专利名称：基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本项发明属医学诊断技术领域。
背景技术：
原发性肝癌(下称肝癌)是常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。近年来肝癌的治疗手段有了长足的进步，但是5年生存率仍不理想。据国内大样本多中心临床资料统计显示，住院肝癌患者的5年生存率只有32. 5%，晚期肝癌I年生存率仅14. 7%，3年生存率为O. 3%，5年生存率为0，而早期肝癌患者及时治疗后，1、3、5年生存率分别达到93. 5%、70. I %和59. I %。因此，尽早诊断并尽早治疗是目前改善肝癌患者预后最有效的手段，探索并建立有效的肝癌诊断新技术具有十分重要的意义。目前影像学检查是肝癌定位诊断的主要手段，血清标志物检测是肝癌定性诊断主 要的手段。影像学诊断肝癌后，还需要进一步检测肝癌血清标志物进行印证，对于像影学诊断困难的小肝癌，标志物检测是唯一的无创性诊断手段。甲胎蛋白(AFP)是目前全世界应用最广泛的肝癌血清标志物，已经用了数十年，但其敏感性(40%飞5%)、特异性(769Γ9690并不理想。因此，寻找更加敏感、更加特异的肝癌诊断新方法一直是各国学者的研究热点。核酸适配子(aptamer)是一种生物祀分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核苷酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核苷酸，以洗脱的寡核苷酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-分离-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，长度及两端序列与文库相符的单链寡核苷酸序列即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点①高特异性和高亲和力核酸适配子能够分辨出靶分子结构上的细微差别，亲和力可强于天然配体；②靶标广泛从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶标；③稳定性好核酸适配子可长期保存，人工合成而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用优势核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。Golden等用核酸适配子检测碱性成纤维生长因子(bFGF)，其敏感性高于商业化ELISA试剂盒近20倍，且特异性良好。Liu等用核酸适配子纳米传感器可以快速、敏感、特异地检出循环血液中的肿瘤细胞。McCauley等研制出核酸适配子传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标志物。Hicke等用放射性核素标记黏韧素-C的核酸适配子，成功应用于人胶质母细胞瘤和乳腺癌动物模型的肿瘤显像。外周血标本具有易采集、侵入性小、易重复等优点，是目前疾病的临床诊断中应用最广泛的检材。筛选肝癌血清特异的核酸适配子，籍于其在诊断应用方面的优势，建立更为特异和敏感的以血清标本为检材的肝癌诊断方法，研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，应用于肝癌的临床诊断，对于提高肝癌的诊疗水平具有十分重要的价值。
发明内容
本发明的目的研发一种以核酸适配子为探针、血清为标本的肝癌诊断试剂盒，为肝癌的临床诊断、疗效评估和预后判断提供新方法。 本发明采用的技术方案通过SELEX技术筛选肝癌血清特异性核酸适配子，采用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度测定方法进行基于核酸适配子的血清分析，优选出诊断肝癌敏感性和特异性俱佳的核酸适配子，采用正交试验进一步优化实验条件，最终研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒。本发明的技术原理肝癌血清核酸适配子因能特异性结合肝癌血清，当其与血清标本反应时，与肝癌血清结合者明显多于非肝癌血清，而不与肝癌血清结合的游离者则明显少于非肝癌血清。将核酸适配子与血清的反应物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，因结合和游离的核酸适配子泳动速度不同，核酸染色后在凝胶上可显示出结合核酸适配子带和游离核酸适配子带。与结合核酸适配子带相比，游离核酸适配子带带型整齐，背景单纯，其强弱在一定范围内与核酸适配子量呈线性关系，因而通过目测游离适配子带的强弱可定性观察肝癌与非肝癌血清标本之间的差异，通过凝胶分析软件测定游离适配子带的灰度值可定量检测肝癌与非肝癌血清标本之间的差异，从而对肝癌作出诊断。本试剂盒的研发步骤和主要结果如下。a.收集受试者的血清标本收集诊断明确的肝癌、肝硬化、乙型肝炎及正常人的外周血标本并分离血清。随机选取1(Γ20例肝癌血清标本等量混合制备肝癌混合血清，同法制备正常混合血清。b.筛选肝癌血清核酸适配子设计并合成随机单链寡核酸文库[5' -ACCGACCGT GCT GGA CTC T(MO)ACT ATG AGC GAG CCT GGC G-3']及其配套的引物(上游引物5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3';下游引物5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3')；将文库与步骤a制备的正常混合血清孵育，分离纯化不与血清结合的游离核酸并进行不对称PCR扩增，制备出新文库用于下一轮筛选；将第3轮筛选后制备的文库与步骤a制备的肝癌混合血清孵育，分离纯化与血清结合的核酸并进行不对称PCR扩增，制备出新文库用于一下轮筛选；以第9轮筛选后制备的文库为模板进行对称PCR扩增，将扩增产物送生物工程公司克隆、测序，分离出单个核酸适配子；应用RNA Structure 4. 6软件模拟分析各核酸适配子的二级结构，应用Clustal X软件对各适配子进行同源性分析和家族划分，从各家族中选出代表性核酸适配子；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度分析技术分别测定各代表性适配子与肝癌混合血清和正常混合血清的结合程度，优选出与肝癌混合血清特异性结合最佳的核酸适配子AP-HCS-9-90用于试剂盒研发，其核酸序列为Y -ACC GAC CGT GCT GGACTC TTG ACT GCT TGA GAG TGA TAG CTT CAC TCG CTA TAG TTT GGA GTA TGA GCG AGC GTTGCG-3'。
c.合成肝癌血清核酸适配子将步骤b优选出的肝癌血清核酸适配子AP-HCS-9-90送生物工程公司合成，用结合缓冲液配制成核酸适配子溶液。d.确定核酸适配子的合适用量将步骤c配制的核酸适配子溶液配成最低量为2pmol的等差梯度溶液，上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集紫外滤光图像并使用凝胶分析软件测定核酸适配子带的灰度，以灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子的合适用量。e.确定血清的合适用量以步骤d确定的核酸适配子合适用量分别与最低量为2μ1的等差梯度体积的肝癌混合血清混合孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，并采集紫外滤光图像。凝胶图像上可见结合核酸适配子带和游离核酸适配子带，使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度，以灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为血清的合适用量。f.优化核酸适配子和血清用量以步骤d确定的核酸适配子合适用量和步骤e确定的血清合适用量为中心，上下各增加一个单位，设计两因素3水平正交实验表。根据正交表，每种实验条件同步进行核酸适配子与肝癌混合血清和正常混合血清混合孵育，然后进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，并采集紫外滤光图像，使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度，计算每种实验条件下正常混合血清与肝癌混合血清的游离核酸适配子带灰度比值。重复实验3次，汇总数据进行统计分析，确定核酸适配子和血清的优化用量。g.标本检测及灰度测定以步骤f确定的核酸适配子和血清的优化用量为条件，将核酸适配子分别与肝癌、肝硬化、乙型肝炎和正常人的血清标本混匀后孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集紫外滤光图像。用凝胶分析软件打开所采集的图像，以约23. OmmXll. 5mm的矩形框选各标本的游离核酸适配子带，获取所框条带的灰度(INT)、平均灰度(INT/mm2)及其标准差、平均背景(INT/mm2)，并计算出变异系数(标准差/平均灰度)、平均净灰度(平均灰度一平均背景)、平均信噪比(平均灰度/平均背景)。冻存核酸适配子游离带几乎消失的肝癌血清标本和核酸适配子游离带浓密且带型整齐的非肝癌血清标本，用作阳性对照血清和阴性对照血清，供装配试剂盒时所用。h.诊断价值分析将步骤g测定和计算的各标本的灰度相关指标(灰度、平均灰度、标准差、平均背景、变异系数、平均净灰度、平均信噪比)进行多因素二值Logistic逐步回归分析，建立Logistic回归方程，求得各标本的组别概率预测值。以概率预测值为指标进行受试者工作特征(ROC)曲线分析，观察曲线下面积(AUC)的大小并确定最佳诊断界值，以最佳诊断界值计算核酸适配子诊断肝癌的敏感度、特异度、准确度、预测值和似然比。共检测219例标本，其中肝癌106例，非肝癌113例(肝硬化35例，乙型肝炎43例，正常人35例)。根据检测结果建立的Logistic回归方程为Logit (P)= 5. 001 — I. 880 X平均灰度一 11. 286X变异系数十7. 161X平均信噪比，据方程换算得出的组别概率预测值的AUC达O. 939 (
图1)，以彡O. 5为诊断界值，诊断肝癌的敏感度为84. 9%、特异度为85. 8%、准确度为85. 4%、阳性预测值为85. 8%、阴性预测值为84. 9%、阳性似然比为5. 69、阴性似然比为O. 17，显示出良好的诊断效果。若选用不同的诊断界值(表1)，可满足不同的诊断需求。例如，某标本的P值为O. 891，> O. 5，诊断为肝癌，根据表1，当P彡O. 884，特异度为100%,即误诊率为O，故该标本诊断为肝癌理论上100%可靠。又如，某标本的P值为O. 157，< O. 5，诊断为非肝癌，根据表1，当P < 0. 201，肝癌漏诊率为5. 7%，故该标本诊断为非肝癌理论上可靠性达94. 3%以上。
表I不同诊断界值时肝癌血清核酸适配子对肝癌的诊断价值
权利要求
1.一种基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，其特征在于试剂盒由下列独立包装的组分组成 (1)肝癌核酸适配子溶液； (2)聚丙烯酰胺凝胶母液； (3)过硫酸铵； (4)四甲基二乙胺(TEMED)； (5)50%甘油溶液I ; (6)50%甘油溶液II ； (7)1.25M氯化钠溶液； (8)GelRed染料溶液； (9)阳性对照血清； (10)阴性对照血清； 所述的50%甘油溶液I用蒸馏水配制而成，50%甘油溶液II用结合缓冲液配制而成。
2.根据权利要求I所述的肝癌诊断试剂盒，其特征在于所述的肝癌核酸适配子序列为51 -ACC GAC CGT GCT GGA CTC TTG ACT GCT TGA GAG TGA TAG CTT CAC TCG CTA TAGTTT GGA GTA TGA GCG AGC GTT GCG-3'。
全文摘要
一种基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，由下列独立包装的组分组成肝癌核酸适配子溶液；聚丙烯酰胺凝胶母液；过硫酸铵；四甲基二乙胺；50%甘油溶液I；50%甘油溶液II；1.25M氯化钠溶液；GelRed染料溶液；阳性对照血清；阴性对照血清。本发明的试剂盒具有如下特点(1)诊断价值大，敏感度、特异度和准确度达到85%左右；(2)简便实用，只需常规的垂直电泳及凝胶图像分析系统即可完成；(3)成本低廉，附加值高。肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，将本试剂盒投入临床应用，不但用量大，而且能有效提高肝癌的诊断水平，产生良好的经济效益和社会效益，应用前景良好。
文档编号C12Q1/68GK102732606SQ201210045269
公开日2012年10月17日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者吕农华, 张吉翔, 张焜和, 徐国峰, 李璇, 王婷, 陈文学, 魏淑琴 申请人:南昌大学