专利名称：马流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及马流感病毒NP单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及该马流感病毒NP单克隆抗体在制备检测或诊断马流感病毒的试剂中的应用，属于马流感病毒的检测领域。
背景技术：
马、流感(Equine influenza, ΕΙ)是由马、流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起马属动物的急性呼吸性疾病，由于其恢复期长、治疗费用昂贵，给养马业带来了极大的经济损失(REEVE-JOHNSON L. Equine influenza in Australia [J]. Vet Rec，2007， 161:635.)。因此，建立一种快速、有效的检测EI的方法对其早期预防和控制极为重要。马流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)具有种群和型特异性，是保守的结构蛋白，在病毒进化中变异率极低，对于易发生变异的流感病毒的诊断具有重要的应用价值。单克隆抗体在检测中以其高特异性、准确性和有效性备受人们青睐。故利用针对NP的单克隆抗体建立起来的检测技术广泛应用于流感病毒的诊断，尤其是多亚型和高突变的禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)。deBore等仅利用一株抗NP单抗建立的双抗体夹心ELISA方法和双抗体夹心阻断ELISA可以分别从病原水平和血清水平检测人、禽和马等不同动物来源的各亚型流感病毒(SIEBINGA J T and BOER GFD. Influenza A viral nucleoprotein detection in isolates from human and various animal species[J]. Arch Virol, 1988,100 :75-87 ；deBOER G F,BACK W and 0STERHAUS A D M E. An ELISA for detection of antibodies against influenza A nucleoprotein in humans and various animal species [J], Arch Virol，1990，115 :47-61.)。2008 年 Yang M 等运用流感病毒的 NP 单抗发明了一种快速检测针对AIV的探针，此单抗与NP结合后能被免疫荧光法、免疫组化法和免疫噬菌斑法展现出来(YANG Μ, BERHANE Y, SALO Τ, et al. Development and application of monoclonal antibodies against avian influenza virus nucleoprotein[J]. J Virol Methods, 2008，147 :265-274.)。而EI方面，尤其是中国国内，基于EIV抗NP单抗建立起的检测方法鲜有报道。与其它A型流感病毒一样，EIV极易变异，但是NP作为其重要的结构蛋白，却相当保守。应用单抗研究发现，所有不同动物来源的病毒株都有一个共同的抗原表位，针对此表位的单抗具有型特异性，利用该表位的单抗可检测不同动物来源的流感病毒，正如deBore等建立的双抗体夹心ELISA和双抗体夹心竞争ELISA。同时世界动物卫生组织(OIE)指出，在无分离病毒的实验室条件时，可采用EIV NP单抗进行抗原捕捉ELISA 直接检测鼻腔分泌物中的 EIV(COOK R F, SINCLAIR R and MUMF0RD J A. Detection of influenza nucleoprotein antigen in nasal secretions from horses infected with A/equine influenza(H3N8)viruses[J]. J Virol Methods,1988, 20 1-12. LIVESAY G J, 0' NEILL Τ,HANNANT D，et al. The outbreak of equine influenza(H3N8)in the United Kingdom in 1989 !diagnostic use of an antigen capture ELISA[J]. Vet Rec,1993,133 :515-519.)。因此，一种快速有效的诊断技术对于EIV的预防控制和流行病学研究极为重要。目前国内常用的检测EI的方法有病毒的分离、血凝血凝抑制试验、RT-PCR等，但进行大规模检测比较困难，应用也局限于专业实验室，很难在基层推广使用。
发明内容
本发明目的之一是提供一种抗马流感病毒NP单克隆抗体；本发明目的之二是提供分泌该抗马流感病毒NP单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本发明目的之三是将上述抗的抗马流感病毒NP单克隆抗体应用于制备成检测马流感病毒抗原或抗体的有关试剂。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原，经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经4次有限稀释法克隆和间接 ELISA法筛选，获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11和3E10。其中，杂交瘤细胞株2G11的微生物保藏号是CGMCC NO. 4611 ；其分类命名为杂交瘤细胞株；保藏时间是2011年2月23日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。亚类鉴定结果显示，单抗2G11为IgGl亚型，单抗3E10为IgGh亚型，轻链均为 κ链。经间接ELISA检测，单抗效价分别为上清液分别是1 640、1 640，腹水分别是 1 409600,1 204800。Western-blot分析表明，获得的2株单抗均能特异性识别EIV NP 重组蛋白；间接免疫荧光试验证明，2株单抗能够与天然EIV结合；ELISA测定，2株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果为2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别是4. 39 X IO6M"1和2. 2 X IO6M^10
总之，本发明两株单抗均能产生较高的腹水效价，都与EIV有很好的亲和力。本发明为抗EIVNP单抗的制备及后期EIV检测方法的建立提供了物质基础。
图1抗EIV NP单克隆抗体Wfestern blot分析；M 蛋白质分子质量标准；1 :NP重组蛋白；2 :His标签。图2本发明单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定结果；1 3 接毒的MDCK分别与单抗 2G11、3E10、4A1的间接免疫荧光反应结果；4 接毒的MDCK与SP2/0的间接免疫荧光反应结^ ο图3杂交瘤细胞与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例本发明单克隆抗体的制备及鉴定1.材料与方法1. 1病毒株、细胞及实验动物EIV A/马/新疆/07(H3N8)由本发明人实验室分离并保存，马病毒性动脉炎病毒 (EAV)、马乙型脑炎病毒(JEV)、马鼻肺炎病毒(EHV-1和EHV-4)购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；NP和骨髓瘤细胞SP2/0由本发明人实验室保存；BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。1. 2主要试剂HAT选择性培养基、HT选择性培养基、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗鼠IgG羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司；胎牛血清购自GIBCO公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠二抗为Sigma公司产品；Surper ECL Plus超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司；HiTrap Protein G HP购自GE公司。1. 3动物免疫NP经镍柱纯化后作为免疫原，与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经腹腔接种4周龄 BALB/c小鼠，IOOyg/只。以后每间隔2周将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化进行免疫。共免疫3次。在3免后第7d-10d尾部静脉采血测抗体效价，当抗体效价达到1 104 以上时，用不加佐剂的抗原100 μ g/只于腹腔加强免疫，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。1. 4间接ELISA检测方法的建立蔗糖密度梯度纯化EIV A/马/新疆/07 (H3N8)，方法见文献(郭巍，王英原，王宇， 等.H3N8亚型马流感病毒间接ELISA抗体检测方法建立及应用[J].中国预防兽医学报， 2010,32 :190-193.)。以纯化的EIV作为包被抗原，设置矩阵建立间接ELISA检测方法，通过酶标仪读取D45tlnm值。取阳性孔D45tlnm接近1. 0，P/N值最大的抗原、抗体稀释度作为二者的最佳工作浓度。1. 5细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及亚型鉴定将免疫鼠的脾细胞与SP2/0用PEG 4000进行融合，用建立的ELISA方法进行筛选。经4次亚克隆后，选择D45tlnm值高且能稳定分泌抗体的细胞扩大培养。每次亚克隆前都要及时进行细胞冻存。采用SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类试剂盒进行亚型鉴定。1. 6单抗腹水的制备选取8周龄 10周龄健康雌性BALB/c小鼠0. 5mL/只腹腔注射灭菌液体石蜡油， 7d 14d后接种2 X IO5个/只 IX IO6个/只杂交瘤细胞。约7d IOd后收集腹水。间接ELISA方法测定杂交瘤细胞上清和腹水效价，SP2/0细胞培养上清和SP2/0腹水作为阴性对照，以P/N ^ 2. 1的最高稀释倍数为单抗的效价。利用ftOtein G柱子对腹水进行纯化。1. 7单抗特性鉴定1.7. 1特异性分析采用^festern blot分析单抗与重组His-ΝΡ和His蛋白的反应活性，间接ELISA 分析单抗与EAV、EHV-I、EHV-4和JEV的反应性。间接免疫荧光分析单抗与EIV的反应性。将MDCK细胞传至96孔板，待其长至60%时接种TPCK-胰酶处理的EIV。培养60h后用预冷的无水乙醇室温固定15min 30min。加入杂交瘤上清和SP20上清，37°C感作Ih后，加入羊抗鼠荧光抗体，37°C作用lh，镜检。1.7. 2亲和力分析利用非竞争性酶联免疫法进行(BEATTY J D，BEATTY B G and VLAHOS W G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay [J], J Immunol Methods，1987，100 :173-179.)。将纯化的新疆株 EIV 按 10 μ g/ml、5 μ g/ml、2. 5 μ g/ml和1. 25 μ g/ml包被酶标板。将纯化的单抗从300 μ g/ml开始稀释，稀释因子为1 4。测045(| 。以抗体浓度(μ g/ml)为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制曲线。将S型曲线的顶部设置为Dmax，找出50% Dmax对应的抗体浓度，将曲线两两一组，根据公式Ka= (n-l)/2(n[Ab' ]t_[Ab]t)计算单抗的亲和常数。其中η为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab' ]t和[Ab]t是每组中两个50% Dmax对应的抗体浓度(mol/ L)。2.实验结果2. 1间接ELISA方法的建立以纯化的EIV新疆株为检测抗原，通过矩阵法确定抗原的最佳浓度为10 μ g/ml, 阴阳性血清的最佳稀释度均为1 400，作用时间lh。HRP标记抗鼠IgG最佳稀释度为 1 40000，作用时间 45min。2. 2杂交瘤细胞株的建立及亚类鉴定经4次细胞克隆，最终获得3株能稳定分泌抗EIVNP的杂交瘤细胞株，分别命名为 2G11、3E10和4A1。抗体亚类试剂盒鉴定结果显示2G11为IgGl亚型，3E10为IgG^i亚型， 4A1为IgM亚型。轻链均为κ链。2. 3单抗腹水的制备及效价测定采用间接ELISA方法测定2G11和3E10腹水效价为1 409 600和1 204 800， 明显高于杂交瘤上清液的效价1 640和1 640。但4A1上清效价为1 320，腹水效价确为0。采用ftOtein G对2G11和3E10进行纯化，纯化后浓度分别为900 μ g/ml和!Mg/ ml ο2. 4单抗的特性鉴定2. 4. 1特异性分析Western blot分析结果显示，3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白，而与His 标签无反应性(图1)。间接ELISA结果证明这3株单抗仅与EIV反应呈阳性，而与EAV、 EHV-l、EHV-4和JEV反应均为阴性。表明这3株单抗与EIV特异性结合。间接免疫荧光鉴定，其结果同样反映出这3株单抗与EIV反应呈阳性(图2)。2. 4. 2单抗亲和力测定结果纯化的2G11和3E10利用非竞争性酶联免疫试验，绘制ELISA反应曲线图(图3)。 通过计算得出2G11的亲和常数为4. βθΧΙΟ^,βΕΙΟ的亲和力常数为2. 2 X IO6M^10
权利要求
1.一株分泌抗马流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏号是CGMCC NO. 4611。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测马流感病毒试剂中的用途。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测马流感病毒试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了马流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原，细胞融合后通过有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选，获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11和3E10。两株单抗均能产生较高的腹水效价，Western-blot分析表明，所获得的2株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白；间接免疫荧光试验证明，2株单抗能够与天然EIV结合；ELISA测定，2株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。本发明为抗EIV NP单抗的制备及后期EIV检测方法的建立提供了物质基础。
文档编号C12N5/20GK102242082SQ20111010538
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者相文华, 赵立平, 郭巍 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所