4.66mg/mL。在加入1% (w/v)酪氨酸LB培养基上产量高达8. 55mg/mL,比已经报道的苏云金芽胞杆菌黑色素产量均高，而且在没有添加酪氨酸的情况下仍然产生大量黑色素，并且这种性状可稳定遗传。2、苏云金芽胞杆菌高产黑色素突变菌株的分子生物学方法鉴定为了验证BMB181为BMB171突变株，抽提这两株菌(BMB181和BMB171的总DNA，利用PCR方法扩增两株菌的csab基因，其中BMB171的csab基因可通过登录网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/296321890 report = gbwithparts&from =887269&to = 888357&RID = SYAff6H8T011获得。csab基因编码多糖丙酮酸转移酶，可以用来作为蜡状芽胞杆菌群中菌种分类。本发明的苏云金芽胞杆菌BMB171和BMB181菌株验证所用引物序列如表I所示。表I本发明分离的BMB181菌株验证引物
引物编号引物序列.
P2-15 ’-TTGGAGGAGATTTAGGGTGC-3 ’ P2-35 ’ -ATC AAATGGC AC ATGC ATTGGA-3，苏云金芽胞杆菌BMB171和BMB181总DNA的抽提方法分别挑取BMB171和BMB181的单菌落，分别接种于5mL的LB液体培养基中置于28°C、200rpm的摇床中培养过夜；然后将50ii L的培养物转移至5mL的LB液体培养基中，同样条件培养3_4小时；然后以12000rpm, 0. 5min 离心收集菌体，用 ImLSTE (0. lmol/L NaCl, 10mmol /T, Tris-HCl (pH 8. 0),lmmol/L EDTA (pH8. 0))洗涤一次，加 100 U L 溶液 I (lmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 0. 5mol/LEDTA (pH8)，50mmol/L葡萄糖)和IOy L溶菌酶(浓度50mg/mL)，在冰上静置2_3小时或过夜；加入200 u L2%的十二烷基磺酸钠(SDS)于55°C水浴30min ;加入100 u L5mol/L NaCl混匀，室温或者冰上静置5-10min，12000rpm离心5min取上清；再加入500 u L苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比25 24 I),离心12000rpm，5min,吸取上清液，重复抽提1-2次；将上层DNA溶液转移至I. 5ml离心管，加两倍体积无水乙醇于_20°C静置15min-2hrs后以12000rpm离心5min,沉淀用200 ii L70*% (v/v)乙醇洗漆一次后冷冻抽干,用20 y L RNase液中(20 u g/ml)溶解沉淀，该沉淀即为苏云金芽胞杆菌BMB171和BMB181菌株的DNA。PCR 反应体系为10Xbuffer 2iil，2mmol/L dNTP 0. 5 y 1，10 y mol/L 引物各
0.3 u I, pfu酶0. 2 u I,总DNA 0. 2ul,补加灭菌去离子水至20 y I。PCR扩增反应程序为第I步94°C预变性5min ;第2步94°C变性0. 5min，第3步52°C复性0. 5min，第4步72°C延伸0. 5min ;第5步转到第2步继续运行30个重复；第6步72°C 延伸 5min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下需要的DNA片段所在的琼脂糖块，使用OMEGA公司DNA片段回收试剂盒回收DNA片段。将回收的PCR产物送至北京奥科生物技术有限责任公司测序。通过测序获得全长664bp的序列，测序结果输入NCBI，用Blastn程序交送GenBank数据库进行比较分析。结果显示上述苏云金芽胞杆菌BMB171和BMB181两株菌csab基因同源性为100% (与登录号CP001903报道的序列相比)，因此确定本发明制备的苏云金芽胞杆菌BMB181为苏云金芽胞杆菌BMB171的突变株。3、苏云金芽胞杆菌高产黑色素突变菌株BMB181黑色素红外鉴定
挑取本发明实施例的BMB181单菌落，接种于5mL的LB液体培养基中，置于28°C、200rpm的摇床中培养过夜。然后将500 u L的培养物转移至50mL的LB液体培养基中，同样条件培养36小时，12000rpm离心收集上清。上清液用滤纸过滤后，滤液用5mol/L HCI调培养基的pH至3. 0，3000rpm离心10分钟收集沉淀黑色素，将沉淀重新溶入pH8. 0的蒸馏水中，重复此步骤3次。最后所得的沉淀于80°C干燥后研成粉末。将提纯的黑色素粉末与溴化钾在餅钵中充分混匀，然后取一部分混匀后的粉末用压片机压成薄片，进行红外光谱扫描。红外光谱扫描是利用物质分子对红外光的吸收特征进行分析鉴定的一种方法。黑色素是一个无定形物质，基本结构单元是由共价相连的吲哚表示。红外光谱扫描在一定程度上可作为黑色素定性的一个指标(Hoti S L, Balaraman K. Formation of melaninpigment by a mutant of Bacillus thuringiensis H-14. J GenMicrobiol. 1993,139 2365-9)，图3是本发明制备的高产黑色素突变菌株BMB181所产色素红外光谱扫描图。从图中可以看出，该色素在波数约340001^1处和165501^1都有吸收峰,这与Saxena等(SaxenaD 等，AUV tolerant mutant of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ProducingMelanin. Curr Microbiol, 2002,44 :25-3)报道的苏云金芽胞杆菌中的黑色素的吸收峰一致，所以把本实施例产生的色素鉴定为黑色素。4、苏云金芽胞杆菌BMB181产黑色素的曲线将出发菌株BMB171和本发明筛选的BMB181菌株同时接种在LB培养基上，于28 °C 培养测定产黑色素曲线。具体方法是分别挑取BMB171和BMB181的单菌落，接种于5mL的LB液体培养基中，置于28°C、200rpm的摇床中培养过夜。然后按1% (v/v)接种量转接至50mL的LB液体培养基中，同样条件培养。利用721型紫外分光光度计测定培养物600nm吸光值，绘制生长曲线。培养物离心后测定上清中黑色素OD4tltl的吸光值，根据黑色素标准曲线计算黑色素的浓度，绘制黑色素产生曲线。黑色素标准曲线的制定分别取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg黑色素加去离子水定容至lmL，利用紫外分光光度计测定其在400nm光波下吸光值，将黑色素浓度与OD■制作黑色素标准曲线。该曲线中溶液的OD■值与黑色素的浓度呈线性关系，算出其斜率如图4。通过测定生长曲线和产黑曲线见图5，可以得到苏云金芽胞杆菌BMB181同BMB171生长情况一致，说明产黑色素性状对其生长没有影响。从产黑色素趋曲线看出，在LB培养基上BMB181菌株黑色素的产生是从对数后期(0D_约为4.0)开始的，进入稳定期后同出发菌株BMB171菌株产黑色素差距非常明显，而BMB171中则检测不到黑色素的产生。5、BMB181转化效率的测定苏云金芽胞杆菌的转化一般采用电转化方法。其具体实施方法如下所述。苏云金芽胞杆菌感受态制备挑取芽胞杆菌BMB181单菌落接种LB培养基过夜活化，按1% (v/v)的接种量转接至IOOmL新鲜的含2% (w/v)甘氨酸的LB培养液(28°C,220r/min)培养至OD6tltl为0. 4，将培养液冰浴30min后，4°C离心(4000r/min, 5min)收集菌体，并用预冷的EP buffer (每500ml EP buffer中包含SG缓冲液500ml, 0. 1M/L憐酸钾缓冲液 2. 5ml, 1M/L MgCl2250ul ;其中 0. 1M/L 磷酸钾缓冲液配方(IOOmL) :1. 4gKH2P04，
0.52gK2HP04，121°C高压蒸汽灭菌 30 分钟；lM/LMgCl2 (100ml) :20. 33gMgCl2，121°C高压蒸汽灭菌30分钟；SG缓冲液配方272mM/L蔗糖，15%甘油，115°C高压蒸汽灭菌20分钟)洗涤菌体3-4次，最后I次重悬于适量预冷的SG缓冲液中，并以每管100 u L分装至I. 5mL离心管。质粒DNA的纯化首先将等体积的5M/L LiCl溶液加入质粒DNA，冰上放置10-20min,冷冻离心(12000r/min, 5min),弃沉淀吸取上清液加入2-2. 5倍体积的无水乙醇沉淀质粒，放置25min后冷冻离心,所得沉淀即为纯化后的质粒DNA。质粒DNA的脱盐质粒DNA纯化后用1.0% (w/v)琼脂糖/0. IM葡萄糖进行脱盐。具体操作步骤是0. IM葡萄糖/I. 0%琼脂糖加热溶解之后取出0. 75mL加入I. 5mL离心管中，然后在上面放置一个装满水的0. 5mL离心管,凝固之后将0. 5mL离心管取出，风干几分钟后，将质粒溶液加入孔中，在冰上静置l_2h，然后将DNA溶液取出于_20°C保存备用。转化时,在预冷的转化杯(2mm, Bio-Rad产品)中,加入上述苏云金芽胞杆菌感受态细胞100 u L，再加入I y g按上述方法纯化的质粒DNA，混匀后在冰上放置30min，用电脉冲仪进行电脉冲。电击条件为2. Okv/cm，电击I次。电脉冲完毕后，加入预热的0. 8mL LB培养液于电转化杯中，转移至PA瓶恢复培养2h后，涂布LB抗性平板(因转化质粒的不同而涂布于不同抗生素抗性平板，具体方案见下文)皿涂100-200ii L，培养12h-16h，以挑取相应抗性菌落(Peng D,rt al. Elaboratio of an electroporation protocolfor largerplasmids and wild-typ strains in Bacillus thuringiensis. J Appl Microbiol，2009，106(6) :1849-58)。 根据电转化步骤,利用微量核酸蛋白测定仪(GeneQuuantlOO)测定质粒的浓度后，取I U g不同大小的质粒分别转化苏云金芽胞杆菌BMB181，LB液体培养基中恢复培养2h后，将恢复培养产物用无菌水10倍梯度稀释，涂布相应抗性平板，统计每个平板生长的菌落数，计算BMB181菌株的转化率。本发明采用不同大小的质粒分别转化杆菌BMB181来验证苏云金芽胞验证苏云金芽胞杆菌BMB181的转化效率。具体实施步骤如上文所述。转化pHT304(6. 7kb)至苏云金芽胞杆菌BMB181中时，选用含有红霉素抗生素的LB平板筛选转化子(红霉素浓度25ii g/mL)。转化pBMB1251 (IOkb)至苏云金芽胞杆菌BMB181中时，选用含有红霉素和卡那霉素抗生素的LB平板筛选转化子(红霉素浓度25 ii g/mL,卡那霉素浓度50 ii g/mL)。转化pBMB292(17kb)至苏云金芽胞杆菌BMB181中时，选用含有红霉素抗生素的LB平板筛选转化子(红霉素浓度25ii g/mL)。转化pBMB625 (38kb)至苏云金芽胞杆菌BMB181中时，选用含有红霉素抗生素的LB平板筛选转化子(红霉素浓度25 u g/mL)。结果如表I所示。数据统计分析均采用Excel 2003 For Windows软件进行方差分析，结果以平均值土标准差(x+s)的形式显示。表2本发明分离的BMB181菌株的转化效率测定
权利要求
1.一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis),其特征在于该菌株是苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种BMB181，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为 CCTCCNO M2011016o
2.权利要求I所述菌株在制备杀虫微生物中的应用。
3.权利要求2的应用，其特征在于包含制备苏云金芽胞杆菌菌剂的应用。
4.权利要求I所述菌株作为宿主菌的应用。
全文摘要
本发明属于农业微生物学技术领域。公开了一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)突变株BMB181。本发明以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为出发菌进行高温诱导，获得一株在28℃条件下高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株BMB181(保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM2011016)，该菌能够作为宿主菌，具有良好的转化性能和表达性能，对紫外具有明显抗性作用。
文档编号C12N1/21GK102732438SQ20111008319
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者刘风侠, 孙明, 彭东海, 杨文君, 阮丽芳 申请人:华中农业大学