一种获得神经白细胞素的方法

专利名称：一种获得神经白细胞素的方法
技术领域：
本发明属动物细胞培养领域，涉及细胞分泌的新生化物质的发现、检测及鉴定的方法。
背景技术：
睾丸支持细胞(Sertoli cell, SCs)是由意大利人Enricol Sertoli于1865年在油镜下首次发现，并以其名字命名。Sertoli认为支持细胞是围绕着生精细胞生长的上皮细胞，而这些上皮细胞具有保护生精细胞的功能(Griswold M.D, Morales C, SylvesterS.R.Molecular biology of the Sertoli cell[J].0xford Reviews of ReproductiveBiology,1988，10:124-161)。Sertoli还建立了支持细胞的染色方法，即通过用硝酸和乙酸甚至碘液进行组织显色观察，获得了较清晰的细胞核结构。在Sertoli发现了支持细胞后，学者们展开了大量关于支持细胞的研究。在电子显微镜问世以前，SCs —直被认为是生精细胞的支架结构，并作用于生精发生的各个阶段从而促进精子细胞的生成。近年来，研究表明了 SCs不仅为生精细胞提供合适的生理发育的微环境，还能提供促进细胞生长和保护细胞免受免疫系统攻击的活性物质和信号分子。至今，SCs的功能与调控作用还不完全清楚。神经干细胞(Neural stem cell, NSCs)能在体外合适的生长环境中增殖形成神经球，同时保持高度未分化 的特性。1992年Reynolds等首次从成年鼠脑纹状体中分离出神经干细胞，并成功进行体外培养。体外扩增的神经干细胞克隆具有多分化潜能，并可以被诱导分化形成神经元(neuron),星形胶质细胞(astrocyte)及少突胶质细胞(oligodendrocyte)。神经干细胞体外分化的技术为治疗中枢神经系统损伤、神经系统病变及神经退行性疾病的治疗带来希望。根据文献报道，诱导神经干细胞分化主要通过以下三个方面进行:(I)将携带治疗作用的目的基因的神经干细胞进行移植；(2)在神经干细胞的生长环境中添加特殊的细胞因子进行诱导；(3)通过与滋养细胞共培养定向分化至功能神经元细胞。神经干细胞向神经元等神经终末端细胞的分化受控于基因的调节，即神经干细胞向不同功能的神经细胞定向分化时需要不同的基因进行调控。NSCs 一直被利用来进行外源移植治疗神经退行性疾病(NeurodegenerativeDiseases)，但是直接移植胚胎NSCs会有产生畸胎瘤的风险。为保证移植安全，NSCs常在体外被诱导形成分化终末端的神经细胞以后再进行移植。SCs能够提供多种神经营养因子和信号分子，在和NSCs共移植能促进发育和干细胞向神经元分化。同时，SCs还能为共移植物提供局部免疫豁免效应从而提闻了移植的效率。但是，目前现有技术中关于支持细胞是否能够促进神经元存活和轴突生长等方面还鲜有报道，也不清楚这种促进作用是由哪些活性物质所致。

发明内容
本发明的目的在于提供一种产生神经白细胞素(NLK)的方法。
本发明的另一目的在于提供一种促进神经元轴突生长的方法、本发明的另一目的还在于提供神经白细胞素的一种新用途。在本发明的第一方面，提供一种产生神经白细胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培养睾丸支持细胞，从而分泌产生神经白细胞素。 在一个优选例中，所述方法包括:(I)采用含10±1% (v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞；(2)细胞贴壁(较佳地，70%以上细胞贴壁；更佳地，75%以上细胞贴壁；更佳地，80%或80%以上细胞贴壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基，加入无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基，继续培养；和(3)步骤(2)获得的细胞培养物取上清悬浊液，其中含有神经白细胞素。在另一优选例中，所述的血清是胎牛血清。在另一优选例中，步骤(2)中，无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基中，细胞培养2-10天；较佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天、3天。在另一优选例中，步骤⑴中，培养基中睾丸支持细胞的密度是IX IO4 IXlO6细胞/ml。在另一优选例中，步骤(I)中，培养基中睾丸支持细胞的密度是2X IO4 8X IO5细胞/ml ;更佳地为4X IO4 6X IO5细胞/ml。

在另一优选例中，所述的方法还包括:从睾丸支持细胞培养物中分离分泌产生神经白细胞素。在本发明的另一方面，提供一种促进神经元轴突生长的方法，所述方法包括:(a)培养睾丸支持细胞(作为饲养(层)细胞)，其分泌产生神经白细胞素；(b)在(a)的细胞培养体系中加入神经干细胞；使神经干细胞与睾丸支持细胞混合，或使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换；从而神经干细胞分化为神经元，所述的神经元轴突生长能力增强且轴突上突触数目增加。在另一优选例中，步骤(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞；细胞贴壁(较佳地，70%以上细胞贴壁；更佳地，80%以上细胞贴壁；更佳地，90%以上细胞贴壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基。在另一优选例中，步骤(a)中，睾丸支持细胞的密度是IXlO4 IX IO6细胞/ml (较佳地2X IO4 8X IO5细胞/ml ;更佳地为4X IO4 6X IO5细胞/ml);和/或步骤(b)中，神经干细胞的密度是IX IO4 IX IO6细胞/ml (较佳地2X IO4 8 X IO5细胞/ml ;更佳地为4 X IO4 6 X IO5细胞/ml)。在另一优选例中，步骤(b)中，通过渗透膜隔离神经干细胞与睾丸支持细胞，使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换。在另一优选例中，所述的渗透膜是孔径为0.m的膜。在另一优选例中，所述的方法的步骤(b)之后还包括:分离所述的神经干细胞。在另一优选例中，步骤(b)中，加入神经干细胞后继续培养2-10天(较佳地4-10天；更佳地5-9天，如6天、7天、8天)。在本发明的另一方面，提供一种神经白细胞素的用途，用于制备促进神经元轴突生长的组合物。在另一优选例中，所述组合物还用于增加神经元上突触数目。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1、睾丸支持细胞鉴定。A:HE染色鉴定；B =DAPI荧光染色鉴定；C:扫描电子显微镜下10000倍放大效果图。图2A、神经干细胞聚集体的形成。图2B、荧光显微镜下观察在第72h时形成的神经球。图3、神经干细胞及其分化后神经元与星形胶质细胞的鉴定图。A图为分离培养第3代后NESTIN阳性单细胞；B图为DAPI细胞核荧染；C图为A，B的合成图；D图为神经干细胞分化成的神经元(标记beta TujIII) ;E图由神经干细胞分化而成的星形胶质细胞(标记GFAP) ；F图为神经干细胞接种后培养第3天时形成的神经球的NESTIN荧光照片(比例尺:30 u m) o图4、神经干细胞培养至第一、三、五天时的形态变化(比例尺:30 U m)。A、B:第一天时为单细胞形态；C:第三天时的神经球；D:第五天时的神经球。图5、在不同接种密度条件下神经干细胞的生长变化曲线。图6、通过免疫荧光染色分析神经干细胞分别在第I (A-C)，2 (D-F)，3 (G-1)代时的细胞纯度变化。(A，D，G ):Nestin阳性细胞；(B，E，H):DAPI核荧光染色；(C，F，I):复合图。图7、神经干细胞在第一、二、三代时的纯度变化。图8、皮层神经干细胞在分化培养基(DM)、条件培养基(CM)和支持细胞饲养层(Sertoli)培养时的存活率。当培养至第7天时，存活率由台盼蓝染液染液检测。图9、SDS-PAGE检测支持细胞培养上清液中的蛋白条带。图10、UPLC-ES1-MS/MS分析结果中神经白细胞素的鉴定结果(SEQ IDNO:19)。图11、琼脂糖凝胶电泳图分析了在SCs中mRNA表达情况。图12、三种培养模式在一、三、七天时轴突生长状态比较。图13、在三种培养模式下第7天时的轴突生长状态。图14、在三种培养模式下第7天时的轴突上突触数目。
具体实施例方式本发明人致力于寻找新的在促进神经元分化过程中起作用的支持细胞活性物质，通过将支持细胞与神经干细胞共培养的方法，本发明人意外发现这种培养促进了神经元分化，并且发现，支持细胞分泌神经白细胞素与这种神经元分化的促进具有关联。产生神经白细胞素的方法由于过去并未在睾丸支持细胞中发现神经白细胞素，本发明第一次揭示并验证了神经白细胞素的存在。在鉴定、分析支持细胞分泌物时，采用将超滤管离心浓缩后的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，然后进行考马斯亮蓝染色、洗脱后分辨出各区间的蛋白条带。在将切下的蛋白条带通过高效液相串联二级质谱分析方法初步得到胞外分泌蛋白种类的结果后，再利用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)鉴定细胞内神经白细胞素的mRNA表达。在确定该物质在蛋白质和核酸水平上均有表达后，分别在诱导分化的神经元培养环境中外源添加与拮抗该活性物质后，通过免疫细胞化学荧光染色分析法分析神经元的生长状况。在神经元培养物中单独添加神经白细胞素可以使得其存活率达到60%，显著高于未添加的对照组。由于神经白细胞素在胞外呈单体结构并具有保护神经元、促进轴突生长及抗凋亡等作用，该物质主要可作为外源添加剂用于神经系统修复或神经干细胞移植治疗神经退行性疾病等过程中。本发明首先提供了一种产生神经白细胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培养睾丸支持细胞，从而分泌产生神经白细胞素。作为本发明的优选方式，先将睾丸支持细胞在含血清的培养基中培养，使其良好地贴壁，然后再去除血清后(可通过采用无血清培养基洗涤来去除血清)，使用无血清的培养基培养。培养的时间通常在2-10天(较佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天)，从而获得的培养物的上清中存在有神经白细胞素。培养基中睾丸支持细胞的密度决定了其是否可以实现良好的贴壁，因此，本发明人优化了接种细胞的密度，较佳地，培养基中睾丸支持细胞的密度是I X IO4 I X IO6细胞/ml ;更佳地，培养基中睾丸支持细胞的密度是2X IO4 8X IO5细胞/ml ;更佳地为4X IO4 6X IO5 细胞/ml。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:从睾丸支持细胞培养物中分离分泌产生神经白细胞素。神经白细胞素作为一种蛋白，可以采用本领域常规的或公知的许多技术来将之分离。例如但不限于:硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、UltrogelAcA34凝胶过滤三步法纯化；或采 用N1-1DA亲和层析一步法纯化。细胞培养时采用的基础培养基是商业化的培养基，其中的成分可确保睾丸支持细胞良好地生长。例如，所述的基础培养基是DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基，该培养基为已完全商业化的，例如是购自Gibco公司的产品。本发明的方法产生的神经白细胞素是产生自细胞的，因此其是一种天然的蛋白，保留了其原有的天然活性。促进神经干细胞的分化基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种促进神经元轴突生长的方法，所述方法包括:(a)培养睾丸支持细胞(作为饲养(层)细胞)，其分泌产生神经白细胞素；(b)在(a)的细胞培养体系中加入神经干细胞；使神经干细胞与睾丸支持细胞混合，或使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换；从而神经干细胞分化为神经元，所述的神经元轴突生长能力增强且轴突上突触数目增加。由于促进神经干细胞的活性物质是神经白细胞素，其可被分泌表达于培养基中，因此所述的神经干细胞与睾丸支持细胞之间可以隔离培养，两者之间通过设置渗透膜来实现物质的交换，这种培养方式对于后续两种细胞的分离是非常有利的。所述的渗透膜具有合适的微孔，从而使得两种细胞不会穿透而它们所分泌产生的分子能够穿透。例如，所述的渗透膜是孔径约0.4 的膜。本发明首次揭示神经白细胞素(neuroleukin)是支持细胞分泌的促进轴突生长的活性物质之一。在本发明的具体实施例中，为了验证支持细胞分泌的促进轴突生长的活性物质，通过总RNA提取和逆转录PCR验证了支持细胞表达神经白细胞素(NLK)的mRNA，并通过超高效液相串联二级质谱验证NLK存在于支持细胞上清液中。在支持细胞饲养层中外源添加抗神经白细胞素抗体后，培养到第7天时神经元轴突长度减少到了 108 ym，与外源添加NLK的支持细胞直接共培养条件达到的176 ii m相比较要少得多，所以NLK对促进轴突生长和提高神经元存活率有很大的贡献，是支持细胞分泌的一种重要活性物质。因此，分化自皮层神经干细胞的神经元的轴突生长和神经元存活率的提高都能够由支持细胞所调节，并且发现由支持细胞分泌的神经白细胞素(neuroleukin)起到了重要作用。这不仅能够提供大量的可供移植治疗用的神经元来源，还能强化神经元之间的相互作用，从而提高移植的效率。本发明的揭示为支持细胞与神经干细胞共移植治疗神经退行性疾病的方法奠定了理论基础。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、支持细胞的体外分离、传代和鉴定1.睾丸组织支持细胞(SCs)的体外分离

支持细胞分离主要参照Welsh和Wiebe的方法(Welsh M.J, Wiebe J.P.Sertoli细胞 from immature rats:1n vitro stimulation of steroid metabolism by FSH[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 1976,69 (4):936-941),力口以改进并在无菌条件下进行，描述如下:首先将10-15天ICR雄鼠(中国科学院实验动物部，上海)拉颈处死，分离雄性ICR小鼠的双侧睾丸组织，在解剖镜下操作剥去脂肪组织与组织白膜，然后将生精小管剪碎成Imm3的小块。用质量体积比为0.2% I型胶原酶和0.2% (w/v)胰蛋白酶等体积混合在36.5°C恒温水浴锅内消化30min，之后吹打成细胞悬液，经过200目细胞筛过滤后静置3min，弃上清液。用含10%% (v/v)FCS的DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基(GIBC0，美国；除非另外说明，该培养基中含有葡萄糖4.5g/L)重悬细胞，原代培养以5X IO5细胞/ml的高细胞密度接种于培养瓶内，在37°C，5% (v/v)CO2的饱和湿度环境下培养。同时，进行差速贴壁lOmin，以除去培养液中的杂细胞，然后更换培养液继续培养并作PO代细胞，之后传代细胞称为Pl，P2......代。2.支持细胞的传代观察培养48h的细胞形态，在细胞生长接近80%覆盖瓶底时进行胰酶消化传代培养。首先将细胞培养液吸取弃掉，用0.1M PBS溶液清洗2遍，加入0.2% (w/v)的胰蛋白酶液进行消化3min，当观察细胞基本悬浮后，立即补充2ml培养液(含10% (v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养基)进行缓慢吹打瓶底，将全部细胞吹起后收集进行800rpm离心3min。去上清液后再次补加培养液进行细胞重悬，计数后在CO2恒温培养箱中进行传代培养。
3.支持细胞的鉴定方法(1)苏木精伊红(Hematoxylin-Eosine, HE)染色支持细胞鉴定采用HE染色方法。即将细胞放入二甲苯液中10min、95% (v/v)乙醇溶液2min、80% (v/v)乙醇2min、75% (v/v)乙醇2min，然后在完全脱水后用苏木精染液染色lOmin，流水稍微清洗3s洗掉表面残留大量的苏木精染色液。将细胞放入I % (v/v)盐酸乙醇3s后再次用清水漂洗30s,然后在伊红染液中浸泡3min,依次浸入75% (v/v) >80%(v/v) >95% (v/v)和无水乙醇中浸泡各5min,再在二甲苯中脱水5min后用中性树胶封固，光学显微镜下进行观察。(2)扫描电子显微镜观察将玻片上游离细胞用0.1M PBS清洗I遍，用0.1M PBS配制的2.5% (w/v)戊二醒固定液在4°C条件下预固定。1% (w/v)锇酸在4°C条件下固定Ih,之后用0.1MPBS漂洗3次，5min/次。后采用梯度乙醇(按照体积分数分别为:30%、50%、70%、85%和100% )进行逐步脱水，在4°C条件下晾干。喷镀金后在扫描电子显微镜下观察。4.细胞生长参数分析活细胞计数:胎盘蓝染色液染色鉴定细胞活性，同时由血球计数板计数。细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)X 100% ；支持细胞纯度=支持细胞数/总细胞数X100%。生长曲线分析:将传代至P2代的细胞以3种不同细胞密度(0.5X IO5细胞/ml，2 X IO5细胞/ml，5 X IO5细胞/ml)接种于25mm2培养瓶内，每隔6h取每组3孔的细胞分别计数。经数据统计后通过EXCEL软件作细胞生长曲线。5.统计分析方法数据用平均数(X—)表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析的多重比较。6.结果睾丸支持细胞显著结构特征是双核仁结构。分离自小鼠睾丸组织的支持细胞在体外培养后分别通过苏木精伊红染色、DAPI核荧光染色和电子显微镜进行观察鉴定。苏木精伊红染色后，在光学显微镜下可见分离的支持细胞胞体为宽大的柱状及典型的双核仁结构，细胞核呈卵圆或不规则形，胞质内有可见透明的小空泡结构(图1A);同时，通过DAPI进行细胞核荧光核染后，同样能够清晰看到双核仁典型结构(图1B)。通过扫描电子显微镜观察支持细胞的外形结构，发现在支持细胞表面有大量粗大的突触(图1C)，根据细胞形态学分析，该大量的突触可能与支持细胞吞噬细胞残片和贴壁生长等生理作用有关。在新制备的支持细胞悬液经胎盘蓝染色计活细胞数后得到的细胞存活率达93%以上，每只睾丸组织大约可获得支持细胞I X IO6-1 X IO7个。培养24小时后，小鼠睾丸支持细胞贴壁生长体积不断增大呈不规则片状结构，同时呈现梭状胞体。综上，成功分离和鉴定了小鼠睾丸支持细胞。通过HE染色和DAPI核荧光染色进行观察，表明分离的细胞具有典型双核结构，即鉴定为支持细胞。实施例2、胚胎神经干细胞的体外分离、培养及鉴定1.胚胎皮层神经干细胞(NSCs)分离方法孕龄14天ICR孕鼠1只，在其腹部用75% (v/v)乙醇喷洒消毒，剪开腹部皮肤肌肉后暴露其腹腔及子宫，迅速分离出胎鼠，放入盛有加入I % (w/v)青霉素和链霉素的0.1MPBS溶液中，移入超净台，将胎鼠在新皿内清洗后再转入另一皿内浸泡5min。按以下操作在无菌条件下完成取出胎鼠皮层脑组织的一系列操作:a.从脑前额边缘揭脑膜；b.挑取一侧脑皮层放置在装有0.1M PBS溶液中；c.用镊子撕碎组织；d.加入等量胰蛋白酶液在37 °C条件下消化30min。准备15ml无菌离心管,加4ml洗液与I滴FCS准备终止消化，吸出皿内组织后在800rpm条件下离心3min。上清做废液处理后再加7ml洗液清洗(期间准备血球计数板计数)，离心完后按分离细胞数量加入培养液重悬细胞，并计数。以1父105细胞/1111密度接种细胞在371:，5% (v/v)CO2恒温培养箱中`培养。2.皮层神经干细胞的传代培养观察皮层神经干细胞生长状态良好，神经球边缘清晰且悬浮生长。吸出细胞悬液以800rpm离心3min。弃上清后，以Iml 0.2% (w/v)胰蛋白酶液吸出细胞后置于37°C CO2恒温培养箱中孵育消化3min。吸出细胞后转移至终止液内轻柔吹打后继续以800rpm离心3min。再次弃上清后以2ml培养液重悬细胞并计数。3.免疫细胞化学荧光染色方法将神经干细胞(NSCs)以合适的密度接种在涂有多聚赖氨酸的12孔板内培养，观察细胞贴壁生长状态良好，呈圆形或有1-2个触角伸出。按以下步骤进行免疫细胞化学荧光染色操作:在每孔中补加适量0.1M PBS清洗，摇床上摇匀IOmin ;吸取PBS弃掉，补加4%多聚甲醛在4°C条件下固定Ih ;吸取多聚甲醛溶液补加PBS适量清洗IOmin ;补加500iUl%的PBST常温孵育，摇匀30min;0.0lMPBS清洗后用含5% (v/v)山羊血清(BIOffEST)溶液封闭30min。用稀释液稀释一抗鼠源Nestin (I: 200, SANTA CRUZ)在4°C条件下孵育细胞过夜，回收一抗后用0.1M PBS清洗，同样由0.3% (v/v) PBST配制含3%(v/v)山羊血清溶液避光按1: 100稀释羊抗鼠荧光二抗(Jackson，美国)，每孔加200 ill在4°C条件下孵育lh。用PBS清洗后避光保存，同时也可以在荧光显微镜下进行观察。对于成熟神经元和星形胶质细胞的免疫荧光染色步骤基本同上，不同之处在于用鼠源一抗PTujIIId: 2000，Sigma)孵育成熟神经元细胞，用鼠源一抗GFAP (I: 1000，Sigma)孵育星形胶质细胞。4.统计分析方法数据用平均数(x")表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析的多重比较。5.结果(I)皮层神经干细胞的分离及鉴定如上方法对ICR孕鼠进行皮层神经干细胞的分离。体外培养后发现单纯机械吹打和加0.2%胰蛋白酶消化得到的单细胞悬液含有较多的未完全消化的组织块，如经培养后会聚集周围单细胞形成聚集体(Aggregation),而并非由单细胞增殖形成的神经球(图2A)。由于聚集体会导致团块内部的细胞因无法取得营养物质而逐渐衰老死亡，因此聚集体越少越好。如果利用较高浓度的胰酶液进行消化细胞或者时间延长后得到的单细胞进行培养则容易在培养3天后出现成片的絮状物，可能是细胞因消化程度过度而死亡引起的。实验结果表明:0.2% (w/v)胰蛋白酶消化液消化3min为最佳，传代的细胞生长状态良好，在36h可观察二分裂细胞形态，在72h后会出现多于10个细胞组成的神经球(图2B)。细胞鉴定以其生物标记物鉴定是一种高效方法之一，如Nestin是神经干细胞的特征物质之一(丁道芳，邢三丽，周鸣鸣，宋后燕.大鼠胚胎神经干细胞单克隆化及单层化培养和鉴定[J].生物化学与生物物理进展，2009，36 (I):72-76)，P TujIII是神经元细胞重要生物标记物之一 (Hill E.Jjffoehrling E.K,Prince M,Coleman M.D.Differentiatinghuman NT2/D1 neurospheres as a versatile in vitro3D model system fordevelopmental neurotoxicity testing[J].Toxicology,2008, 249:243-250), GFAP 是星形胶质细胞生物标记物之一(Sakuragawa N, ThangavelR, Mizuguchi M, Hirasawa M,Kamo 1.Expression of markers for both neuronal and glial 细胞 in human amnioticepithelial 细胞[J].Neuroscience Letters, 1996, 209:9_12)。因此，皮层神经干细胞的鉴定可以形成的神经球或分散的神经单细胞通过Nestin免疫细胞化学荧光染色来实现。取分化培养液中孵育3天后的混合细胞经NestiruGFAP和P -TujIII等特征生物标记物的免疫荧光染色分析对分化细胞中星形胶质细胞和成熟神经元细胞的鉴定。由图3可知:神经干细胞不论在单细胞形态还是处在神经球形态都会大量表达Nestin特征蛋白，并在荧光二抗的作用下显 示出绿色荧光。在分化培养基的诱导分化作用下，这些细胞失去了原先的干细胞特性不再表达Nestin，并且向神经元和星形胶质细胞方向开始分化。结果显示了干细胞的多分化潜能的特性。因此，本实施例中分离获得的细胞是神经干细胞，并可分化为神经元细胞和星形胶质细胞。(2)皮层神经干细胞的形态学观察在倒置相差显微镜下可见接种的单细胞形态圆润，折光性好，且胞体较小。培养至第3天结束时神经干细胞基本处于10个细胞克隆组成的神经球和简单较小的神经球。培养至第5天，活力不强的单细胞或神经球在个体大小的指标上会明显小于活力较强的神经球，正常的神经球会有50个以上的神经细胞组成并悬浮生长于培养基中(图4)。在原代PO传代培养后，传代周期可由原代PO的5天缩短至4天，因为随着细胞纯度提高，获得细胞的速率也随之增加。(3)皮层神经干细胞的传代培养与细胞纯度分析原代胎鼠来源的神经干细胞接种密度以三种初始密度(5X IO5细胞/ml，IX IO5细胞/ml，0.5 X IO5细胞/ml)进行接种，培养至第5天时的结果如图5。IXlO5细胞/ml的接种密度培养时，在培养第5天时，每个神经球所含神经细胞数目最高可达50个以上。如果以5 X IO5细胞/ml较高的密度接种，在第2天时培养液已经变黄，需频繁消化重悬培养，而过于频繁的操作会导致细胞生长活性下降。同时，已经形成的神经球老化速度也将增加，单个细胞的生长状况也开始下降。若以衰老的神经球进行传代培养，得到的细胞因增殖活力不佳开始逐渐死亡。因为机械吹打细胞不能保证神经球分散均匀，所以加入胰酶消化后可减少传代过程中神经球的数目。因此，以IX IO5细胞/ml的接种密度培养为较佳。通过免疫细胞化学荧光染色法将Nestin阳性的NSCs标记后计数，接着利用DAPI核荧光染色标记视野内所有的细胞，并计细胞总数，最后利用公式(神经干细胞纯度=Nestin阳性细胞数/DAPI荧光染色的细胞数X 100% )计算出神经干细胞的纯度。随着传代过程中，不断收集生长活性较强的神经球，使得细胞碎片和活性低的神经细胞所占比例越来越低，从而提高了高活性的神经干细胞的比例。在第一和第二代时神经干细胞的比例分别是36%和74%，而最终神经干细胞的比例在第3代时达到92% (图6，图7)。综上，本实施例采用机械分离法和酶消化法分离NSCs，获得的NSCs存活率为92%。刚分离得到的细胞呈圆形表面光滑无突起，体积较大，边界清楚并且折光性强。接种3天后可形成较小的神经球，培养至第5天时单个神经球能达到50个以上的单细胞，此时开始进行传代培养。传代后得到的单细胞在合适的培养条件下培养再次形成神经球的方式与形成时间及形态均与原代相似，并且在细胞表面特异性抗原蛋白Nestin检测仍然呈阳性，证明了神经干细胞在培养过程中仍然保持干细胞特性并具有很强的增殖能力。实施例3、大脑皮层神经干细胞与支持细胞共培养及活性物质鉴定1.培养液配制神经干细胞增殖培养基(液):pH为7.4的IOOml高糖DMEM: F12(l: I)基础培养基中添加终浓度为20ng/mlbFGF、20ng/ml EGF、 质量体积比分别为I % N2、I % B27、I % Gln和I %青霉素/链霉素(P/S)。消化终止液:IOml高糖DMEM: F12(l: I)基础培养基中添加I滴胎牛血清。0.3% (v/v) PBST 溶液:在97ml 0.1M PBS溶液中添加3ml TritonlOO，在40°C水浴条件下溶解3h。抗体封闭液:在0.3% PBST溶液中添加5% (v/v)的山羊血清，混匀后在室温条件下使用。抗体稀释液:在0.3% PBST溶液中添加3%的山羊血清后可用于稀释一抗和二抗。分化培养基(DifferentiationMedia, DM):在基础培养基(DMEM: F12(l: I)高糖培养基；购自Gibco)中添加1%FCS，1%B27,1% N2 和 1% Gln ；DEPC 水:在IL水中添加Iml DEPC进行搅拌过夜，第二天将DEPC水进行120°C条件下高温高压处理，可与4°C条件下保藏。支持细胞无血清条件培养基(Conditioned Medium, CM),制备如下:正常条件下，支持细胞在含10 %胎牛血清(fetal calf serum, FCS)的DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基)中培养增殖，但在无血清的DMEM: F12(l: I)的培养条件下支持细胞是不能存活的，支持细胞贴壁稀疏的区域在24h后开始变形萎缩成细长的竹叶状，贴壁稠密区域整片细胞24h后开始有卷曲脱离培养瓶的现象。同样只在神经干细胞(neural stem cells, NSCs)增殖液中的原代支持细胞也是无法存活的,但原代支持细胞可以在含0.1% “胰岛素-转铁蛋白-硒”这个物质的DMEM: F12(l: I)的培养基中进行无血清培养增殖[Yue F, Cui L, Johkura K, Ogiwara N, Sasaki K.1nduction ofmidbrain dopaminergic neurons from primate embryonic stem cells by coculturewith sertoli cells [J] Stem Cells，2006，24:1695-1706]。在本实验过程中，将分离下来的传代至第3代的支持细胞消化后重悬于含10% FCS的DMEM: F12(l: I)基础培养基中并以5X IO5细胞/ml的密度接种5ml在25cm2培养瓶中培养48小时，待支持细胞铺满瓶底80%的面积(即80%贴壁)后，吸去含血清培养基，用DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基清洗细胞3次，补加无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基孵育3天，然后再取出上清悬浊液进行离心，2000rpm离心IOmin后，去除细胞的上清液即为支持细胞条件培养基，可-20°C冷冻保存或用于分析其中的化学或生物学成分。2.支持细胞与神经干细胞直接共培养支持细胞悬于含10%胎牛血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基中，以5X IO4细胞/ml的细胞密度在12孔板中按每孔500 u I接种SCs细胞，待培养I天后95%以上细胞贴壁良好，用无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基清洗以去除血清3次；同时，将神经干细胞悬于基础培养基中，并以5 X IO4细胞/ml的细胞密度接种500 ill至饲养层上进行共培养。在第3天，第6天和第10天时取样观察样品与阳性对照样品之间的差别。阳性对照:将神经胶质细胞作为饲养层与神经干细胞共培养，共培养方法同上。3.Transwell 孔板培养Transwell渗透膜的应用能够说明支持诱导干细胞分化和促进神经元生长是因为SCs分泌的活性蛋白还是由于细胞与细胞之间相互接触导致的。用添加了质量体积比为I %谷氨酰胺(Gln)和I %P/S的DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基作为细胞共培养的培养基，将悬浮的NSCs以5X IO4细胞/ml密度接种在涂有左旋多聚赖氨酸的12孔板底部，SCs以5 X IO5细胞/ml密度接种在有0.4 ii m膜的嵌套内进行37 °C、含5 % (v/v) C02_95 %(v/v)空气的条件下培养。

4.条件培养基孵育神经干细胞将在含10%胎牛血清(FCS)的DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基中培养的支持细胞以无血清基础培养基清洗后重悬于DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基中培养，3天后收集培养液，迅速离心取上清作为支持细胞条件培养基，待用。以I X IO5细胞/ml的细胞密度将重悬于条件培养基中的神经干细胞接种5ml于25cm2培养瓶中培养，37°C，5% CO2条件下培养3天可取样观察并检测。5.分化培养基孵育神经干细胞以IX IO5细胞/ml的细胞密度将重悬于分化培养基中的神经干细胞接种5ml于25cm2培养瓶中培养。从第二天起可取样观察以及检测。6.细胞免疫荧光染色分析为了检测细胞中存在的特定蛋白的分布，皮层神经干细胞以接种密度5X IO4细胞/ml的细胞密度接种在左旋多聚赖氨酸涂布的6孔板上再37°C、含5% C02-95%空气的条件下，用无血清神经干细胞增殖培养基进行培养。在Transwell嵌套上接种SCs，然后于第2天将其放置在神经干细胞培养环境中培养，共培养系统中的培养液换成DMEM: F12(l: I)高糖培养基。经过72h的诱导培养过程后，用4%多聚甲醛在4°C条件下固定分化的神经细胞 30min后，用 0.0lM PBS (phosphate buffered saline)洗漆 5min,再用 1% (v/v)PBST孵育30min (在PBS中添加1% Triton-100)，接着PBS清洗3次，每次5min，再用含5%山羊血清的0.3%的PBST孵育30min，然后分别添加小鼠源单克隆抗体0TujIII(l: 2000稀释；Sigma-Aldrich Inc.)和兔源单克隆抗体 GFAP (1: 300 稀释；Santa Cruz BiotechnologyInc.)在4°C条件下进行孵育过夜。第2天用0.01M PBS清洗细胞5分钟后，进行荧光二抗突染(抗小鼠 IgG, 1: 200 稀释；抗兔 IgG, 1: 200 稀释，Jackson Immuno-ResearchLaboratories Inc.)在室温，避光条件下染色2h，然后用0.0lM PBS清洗细胞3次后(每次5分钟),利用DAPI (I u g/ml, 4,6-diamidino-2-pheny I indole)在避光条件下进行细胞核荧光染色。抗体的特异性利用表达相关蛋白的细胞作为阳性对照，阳性对照的细胞克隆只包含已染色的细胞。为了检测阳性细胞比率，随机选取不同分化阶段的细胞克隆进行免疫染色并在核染计数所有细胞后计算阳性率。7.细胞存活率分析在不断酶消化和传代后，皮层神经干细胞的存活率通过台盼蓝染液进行染色分析。有形态缺陷的或者不完整的细胞膜的细胞不能抵御台盼蓝染液的侵染，从而胞体变成蓝色。在光学显微镜下观察细胞并进行计数分析。8.总 RNA 提取和 RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR)反应细胞总RNA 通过 TRIzol 试剂盒(Invitrogen,http://www.1nvitrogen.com)进行提取。提取的RNA纯度通过紫外光谱成像系统(UV-spectrophotometer)进行分析。总RNA提取操作如下:(I)用1ml Trizol溶解细胞沉淀后，将细胞悬液转移至1.5ml EP管内静置5min ；(2)向EP管内 添加0.2ml氯仿，上下震荡15s，静置2min后在冷冻离心机中以12000rpm 速率离心 12min ；(3)分层后取出上清RNA水相层溶液并转移至新的1.5ml EP管内，加入等体积异丙醇沉淀核酸，混匀后于室 温下静置lOmin，之后再在冷冻离心机中以12000rpm速率离心lOmin，离心结束可见侧壁和底部有少许沉淀，去上清并以75%乙醇溶液洗涤I次；(4)洗涤后在冷冻离心机中以12000rpm速率离心5min，弃上清后室温下晾干，最后视RNA提取量加入10-15 ill无RNase的DEPC水。溶解后可在紫外分光光度计下在260nm条件下测OD值。利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara Shuzo, Japan)将5u g RNA逆转录成cDNA。每份cDNA与设计的特定引物(表I)和Taq DNA聚合酶(Takara)混合后进行RT-PCR分析，之后反应产物在含1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。反转录PCR 反应体系:25 ii I 体系中添加 5 ii I 5 X bufferUO u I dNTPU U RNase抑制液、Iu I反转录酶和8iU DEPC水。将样品混匀后，在如下设定程序下进行:42°C，90min，95°C IOmin然后4°C 5min。反应结束后反应液于_20°C保存。PCR反应:在25 ill反应体系中，有4 ill dNTP、正反引物各2 yl、LA-TaqDNA聚合酶0.5 ii 1、反转录PCR反应液3 ill和DEPC水13.5 ill。样品混匀后，在如下设定程序下进行:95V 5min、94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin、72°C 7min、4°C 5min，其中第 2 步到到第 4 步之间循环次数为30次。反应结束后直接进行核酸凝胶电泳分析。表1、基因和引物设计
权利要求
1.种产生神经白细胞素的方法，其特征在于，所述方法包括:培养睾丸支持细胞，从而分泌产生神经白细胞素。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)采用含10±1%(v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞； (2)细胞贴壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基，加入无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基，继续培养；和 (3)步骤(2)获得的细胞培养物取上清悬浊液，其中含有神经白细胞素。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，无血清DMEM: F12(l: I)高糖基础培养基中，细胞培养2-10天。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，培养基中睾丸支持细胞的密度是 I X IO4 I X IO6 细胞 /ml。
5.种促进神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)培养睾丸支持细胞，其分泌产生神经白细胞素； (b)在(a)的细胞培养体系中加入神经干细胞；使神经干细胞与睾丸支持细胞混合，或使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换；从而神经干细胞分化为神经元，所述的神经元轴突生长能力增强且轴突上突触数目增加。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于， 步骤(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基培养睾丸支持细胞；细胞贴壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基础培养基。
7.权利要求5所述的方法，其特征在于， 步骤(a)中，睾丸支持细胞的密度是I X IO4 I X IO6细胞/ml ;和/或 步骤(b)中，神经干细胞的密度是I X IO4 I X IO6细胞/ml。
8.权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，通过渗透膜隔离神经干细胞与睾丸支持细胞，使神经干细胞与睾丸支持细胞不混合但发生胞间物质交换。
9.种神经白细胞素的用途，用于制备促进神经元轴突生长的组合物。
10.权利要求9所述的用途，所述组合物还用于增加神经元上突触数目。
全文摘要
本发明涉及一种获得神经白细胞素的方法。本发明人通过将支持细胞与神经干细胞共培养的方法发现这种培养促进了分化后神经元轴突的生长以及提高了神经元的存活率，并且发现支持细胞分泌神经白细胞素与这种对神经元生长与存活的促进具有关联。因此，可应用支持细胞来产生神经白细胞素，以及应用支持细胞来促进神经元生长与存活。
文档编号C12N5/0793GK103088092SQ201110332380
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者郭美锦, 邓磊, 张嗣良, 储炬, 庄英萍 申请人:华东理工大学