专利名称：一种八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种八氢番茄红素脱氢酶基因，尤其涉及一种高效合成番茄红素的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
番茄红素是目前自然界中发现的最强抗氧化剂，能高效淬灭单线态氧和清除自由基，其淬灭单线态氧速率常数是维生素E的100倍，因而番茄红素具有重要的生理功能，如防癌、抗老化、提高免疫力等。目前商品化番茄红素的获得主要是从番茄中提取，这种方法需要大量的番茄来保证工业生产的连续性和低成本，而且番茄不便运输，其获得受气候条件影响较大。由于环境恶化和人们健康意识的提高，番茄红素需求量越来越大，仅靠有限的番茄提取不能满足市场需求，迫切需要开发新的获得方法。微生物发酵法生产番茄红素周期短，能克服气候和产地限制，大大降低生产成本，因而受到广泛关注。微生物发酵法生产番茄红素主要是利用八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,ECl. 14. 99.-)对底物八氢番茄红素脱氢生成。目前国际上进行番茄红素生产研究的八氢番茄红素脱氢酶来源有限，需要寻找新的高效合成番茄红素的酶源。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种来源于固氮红细菌的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用。一种八氢番茄红素脱氢酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述八氢番茄红素脱氢酶基因全长1557碱基，来源于固氮红细菌(Iihodobacter azotoformans)m5，固氮红细菌船5购自日本NITE Biological Resource Center (NBRC) 保藏编号为16436。由上述八氢番茄红素脱氢酶基因编码的八氢番茄红素脱氢酶，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。该八氢番茄红素脱氢酶全长518个氨基酸。一种含有上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的大肠杆菌表达载体。上述大肠杆菌表达载体为pET_22b表达载体。该pET_22b表达载体购自德国 Novagen 公司。上述八氢番茄红素脱氢酶在制药、食品领域方面的应用。上述八氢番茄红素脱氢酶基因在制备番茄红素和链孢红素方面的应用。上述应用，步骤如下将八氢番茄红素脱氢酶基因克隆到pET_22b表达载体上，与质粒pACCRT-EB共同转化大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导产生番茄红素和链孢红素。上述质粒pACCRT-EB，是通过将菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的栊牛儿栊牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE) (GenBank No. D90087)和八氢番茄红素合成酶基因(crtB) (GenBank No. D90087)分别通过BamHI-SacI，NdeI-KpnI酶切位点连接到大肠杆菌表达载体 pACYCDuet-1 (Novagen, Germany)上构建得至丨J。以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。本发明有益效果如下本发明所述八氢番茄红素脱氢酶基因经克隆到pET_22b表达载体上，然后与质粒 pACCRT-EB共同转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达，可高效生产番茄红素。经检测， 发酵液中番茄红素产量为0. ^59mg/L，菌体干重中番茄红素含量为0. 256mg/g,占类胡萝卜素总量的73. 5%，固氮红细菌八氢番茄红素脱氢酶重组酶催化产物以番茄红素为主要色素成分，为番茄红素生产提供了新的酶源。
图1是本发明所述固氮红细菌KA25重组八氢番茄红素脱氢酶的SDS-PAGE电泳图；其中，M、蛋白分子量标准，1、大肠杆菌重组八氢番茄红素脱氢酶粗酶，2、穿过峰， 3、Washing Buffer 1 洗脱峰，4、Washing Buffer 2 洗脱峰，5、Eluting Buffer 洗脱峰。图2是本发明所述固氮红细菌KA25八氢番茄红素脱氢酶基因与菠萝泛菌 (Pantoea ananatis)的栊牛儿栊牛儿焦磷酸合成酶基因及八氢番茄红素合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达，催化生成的类胡萝卜素产物液相图谱；其中，1、番茄红素，2、链孢红素。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，但不限于此。实施例1 固氮红细菌(Iihodobacter azotoformans) KA25八氢番茄红素脱氢酶基因的PCR扩增取购自日本NITE Biological Resource Center (NBRC)保藏编号为 16436 的固氮红细菌(Iihodobacter azotoformans)KA25培养液5mL，用细菌基因组提取试剂盒进行基因组提取，提取步骤参照Qiagen公司的细菌基因组提取试剂盒说明书。从GenBank中检索同属不同菌株八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列，设计一对引物F-I和R-I。引物序列如下F-I :5’ -ATGCCCGCGACCAAGCATGT-3，SEQ ID N0. 3R-I :5，-TCATTCCgCggCCAgCCTTT-3，SEQ ID NO. 4以基因组DNA为模板进行扩增，采用上述引物进行扩增。总体积为50μ L，超纯水 18 μ L，2 XGC buffer I (含 MgCl2) 25 μ L，dNTP (各 2. 5mmol/L) 4 μ L，引物(20ymol/L)各 1 μ L,基因组DNA 25ng, TaKaRa LA Taq酶2. 5U。PCR扩增条件95°C预变性5分钟，反应 30个循环(95°C变性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸1. 5分钟)，30个循环结束后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，用Bioflux凝胶回收试剂盒进行PCR片段切胶回收，测序大小为1557bp。所得产物即为固氮红细菌八氢番茄红素脱氢酶基因片段，测得序列如SEQ ID No. 1。该段核苷酸序列全长1557bp，是一个完整的0RF，编码518个氨基酸。该1557bp的ORF即为固氮红细菌的八氢番茄红素脱氢酶基因，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为 SEQID No. 1 和 SEQ ID No. 2。实施例2 固氮红细菌(Iihodobacter azotoformans) KA25八氢番茄红素脱氢酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和纯化根据SEQ ID No. 1所示序列设计引物F-I_22b和R-I_22b，分别引入能插入 pET-22b质粒的NdeUalI酶切位点(下划线所示)，序列如下F-I-22b :5’ -GCGCATATGCCCGCGACCAAGCATGT-3’ SEQ ID NO. 5R-I-22b :5，-GCGGTCGACTTCCgCggCCAgCCTTTCA-3‘ SEQ ID NO. 6以提取的固氮红细菌基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例1。PCR产物回收后加Ndel、Sail (NEB, USA)于37°C酶切 1小时，进行DNA纯化，采用同样酶切方法处理pET-22b质粒载体。将制备好的酶基因片段与pET-2^载体按一定比例混合，采用T4连接酶(NEB，USA)于16°C连接18小时，然后采用 CaCl2转化法转化宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)，转化菌液涂布氨苄青霉素抗性LB平板，37°C 过夜培养。挑取生长良好的单菌落至LB液体培养基中37°C培养10小时，提取质粒，通过酶切法和PCR法验证阳性转化子，得到表达固氮红细菌八氢番茄红素脱氢酶的大肠杆菌重组菌。将上述在氨苄青霉素抗性LB平板中生长良好的大肠杆菌重组菌接种于200mL LB 培养液，37°C培养至OD600达到0. 5 0. 9，加IPTG诱导，IPTG终浓度为0. 5mmol/L，25°C诱导培养30小时。离心收集菌体细胞，用lOOmmol/L Tris-HCl (pH7. 9)重悬后超声波破碎。 破碎液12000rpm离心20分钟后用镍亲和层析柱(GE，USA)进行重组八氢番茄红素脱氢酶的纯化。纯化中使用的溶液如下Binding Buffer =Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，浓 HCl 调 ρΗ7· 9 ；Washing Bufferl 咪唑 20mmol/L，Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，浓 HCl 调 ρΗ7· 9 ；Washing Buffer2 咪唑 50mmol/L，Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，浓 HCl 调 ρΗ7· 9 ；Eluting Buffer 咪唑 200mmol/L，Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，浓 HCl 调 ρΗ7· 9。上述纯化过程中的收集峰用SDS-PAGE电泳进行检测，电泳采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为10%，浓缩胶4%，电泳结果显示酶蛋白单亚基分子量约为57士5kDa(如附图1)。上述LB 培养液成分蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 7g/L，ρΗ7· 0 7. 5，121 °C 灭菌20分钟。实施例3 固氮红细菌(Iihodobacter azotoformans) KA25八氢番茄红素脱氢酶基因和质粒pACCRT-EB在大肠杆菌BL21中共表达将实施例2中获得的固氮红细菌八氢番茄红素脱氢酶重组质粒与质粒pACCRT-EB 共同转化宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)，转化和诱导方法同实施例2。诱导后的重组大肠杆菌离心后菌体用丙酮进行类胡萝卜素提取，HPLC检测，色谱柱为TC-C18 (Agilent，USA)，流动相甲醇/乙腈(4/6)，流速ImL/分钟，柱温30°C，检测波长474nm。
图2显示上述双质粒共表达大肠杆菌菌株产物主要有两种类胡萝卜素，通过质谱数据和标准品保留时间比较，鉴定两种类胡萝卜素分别是番茄红素和链孢红素，其中番茄红素相对含量为73. 5 %，链孢红素为19. 1%。番茄红素产量为0. 256mg/g细胞干重。上述质粒pACCRT-EB，是通过合成菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的栊牛儿栊牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE) (GenBank No. D90087)和八氢番茄红素合成酶基因(crtB) (GenBankNo. D90087)分别通过BamHUacI，NdeI-KpnI酶切位点连接到大肠杆菌表达载体 pACYCDuet-1 (Novagen, Germany)上构建得至丨J。
权利要求
1.一种八氢番茄红素脱氢酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.由权利要求1所述的八氢番茄红素脱氢酶基因编码的八氢番茄红素脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.一种含有权利要求1所述核苷酸序列的大肠杆菌表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，大肠杆菌表达载体为pET-22b表达载体。
5.权利要求2所述八氢番茄红素脱氢酶在制药、食品领域方面的应用。
6.权利要求1所述八氢番茄红素脱氢酶基因在制备番茄红素和链孢红素方面的应用。
7.如权利要求6所述应用，步骤如下将八氢番茄红素脱氢酶基因克隆到pET-22b表达载体上，与质粒pACCRT-EB共同转化大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导产生番茄红素和链孢红素。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，上述质粒pACCRT-EB，是通过将菠萝泛菌 (Pantoea ananatis)的栊牛儿栊牛儿焦磷酸合成酶基因crtE和八氢番茄红素合成酶基因 crtB分别通过BamHUacI，NdeI-KpnI酶切位点连接到大肠杆菌表达载体pACYCDuet_l上构建得到。
全文摘要
本发明涉及一种八氢番茄红素脱氢酶基因，尤其涉及一种高效合成番茄红素的八氢番茄红素脱氢酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。一种八氢番茄红素脱氢酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的八氢番茄红素脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述八氢番茄红素脱氢酶基因可高效生产番茄红素。经检测，发酵液中番茄红素产量为0.269mg/L，菌体干重中番茄红素含量为0.256mg/g，占类胡萝卜素总量的73.5％，固氮红细菌八氢番茄红素脱氢酶重组酶催化产物以番茄红素为主要色素成分，为番茄红素生产提供了新的酶源。
文档编号C12R1/01GK102260692SQ201110190899
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者卢丽丽, 张金华, 肖敏 申请人:山东大学