专利名称：一种用于生产植物甾醇酯的磁性固定化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，属催化材料与化学合成领域。
背景技术：
植物留醇具有降低血清胆固醇水平，预防心血管疾病的功效。但是游离的植物甾醇在水和油中的低溶解度限制了其在食品中的应用。研究表明，由植物留醇与脂肪酸通过酯化反应制得的植物留醇酯，可大大增加植物留醇的脂溶性，能比较方便地添加到油脂或含油脂食品中。另外，植物留醇酯的吸收利用率是植物留醇的5倍，且具有更好的亲脂性和更佳的降胆固醇效果，是一种新型的功能性食品基料。2010年，植物留醇酯已被我国卫生部列入新食品资源。目前，植物留醇酯的合成主要有化学法和酶法两种。化学法合成植物留醇酯的途径有直接酯化法、酰氯酯化法、酸酐酯化法、酯交换法等。常用的催化剂主要有甲醇钠、乙醇钠等烷氧基碱金属化合物。这些化学催化剂易于工业化但容易腐蚀设备，且易产生副产物，还存在后处理复杂、易造成三废污染环境等严重缺点。酶催化合成法条件温和，避免了高温产生的副反应，且产物容易分离纯化，但是游离酶的稳定性和回收、重复使用问题仍制约着实际生产中的应用。以磁性纳米颗粒为载体制备的固定化酶易于从反应体系中分离和回收，操作方便；可利用外部磁场控制磁性固定化酶的运动方式，替代传统的机械搅拌，提高固定化酶的催化效率。近年来，以磁性颗粒为载体制备固定化酶的研究层出不穷，如李彦峰等制备了 3 种含有环氧基体的磁性固定化脂肪酶，此类固定化酶稳定性明显优于游离酶；但是，磁性材料的表面改性通常采用硅烷化的方法，需要使用大量有毒的甲苯做溶剂，制备过程不够环保。CN10128(^98A采用表面吸附氨基的!^e3O4粉末为载体制备了固定化酶，随着重复使用次数的增加其活性明显下降。然而，磁性固定化酶的研究主要集中在制备方法和初步的活性评价上，可用于催化实际化学反应的磁性固定化酶还很少，用于植物留醇酯生产的磁性固定化酶还未见报道。因此，磁性固定化酶在催化化学反应中的活性、稳定性、重复使用次数与高效回收利用仍是目前磁性固定化酶制备技术中急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法。该磁性固定化酶具有催化活性高、反复使用性能好、分离回收简便的特点。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤1)按磁基体乙烯基膦酸水溶液=20-30g 200mL，选取磁基体和乙烯基膦酸水溶液，其中乙烯基膦酸水溶液的浓度为20-35mg/mL，乙烯基膦酸水溶液的pH为6. 0 (用 NaOH调pH)；将磁基体分散于乙烯基膦酸水溶液中，氮气保护下回流反应8-12h，反应完毕后采用蒸馏水、甲醇交替清洗3-5次(蒸馏水、甲醇各清洗3-5次，交替进行)，真空干燥，得到改性磁基体(或称双键修饰的磁性纳米颗粒)；利用乙烯基膦酸上氧的电子对进攻磁基体(狗304、狗203磁性纳米颗粒)表面丰富的、缺电子狗，使乙烯基膦酸吸附在磁基体上，整个磁基体表面带上一层均勻的双键；2)将改性磁基体悬浮有机溶剂中，得到浓度为10-20mg/mL的悬浮液；按单体有机溶剂=20-50mmol 1L，单体与交联剂的摩尔比为1 1_1 4，引发剂的用量为单体和交联剂总质量的1_2%，准备单体、交联剂和引发剂；将单体、交联剂和引发剂与上述悬浮液混合，得到混合物；混合物加热至60-80°C，保持10-30min，然后升高温度至92-96°C，控制在60-120min内蒸出一半的有机溶剂，反应期间保持搅拌；反应结束后，采用外加磁场分离出颗粒状物，颗粒状物用蒸馏水和甲醇交替清洗3-5次(蒸馏水、甲醇各清洗3-5次，交替进行)，真空干燥，得到磁性聚合物微球；可以通过控制溶液中单体和交联剂的浓度和比例以及蒸出溶剂的速度来控制聚合物层的厚度；3)按pH 5. 0-7. 0的磷酸盐缓冲溶液(浓度为0. 05M-0. 1M)与吐温-20的质量百分比为99.9% 0. 1%，将吐温-20加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液；按脂肪酶pH 5. 0-7. 0的磷酸盐缓冲溶液(浓度为0. 05M-0· 1M) = 2_5mg ImL, 将脂肪酶加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液；按磁性聚合物微球含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液脂肪酶溶液= 20-50mg ImL lmL，选取磁性聚合物微球、含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液和脂肪酶溶液； 将磁性聚合物微球在含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸润lh，然后除去该含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，换成脂肪酶溶液(由脂肪酶溶液替换该含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液)，进行脂肪酶的固定化，反应温度20-30°C，摇床转速150-200rpm，反应时间6_10h，反应结束后，得到磁性固定化酶；将磁性固定化酶经蒸馏水清洗3-5次，冷冻干燥后，即得到用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶。所述的磁基体是粒径为10-50nm的!^e3O4或粒径为10-50nm的!^e2O3纳米颗粒。所述的有机溶剂为乙腈或异丙醇等。所述的单体包括含有环氧基体的甲基丙烯酸缩水甘油酯或烯丙基缩水甘油醚；或含有磺酸根基团的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸等。所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。所述的引发剂为偶氮二异丁腈。所述的脂肪酶，包括来源于动物的猪胰腺酶，或来源于微生物发酵的皱褶假丝酵母、解脂假丝酵母、南极假丝酵母、洋葱假单胞菌脂肪酶或米根霉等，优选来源于微生物发酵得到的脂肪酶。本发明所制得的磁性固定化酶的粒径为1-5 μ m。所述磁性固定化酶用于植物留醇催化酯化的条件为选择弱极性的异辛烷、正己烷、环己烷等为溶剂，固定化酶加入量5-40mg/mL，分子筛加入量为20-60mg/mL，反应温度 40-60°C，反应时间6-Mh。酯化反应可以在带搅拌的反应装置中或磁场流化床中进行；反应结束后，用永磁铁或电磁场将磁性固定化酶吸附回收，回收的磁性固定化酶经叔丁醇和异辛烷(或正己烷、环己烷)交替清洗后可重复使用5次以上。本发明制备的磁性固定化酶原料适用性广，可以分别用于催化脂肪酸和植物甾醇的酯化反应，脂肪酸甲(乙)酯与植物留醇的转酯化反应和甘油三酯与植物留醇的转酯化反应。本发明所述的脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、等饱和或不饱和的脂肪酸，也可以是混合脂肪酸；脂肪酸酯为上述脂肪酸的甲(乙)酯，也可以是植物油经甲酯或乙酯化反应后的混合脂肪酸酯；甘油三酯为菜籽油、茶籽油、葵花籽油、大豆油、亚麻油、鱼油等动植物油脂。本发明所述的植物留醇可以是豆留醇、谷留醇、菜籽留醇、菜油留醇等多种留醇的混和物，也可以上述单个留醇的纯品。本发明首先采用乙烯基膦酸对磁性基体进行化学改性，在其表面引入具有反应活性的碳-碳双键；然后在改性磁基体(改性的磁性颗粒)表面包裹含有环氧基、磺酸基等活性基团的聚合物层，制得磁性聚合物微球；接下来在缓冲溶液中，通过环氧基开环或静电吸附等方法实现酶在磁性聚合物微球表面的固定化，制得磁性固定化酶。最后，将该磁性固定化酶用于催化脂肪酸与植物留醇的酯化反应或脂肪酸酯与植物留醇的转酯化反应。本发明的有益效果是1)首先采用乙烯基膦酸对磁性基体进行化学改性，可在其表面方便地引入具有反应活性的碳-碳双键；然后通过悬浮聚合反应在改性磁基体表面包裹含有环氧基、磺酸基等活性基团的聚合物层，从而制得多种磁性聚合物微球固定化酶。2)本发明具有简便易行，颗粒大小可控，磁性固定化酶催化活性高，转化率保持 80%以上，反复使用性能好(重复使用次数多，可达5次以上)，可采用外加磁场实现催化剂与产物的高效快速分离等特点。幻本发明制备的磁性固定化酶原料适用性广。可以分别催化脂肪酸和植物留醇的酯化反应，脂肪酸甲(乙)酯与植物留醇的转酯化反应以及甘油三酯与植物留醇的转酯化反应，以满足多种不同的需要。4)基于该磁性固定化酶建立的植物留醇酯合成途径避免了有毒和腐蚀性试剂的使用，副产物少，反应条件温和，制得的产品具有色泽浅、品质高的特点。5)制备过程环保。
具体实施例方式下面来描述本发明的优选方案；它包含在本发明保护的范围之内，但不限制本发明。实施例1 一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，它包括如下步骤1)、将4g乙烯基膦酸溶于200mL蒸馏水中，用NaOH调pH为6. 0，得到乙烯基膦酸水溶液；称取I^e3O4纳米颗粒20g(粒径为10-50nm)，加入上述200mL的乙烯基膦酸水溶液， 机械搅拌下，在氮气保护下回流8h，反应完毕后采用蒸馏水和甲醇交替清洗5次(蒸馏水、 甲醇各清洗5次，交替进行)，真空干燥，得到改性磁基体。2)、将4g改性磁基体悬浮于400mL乙腈中，得到悬浮液；悬浮液中加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯2. 4g(17mm0l)，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯6. 5g(33mmol)，引发剂偶氮二异丁腈0. 178g，加热至80°C，保持20min ；然后升高温度至92_96°C，控制在SOmin内蒸出 200mL的乙腈(有机溶剂)，反应期间保持剧烈搅拌；反应结束后，采用外加磁场分离出颗粒状物(即将磁性聚合物颗粒移出)，颗粒状物用蒸馏水和甲醇交替清洗5次，真空干燥，制得含有环氧基的磁性聚合物微球，直径为1-3 μ m。3)、按pH 7. 0的磷酸盐缓冲溶液(0. 1M)与吐温-20的质量百分比为 99.9% 0.1%，将吐温-20加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液 (制备 50mL)；按脂肪酶pH 7. 0的磷酸盐缓冲溶液(0. 1M) = 2mg lmL，将脂肪酶加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液(制备50mL)；脂肪酶来源于皱褶假丝酵母；将Ig磁性聚合物微球在50mL的含吐温_20的磷酸盐缓冲溶液(0. 1Μ、ρΗ 7. 0，含质量百分比0. 吐温-20)中浸润Ih后，除去该含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，换成50mL 的脂肪酶溶液，20°C摇床内孵育他，转速160rpm，反应结束后，然后用蒸馏水清洗5次，冷冻干燥后，即得到用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶冷藏保存)。应用植物油和留醇转酯化合成留醇酯称取植物留醇4. 2g，按菜籽油与植物甾醇摩尔比为1.5 1称取甘油三酯，2g磁性固定化酶(实施例1)，加入IOOmL异辛烷，置于 55°C恒温摇床上反应12h，转速为160rpm。反应完毕后借助磁场除去磁性固定化酶，减压蒸出溶剂。加入反应物质量5%的无水乙醇，搅拌后置于4°C冰箱过夜，离心除去未反应完全的植物甾醇，分子蒸馏除去未反应的菜籽油，酯化率为85. 2%。磁性固定化酶回收后经异辛烷清洗3次后，重复上述反应5次后，酯化率仍大于 80%。实施例2 一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，它包括如下步骤1)、将6g乙烯基膦酸溶于200mL蒸馏水中，用NaOH调pH为6. 0，得到乙烯基膦酸水溶液；称取I^e2O3纳米颗粒25g(粒径为10-50nm)，加入上述200mL的乙烯基膦酸水溶液，机械搅拌下，在氮气保护下回流8h，反应完毕后采用蒸馏水和甲醇交替清洗5次，真空干燥， 得到改性磁基体。2)、将6g改性磁基体悬浮于400mL异丙醇中，得到悬浮液；悬浮液中加入单体2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸2. Ig(IOmmol),交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯 7. 9g(40mmol)，引发剂偶氮二异丁腈0. Ig,加热至80°C，保持30min ；然后升高温度至 92-96°C，控制在IOOmin内蒸出200mL的异丙醇(有机溶剂)，反应期间保持剧烈搅拌反应结束后，采用外加磁场分离出颗粒状物(即将磁性聚合物颗粒移出)，颗粒状物用蒸馏水和甲醇交替清洗5次，真空干燥，制得的含有磺酸根的磁性聚合物微球，直径为2-4 μ m。3)、按pH 5. O的磷酸盐缓冲溶液(0. 05M)与吐温-20的质量百分比为 99.9% 0.1%，将吐温-20加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液 (制备 50mL)；按脂肪酶pH 5. O的磷酸盐缓冲溶液(0. 05M) = 3mg lmL，将脂肪酶加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液(制备50mL)；脂肪酶来源于解脂假丝酵母；将2g磁性聚合物微球在50mL的含吐温_20的磷酸盐缓冲溶液(0. 05M、pH 5. 0，含质量百分比0. 吐温-20)中浸润Ih后，除去该含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，换成50mL 的脂肪酶溶液，25°C摇床内孵育6h，转速150rpm，反应结束后，然后用蒸馏水清洗5次，冷冻干燥后，即得到用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶冷藏保存)。应用脂肪酸与留醇合成植物留醇酯称取植物留醇4. 2g，按α -亚麻酸与植物甾醇摩尔比为2 1称取α-亚麻酸，3g磁性固定化酶(实施例2)，加入IOOmL异辛烷，置于 55°C恒温摇床上反应8h，转速为160rpm，3A型分子筛5g，反应完毕后借助磁场除去磁性固定化酶，减压蒸出溶剂。加入反应物质量5%的无水乙醇，搅拌后置于4°C冰箱过夜，离心除去未反应完全的植物留醇；加入反应液体积1-1. 5倍的质量浓度3%的Na2CO3溶液，40°C下搅拌10分钟，弃去水层，除去未反应的亚麻酸，再用蒸馏水将产物洗至中性，真空干燥后即得到植物留醇在产品，酯化率为93.2%。固定化酶回收后经异辛烷清洗3次后，重复上述反应5次后，酯化率仍大于80%。实施例3 一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，它包括如下步骤1)、将7g乙烯基膦酸溶于200mL蒸馏水中，用NaOH调pH 6. 0，得到乙烯基膦酸水溶液；称取I^e3O4纳米颗粒30g (粒径为10-50nm)，加入上述200mL的乙烯基膦酸水溶液，机械搅拌下，在氮气保护下回流12h，反应完毕后采用蒸馏水和甲醇交替清洗3次，真空干燥， 得到改性磁基体。2)、将8g改性磁基体悬浮于400mL乙腈中，加入单体烯丙基缩水甘油醚 1. 9g(17mmol)，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯6. 5g(33mmol)，引发剂偶氮二异丁氰0. 09g, 加热至60°C，保持IOmin ；然后升高温度至92_96°C，控制在120min内蒸出200mL的有机溶剂(乙腈)，反应期间保持剧烈搅拌；反应结束后，将磁性聚合物颗粒移出(采用外加磁场分离颗粒状物)，用蒸馏水和甲醇交替清洗3次，真空干燥，制得的含有环氧基的磁性聚合物微球，直径为3-5 μ m。3)、按pH7. 0的磷酸盐缓冲溶液(0. 1M)与吐温-20的质量百分比为 99.9% 0.1%，将吐温-20加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液 (制备 50mL)；按脂肪酶pH7. 0的磷酸盐缓冲溶液(0. 1M) = 5mg lmL，将脂肪酶加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液(制备50mL)；脂肪酶来源于皱褶假丝酵母；将2. 5g磁性聚合物微球在50mL的含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(0. 1Μ、ρΗ 7. 0， 含质量百分比0. 吐温-20)中浸润Ih后，除去该含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，换成 50mL的脂肪酶溶液，30°C摇床内孵育10h，转速200rpm，反应结束后，然后用蒸馏水清洗3 次，冷冻干燥后，即得到用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶冷藏保存)。应用脂肪酸甲酯和留醇转酯化合成留醇酯称取植物留醇4. 2g，按脂肪酸甲酯 (亚麻油甲酯化的产物)与植物留醇摩尔比为8 1称取脂肪酸甲酯，2g磁性固定化酶(实施例3)，在501 真空条件下反应10h，反应温度为55°C，机械搅拌转速为200rpm。反应完毕后借助磁场除去磁性固定化酶，采用分子蒸馏回收过量的脂肪酸甲酯。加入反应物质量 5%的无水乙醇，搅拌后置于4°C冰箱过夜，离心除去未反应完全的植物留醇，即得到植物甾醇酯产品，酯化率为84. 5%。固定化酶回收后经异辛烷清洗3次后，重复上述反应5次后， 酯化率仍大于80%。
本发明所列举的各原料(如脂肪酶的各具体原料)，以及本发明各原料的上下限、 区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不
一一列举实施例。
权利要求
1.一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤1)按磁基体乙烯基膦酸水溶液=20-30g 200mL，选取磁基体和乙烯基膦酸水溶液，其中乙烯基膦酸水溶液的浓度为20-35mg/mL，乙烯基膦酸水溶液的pH为6. 0 ；将磁基体分散于乙烯基膦酸水溶液中，氮气保护下回流反应8-12h，反应完毕后采用蒸馏水、甲醇交替清洗3-5次，真空干燥，得到改性磁基体；2)将改性磁基体悬浮有机溶剂中，得到浓度为10-20mg/mL的悬浮液；按单体有机溶剂= 20-50mmol 1L，单体与交联剂的摩尔比为1 1_1 4，引发剂的用量为单体和交联剂总质量的1_2%，准备单体、交联剂和引发剂；将单体、交联剂和引发剂与上述悬浮液混合，得到混合物；混合物加热至60-80°C，保持10-30min，然后升高温度至92_96°C，控制在 60-120min内蒸出一半的有机溶剂，反应期间保持搅拌；反应结束后，采用外加磁场分离出颗粒状物，颗粒状物用蒸馏水和甲醇交替清洗3-5次，真空干燥，得到磁性聚合物微球；3)按pH5. 0-7. 0的磷酸盐缓冲溶液与吐温-20的质量百分比为99. 9% 0. 1%，将吐温-20加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液；按脂肪酶PH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液=2-5!^ lmL，将脂肪酶加入到磷酸盐缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液；按磁性聚合物微球含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液脂肪酶溶液= 20-50mg ImL lmL，选取磁性聚合物微球、含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液和脂肪酶溶液；将磁性聚合物微球在含吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中浸润lh，然后除去该含吐温-20 的磷酸盐缓冲溶液，换成脂肪酶溶液，进行脂肪酶的固定化，反应温度20-30°C，摇床转速 150-200rpm，反应时间6-10h，反应结束后，经蒸馏水清洗3-5次，冷冻干燥后，即得到用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的磁基体是粒径为10-50nm的!^e3O4或粒径为10-50nm的!^e2O3纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙腈或异丙醇。
4.根据权利要求1所述的一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法， 其特征在于所述的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯或烯丙基缩水甘油醚；或为2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸。
5.根据权利要求1所述的一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。
6.根据权利要求1所述的一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的引发剂为偶氮二异丁腈。
7.根据权利要求1所述的一种用于生产植物留醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶为来源于动物的猪胰腺酶，或来源于微生物发酵的皱褶假丝酵母、解脂假丝酵母、南极假丝酵母、洋葱假单胞菌脂肪酶或米根霉。
全文摘要
本发明涉及一种用于生产植物甾醇酯的磁性固定化酶的制备方法，属催化材料与化学合成领域。一种用于生产植物甾醇酯的磁性固定化酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤1)采用乙烯基膦酸对磁性基体进行化学改性，在其表面引入具有反应活性的碳-碳双键；2)在改性的磁性颗粒表面包裹含有环氧或磺酸根基团的聚合物层，制得磁性聚合物微球；3)在缓冲溶液中，通过环氧开环或静电吸附的方法实现酶在磁性聚合物微球表面的固定化，制得用于生产植物甾醇酯的磁性固定化酶。该磁性固定化酶具有催化活性高、反复使用性能好、分离回收简便的特点。
文档编号C12N11/14GK102250869SQ20111013842
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者万楚筠, 刘昌盛, 李文林, 杨湄, 程小英, 董琳, 许继取, 邓乾春, 郑明明, 郭萍梅, 钮琰星, 黄凤洪, 黄庆德 申请人:中国农业科学院油料作物研究所