一种检测dna甲基转移酶基因的方法

专利名称：一种检测dna甲基转移酶基因的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及ー种检测技术及其应用，用于检测植物中存在哪些DNA甲基转移酶家族基因成员，以及它们在不同组织、发育阶段的表达情況。
背景技术：
生物体的各种生命活动，都受到遗传和表观遗传的调控。遗 传是指经由基因的传递，使后代获得亲代的特征；表观遗传指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变(Russo, V. E. A. , Martienssen, R. A. , Riggs, A. D. , 1996Epigenetic mechanismsof gene regulation. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY.)。 这些调控在各种水平、通过不同的途径和网络互作，使生物体維持正常的生理状态如染色体组稳定性，染色体的完整性，染色质组蛋白的こ酰化、甲基化、泛素化等，基因组DNA的甲基化，基因的表达与沉默，转座子的激活与失活等(Henikoff S, Matzke MA. TrendsGenet. 1997Aug ； 13 (8) :293-5. Exploring ana explaining epigenetic effects)。基因表达调控是ー种重要的表观遗传调控，它影响着生物体的生长发育、组织分化等重要生理过程。它在多个层次、受着多种因素调控如基因所在染色体区段的状态，当基因处于常染色质区域，则它可能有转录活性；如果基因处于异染色质区，由于它周围的染色质高度凝缩阻碍了转录因子与基因启动子区的结合，致使基因处于沉默状态。基因区域核小体组蛋白的修饰位置及种类，对基因的表达也起着重要的影响，组蛋白こ酰化是基因转录的标志；不同位置和程度的氨基酸残基甲基化，则可能有不同的作用，如H3K4的三甲基化是基因表达的标志，而对于H3K9和H3K27，单甲基化是基因活跃的标志，ニ甲基化和三甲基化都是基因沉默的标志。对于某些基因启动子区，如果其中的胞嘧啶多数被甲基化，则基因处于沉默状态，只有当这些区域的胞嘧啶甲基化被去除后，这些基因才能够转录。胞嘧啶5’-甲基化，广泛存在于大多数的生物基因组DNA中，从低等的单细胞生物如裂殖酵母、低等多细胞动物线虫，到高等的各种植物、动物，都广泛存在；尽管在少数几种生物中，未发现明显的胞嘧啶甲基化，如酿酒酵母、果蝇等，据推測，这几种生物的胞嘧啶甲基化系统在进化中偶然丢失或失活了，但是，它们中仍然存在着组蛋白的甲基化。胞嘧啶甲基化状态，直接受一系列甲基转移酶、糖基化酶以及细胞分裂的共同作用。其中一类酶为甲基转移酶，它们可以将甲基加到未甲基化的胞嘧啶5’位置，产生5’-甲基胞嘧啶；这类酶中又可分为从头甲基化酶和维持性甲基化酶，前者可以将未甲基化的胞嘧啶甲基化为5’ -甲基胞嘧啶，后者需要以一条DNA单链上的mCpG为模板，将对应另一条链上未甲基化的CpG甲基化为mCpG。另ー类为糖基化酶，它们可以特异识别甲基化的胞嘧啶，并将其从D NA上切除，产生双链缺ロ，并在其它酶的共同作用下，将未甲基化的胞嘧啶连接上断裂处，从而完成主动去甲基化过程。去甲基化也可由于在有丝分裂或減数分裂后，半甲基化的双链DNA没有被維持性甲基化酶作用产生完全甲基化，从而被动产生甲基化水平降低。通过对人类胞嘧啶甲基化的研究，发现了一系列甲基转移酶，如从头甲基化酶DNMT3、维持性甲基化酶DNMTl。在一些模式生物如拟南芥中，已鉴定出具有主动去甲基化活性的两种糖基化酶——DMMETER和ROSl。对其它生物的甲基化维持系统研究，也发现了一些甲基化相关的酶，如维持性甲基转移酶metl、从头甲基转移酶DRM等。通过多种手段，可以检测出表观遗传相关基因的表达水平，如普通的RT-PCR，qRT-PCR,高通量的基因芯片技术和新一代测序技术，结合表型分析，从而发现一批有表型的表观遗传突变体，进一步阐明生命活动的另一个水平的调控机制。

发明内容
本发明的目的是提供一种组合式检测植物中甲基转移酶家族表达的方法，可以快速、方便地检测所有家族成员的存在及其表达水平，便于检测这些基因的组织/时空表达特异性，筛选表观遗传突变体。本发明涉及水稻DNA甲基转移酶家族,该家族已知成员有10个，ChromDb数据库登录名称分别为DMT701——DMT710，它们分别对胞嘧啶甲基化的建立、维持、序列特异识别
具有作用。本发明使用十二对引物，其中十对引物特异地结合甲基转移酶家族内的某一个特定成员，而不会与水稻基因组/转录组中其它任何序列发生错误结合，它们用于检测每种甲基转移酶的表达水平；二对简并引物，DMT_A识别DMT701、DMT702、DMT703、DMT704、DMT707, DMT_B 识别 DMT706、DMT708、DMT709、DMT710，它们与 DMT705 引物一起使用，可以检测DNA甲基转移酶家族所有成员的总体表达水平。本发明使用的十二对引物，是以水稻DNA甲基转移酶家族的十个成员的基因组序列和cDNA序列为模板，分别从多个成员共有的保守序列中设计总体表达检测引物，从单个成员特有的序列中设计检测单个成员存在与否及表达程度的引物，并在设计引物时将其放在基因组DNA中某个内含子的两侧，以便同时检测总RNA的反转录产物中是否有基因组DNA污染，避免由此可能造成的表达水平检测误差。本发明的引物设计方法,主要采用通用的引物设计软件Primer premier 5完成，同时以人工判读为辅助。所有引物的长度17 25bp，GC含量40 60%，退火温度57 62°C。扩增cDNA时PCR产物大小200 400bp，扩增基因组DNA或有基因组DNA污染的cDNA时，PCR产物大小300 500bp。用于检测DNA甲基转移酶总体表达水平的引物对，为检测DMT701、DMT702、DMT703、DMT704、DMT707 表达水平的 DMT_A，以及检测 DMT706、DMT708、DMT709、DMT710 表达水平的DMT_B
DMT_A
0sDMT_AF WRTGGTGGSCCTCCRTGTCARGGY0sDMT_AR =YCCffARYGKDRCYTGRTAHYBCAT
扩增cDNA时的产物大小为249bp (模板为DMT702和DMT707)或243bp (模板为DMT701，DMT703, DMT704)。
DMT_B
0sDMT_BF =MTSTffYffSTGGffATTGGAGGTGCA0sDMT_BR RATMRYYAKGTCAAARCCRCCAAA扩增cDNA时的产物大小为231bp (模板为DMT706，DMT708和DMT709)或234bp (模板为 DMT710)。DMT701的引物放在第一和第三外显子上，中间隔13Ibp和97bp的第一、ニ内含子，及26b p的第二外显子；
0sDMT701-F GGAGGACTCAGATGACCACTT
0sDMT701-R GGTAGTGACATCGAGCCTTC
无内含子时PCR产物152bp，扩增基因组DNA时产物406bp。DMT702的引物放在第四和第五外显子上，中间隔Illbp的第四内含子； 0sDMT702-F CCTGTGGTGATGATAGAGGGAA
0sDMT702-R CAAGTCTAACATTGGGCGGTA无内含子时PCR产物157bp，扩增基因组DNA时产物268bp。DMT703引物放在第四和第五外显子上，中间隔183bp的第四内含子；
0sDMT703-F GGCAGGTTGCTAGAGTTCTTC
0sDMT703-R TCCTCGGGTCATGTGATTG无内含子时PCR产物118bp，扩增基因组DNA时产物30Ibp。DMT704引物放在第三和第四外显子上，中间隔Illbp的第三内含子；
0sDMT704-F GGGACTGACCACTGCCACT
0sDMT704-R CACGCTTGAGATCATGCTTTT无内含子时PCR产物115bp，扩增基因组DNA时产物226bp。DMT705引物放在第一和第二外显子上，中间隔104bp的第一内含子；
0sDMT705-F GAAAGTCCTCGAGTTCTATAGCG
0sDMT705-R GTTGGCAACGTCGTTGATG无内含子时PCR产物109bp，扩增基因组DNA时产物213bpDMT706引物放在第一和第二外显子上，中间隔117bp的第一内含子；
0sDMT706-F ACAATGATAAGTTCGAGTGGGA
0sDMT706-R CAGCAACCAAAGCACCTGA无内含子时PCR产物147bp，扩增基因组DNA时产物264bp。DMT707引物放在第一和第二外显子上，中间隔122bp的第一内含子；
0sDMT707-F CATCAAGTAGTTCTAACCACCAGG
0sDMT707-R TGTTTTCAAGACAGGCTCACA无内含子时PCR产物182bp，扩增基因组DNA时产物304bp。DMT708引物放在第七和第八外显子上，中间隔36bp的第七内含子；
0sDMT708-F AGGAAGTGGAACCTTGTCTGG
0sDMT708-R CCTGCTAACTCCCCTGGTATG无内含子时PCR产物lllbp，扩增基因组DNA时产物147bpDMT709引物放在第七和第八外显子上，中间隔407bp的第七内含子；
0sDMT709-F CTTGGAAGAATGTAGGAAGTGGA
0sDMT709-R GCCATTAGGGAATATGTCCCTC无内含子时PCR产物199bp，扩增基因组DNA时产物606bp。
DMT710引物放在第二和第三外显子上，中间隔136bp的第二内含子；
0sDMT710-F CTCCAGTCATGTAAGATCACAATTT
0sDMT7IO-R CAAAAGAGCCTCCAGTATAGTATCT
无内含子时PCR产物115bp，扩增基因组DNA时产物25 Ibp。本发明中上述十对特异引物，设计时均为跨内含子设计，可用于检测mRNA中是否有基因组DNA残留污染，以免因污染影响检测结果准确性。当用上述十对引物扩增基因组DNA时，可用于检测不同的基因型中，是否有某一甲基转移酶存在；并可通过将PCR产物测序，得知不同基因型中的甲基转移酶序列变异信
肩、O 当用上述十对引物扩增cDNA时，可用于检测甲基转移酶家族的总体表达水平及每个家族成员的表达水平。本发明的实施步骤主要为取植物组织，低温研磨成细粉，用不同的方法分别提取基因组DNA (如改良CTAB法)和总RNA (如Trizol法)，对提取产物分别进行纯化，得到可用于检测的基因组DNA和总RNA样品。对于基因组DNA样品，以它们为模板，分别用十对检测甲基转移酶家族成员的引物进行PCR扩增，检测在所使用的水稻品种/基因型中，是否有这个甲基转移酶家族成员的存在。对于总RNA样品，进行反转录反应，得到cDNA，然后以cDNA为PCR模板，用在此水稻品种/基因型中存在的甲基转移酶引物扩增，如果PCR产物电泳结果显示为一 IOObp左右的条带，且其大小比用基因组DNA扩增的产物小约IOObpJBl明总RNA中没有基因组DNA污染；如果有两条带，且较大条带的分子量与用基因组DNA为模板扩增得到的条带大小完全一致，则说明在总RNA样品中有基因组DNA污染，需要用DNaseI除去污染后，方能用这样的总RNA做模板进行反转录-PCR，检测基因表达水平。通过以上检测证实没有受到基因组DNA污染的总RNA，可用作模板进行反转录，其产物cDNA用于PCR模板，使用实时荧光定量扩增法(real-time qRT_PCR)，用检测不同甲基转移酶成员的引物进行PCR扩增，定量检测各个成员的表达水平。本发明提供了一种方法，可用于快速、准确地鉴定在水稻不同基因型中，是否发生某些甲基转移酶家族成员的缺失，以及是否发生了序列变异；还可以用于检测不同组织、不同发育阶段中甲基转移酶的表达水平，与基因芯片、新一代测序等方法相比，该方法的具有快速、简单、费用低廉等优势。


图I为实施方案总体流程 图2为PCR检测结果示意，PCR模板分别为第一泳道基因组DNA，第二泳道无基因组污染的RNA反转录产物，第三泳道有基因组DNA污染的RNA反转录产物。
具体实施例方式粉碎样品取50-200mg所需品种/基因型的水稻组织,粗略称重后，放入2ml离心管中，然后放入2颗5mm直径的不锈钢珠,盖紧管盖,将离心管放入TissueLyser磨样机专用离心管架的孔中，将离心管架放入空的冰盒内，然后向冰盒内倾倒入少量液氮，使离心管在冰盒中保存5分钟，其间向冰盒中加入少量液氮补充挥发的部分，直至样品彻底冻结。将离心管架从冰盒中取出，迅速装入磨样机中，以中等強度振荡粉碎植物组织15秒X2次。将离心管架从磨样机中取出，检查离心管中的样品是否已经彻底粉碎，如果没有完全粉碎，则重复上述磨样操作，直至样品完全粉碎。 提取基因组DNA :采用改良CTAB法，从水稻组织中提取基因组DNA。将刚粉碎或粉碎后冻存于_20°C的样品离心管放于冰上的离心管架中，加入5X体积以上65°C预热的改良CTAB DNA提取液，并迅速盖紧管盖、颠倒离心管数次，以使组织样品在提取液中融化。(改良 CTAB DNA 提取缓冲液配方 A 液O. 35mol/L Sorbitol, O. lmol/L Tris-HCl pH 7.5，0. 5mmol/L EDTA，B 液0. 2mol/L Tris-HCl pH7. 5,0. 05mol/L EDTA pH 8. 0,2mol/L NaCl,2% CTAB，C 液5% N-lauroylsarcosine。A、B、C 液按 I : I : 0. 4 混合，混合前加 DNA 提取缓冲液总体积I %的PVP于B液中。)将样品置于65°C的恒温水浴摇床上，于40-50rpm振摇30min。然后取出，冷却至室温然后加入等体积的氯仿异戊醇(24 I)，轻轻上下颠倒5分钟，之后于4000rpm离心10-15分钟。吸取上层水相，加入2/3体积预冷的异丙醇，上下颠倒10分钟并置4°C冰箱内IOmin, _20°C于3000rpm离心IOmin,倒掉液体,将DNA重悬 于70%こ醇中30分钟并经常震荡，然后弃去こ醇，将风干后的DNA加100 μ I TE使其完全溶解。加入I μ I不含DNA酶的RNA酶，37°C温浴30min以除去DNA中的RNA，然后加入3 X体积的95%冷こ醇，混匀后置于-20°C 30分钟，12000rpm离心5分钟，弃去上清，加入Iml70%こ醇中漂洗，然后风干DNA 30分钟，溶于100μ1 TE中。待DNA完全溶解后可进行I %琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker估计其浓度。将DNA置於_20°C备用。提取总RNA :采用Trizol法，从水稻组织中提取总RNA。以下使用的所有耗材均经过DEPC水处理。将刚粉碎或粉碎后冻存于_70°C的样品离心管放于离心管架中，加入20倍体积的Trizol试剂,迅速颠倒离心管,使样品在Trizol中融化,然后将样品在室温放置10分钟，每隔1-2分钟，颠倒混匀样品数次，使样品被充分提取。将离心管置于小型离心机中，13000rpm离心5分钟,吸取上清转移到新的2ml离心管中,加入等体积的氯仿异戊醇(24 I)，涡旋混匀15秒后，室温静置I分钟，然后13000rpm离心5分钟，小心吸取上清液转入新离心管中，将中层及下层液体丢弃。在上清液中加入1μ I无RNase活性的DNaseI，室温放置15分钟降解可能污染的基因组DNA，然后加入3倍体积_20°C预冷的95%こ醇，-20°C沉淀30分钟，然后13000rpm在4°C离心15分钟，弃去上清，沉淀用0. 5ml 70%こ醇漂洗2分钟，13000rpm在4°C离心5分钟，弃去上清，将沉淀在空气中干燥10分钟，カロ入50 μ I DEPC水，65°C水浴助溶10分钟。将RNA置於_70°C备用。DNA、RNA质量检查。使用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳方法，检测基因组DNA及总RNA的浓度、纯度及完整性。取每种基因组DNA及总RNA样品各I μ 1，用nanodrop紫外分光光度计，分别测定它们在230nm、260nm和280nm处的光吸收度，各样品在260nm和280nm处的光吸收度比值应在I. 6 2. I之间；各基因组DNA样品在260nm处的光吸收度乘以50ng/l·! 1，即得样品DNA的浓度；各RNA样品的260nm处光吸收度，乘以40ng/l·! 1，即得总RNA的浓度。每种基因组DNA和总RNA样品各取5 μ 1，在I %琼脂糖凝胶上电泳30分钟，以λ DNA和IOObp DNA ladder为marker，完整的水稻基因组DNA大小应与λ DNA分子量大小相近；高质量的总RNA应在500bp左右有2-5条带，分别对应不同分子量大小rRNA，其中分子量最大的条带亮度约为它下面那条带亮度的二倍。根据maker条带与样品条带的亮度差异倍数，结合marker的上样量，可以估算出基因组DNA和总RNA的浓度。不同水稻品种基因组中DNA甲基转移酶的检测。已知的水稻DNA甲基转移酶家族有10个成员，但在不同的品种中，某些成员可能由于进化、突变或人工选择的原因而丢失，有必要在检测它们的表达水平之前，先确定它们是否存在。取10个0.2ml PCR管，在每管中分别加入以下样品/试剂= Iul基因组DNA样品，dNTP混合物(每种2. 5mM)2. 5u I, IOXPCR缓冲液(含有15mM MgCl2，下同)2. 5 iil，Taq DNA聚合酶0. 2 yl，各管中分别加入某种甲基转移酶的特异上下游引物(2. 5 ii M)各2. 5 ii 1，补充无核酸酶水至终体积25 yl。将PCR管放入PCR仪中，运行以下程序94°C 5分钟；94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共35个循环，72°C保温10分钟。各取5 ill PCR产物，加入I ill 6X电泳上样缓冲液，以IOObpDNA ladder为marker,在I. 5%琼脂糖凝胶中，以5V/cm电压电泳30分钟,然后在紫外凝胶成像仪上观察电泳结果，有单一 300bp以上扩增条带的PCR样品，说明此水稻基因组中有这种DNA甲基转移酶成员，否则说明这个DNA甲基转移酶成员在这个基因型中已丢失。以总RNA为模板、OligodT为引物，进行反转录，得到cDNA。取I U g总RNA(根据 不同样品浓度，约2 IOiil)置于0.2ml PCR管中，加入Iiil 0. 5 y g/的OligodT反转录引物并混匀，70°C水浴10分钟，将PCR迅速取出置于冰上2分钟，然后短暂离心，加入以下试剂10X反转录缓冲液2 u I，dNTP混合物(IOmM每种)2u 1,RNA酶抑制剂0. 5u I,M-MuLV反转录酶liil，DEPC水加至终体积20iil，37°C温育I小时，加入Iyl 50mM的EDTA、70°C处理10分钟终止反应。在体系中加入30 ill DEPC水。普通PCR检测总RNA中是否有基因组DNA污染。取I 稀释的RT-PCR产物，力口A dNTP 混合物(每种 2. 5mM) 2. 5u 1,10XPCR 缓冲液 2. 5u I, Taq DNA 聚合酶 0. 2 u I, ft一种已由基因组DNAPCR确认在此基因组中存在的甲基转移酶特异上下游引物(2. 5iiM)各
2.5 iil，补充无核酸酶水至终体积25 ill。将PCR管放入PCR仪中，运行以下程序94°C 5分钟；94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 45秒，共35个循环，72°C保温10分钟。各取5 PCR产物，加入Iu I 6X电泳上样缓冲液，以IOObp DNA ladder为marker，在I. 5%琼脂糖凝胶中，以5V/cm电压电泳30分钟，然后在紫外凝胶成像仪上观察电泳结果，如果在300bp以下有唯一的一条扩增带，而且其大小与预期cDNA扩增产物大小相符，说明总RNA中没有基因组DNA污染，可以用于检测各种DNA甲基转移酶的表达。如果在预期条带以上有第二条带出现，而且其大小与以基因组DNA为模板的扩增产物相符，说明总RNA中有基因组DNA污染，则需将此反转录产物丢弃，重新用无RNase的DNaseI处理总RNA，然后重复上述的反转录-PCR检测，直至总RNA样品中检测不到基因组DNA污染。DNA甲基转移酶家族中各个成员表达水平检测。在每个0.2ml PCR管中，分别加入I 稀释的RT-PCR产物，DNA甲基转移酶成员特异上下游引物(2. 5iiM)各IiU (同时以actin基因为阳性对照)，2X SYBR green预混液10 yl，PCR用水加至终体积20 yl，放入荧光实时定量PCR仪中，用仪器预设的程序运行，同时检测各样品的激发光。程序运行结束后，运行仪器自带的分析软件，应用△ ACt法，得到各个DNA甲基转移酶家族成员的相对表达丰度。DNA甲基转移酶家族成员总表达水平检测。方法与检测各个家族成员的表达水平相似，不同的是，分别使用引物DMT_A、DMT_B和DMT705，把它们三者的表达水平相加，即得DNA甲基转移酶家族所有成员的表达水平总和。序列表
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〈120〉一种检测DNA甲基转移酶基因的方法〈130〉
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<221>0sDMT709-F〈222〉(I)·· (23)
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cttggaagaa tgtaggaagt gga23
<210>22
<211>22
<212>DNA
〈213〉水稻(Oryza sativa japonica)
<221>0sDMT709-R〈222〉(I)·· (22)
<400>22
gccattaggg aatatgtccc tc22
<210>23
<211>25
<212>DNA
〈213〉水稻(Oryza sativa japonica)
<221>0sDMT710-F〈222〉(I)·· (25)
<400>23
ctccagtcat gtaagatcac aattt25
<210>24
<211>25<212>DNA
<213> /jCfS (Oryza sativa japonica)
<221>0sDMT710-R
<222>(1).. (25)
<400>24
caaaagagcc tccagtatag tatct2权利要求
1.一种检测DNA甲基转移酶基因的方法，其特征是主要步骤为取植物组织，低温研磨成细粉，用不同的常规方法分别提取基因组DNA和总RNA，对提取产物分别进行纯化，得到用于检测的基因组DNA和总RNA样品，对于基因组DNA样品，以它们为模板，分别用十对检测甲基转移酶家族成员的引物进行PCR扩增，检测在所使用的水稻品种/基因型中，是否有这个甲基转移酶家族成员的存在，对于总RNA样品，进行反转录反应，得到cDNA，然后以cDNA为PCR模板，用在此水稻品种/基因型中存在的甲基转移酶引物扩增，PCR产物电泳结果显示为一条带，且其大小比用基因组DNA扩增的产物小约lOObp，则总RNA中没有基因组DNA污染；有两条带，且较大条带的分子量与用基因组DNA为模板扩增得到的条带大小完全一致，则在总RNA样品中有基因组DNA污染，要用DNaseI除去污染后，才能用这样的总RNA做模板进行反转录，其产物cDNA用于PCR模板，使用实时荧光定量扩增法，用检测不同甲基转移酶成员的引物进行PCR扩增，定量检测各个成员的表达水平，使用十二对引物，其中十对引物特异地结合甲基转移酶家族内的某一个特定成员，而不会与水稻基因组/转录组中其它任何序列发生错误结合，它们用于检测每种甲基转移酶的表达水平；二对简并引物，DMT_A 识别 DMT701、DMT702、DMT703、DMT704、DMT707, DMT_B 识别 DMT706、DMT708、DMT709、DMT710，它们与DMT705引物一起使用，可以检测DNA甲基转移酶家族所有成员的总体表达水平，使用的十二对引物，是以水稻DNA甲基转移酶家族的十个成员的基因组序列和cDNA序列为模板，分别从多个成员共有的保守序列中设计总体表达检测引物，从单个成员特有的序列中设计检测单个成员存在与否及表达程度的引物，并在设计引物时将其放在基因组DNA中某个内含子的两侧，引物设计方法,主要采用通用的引物设计软件Primer premier5完成，同时以人工判读为辅助，所有引物的长度17 25bp，GC含量40 60%，退火温度57 62°C，扩增cDNA时PCR产物大小200 400bp，扩增基因组DNA或有基因组DNA污染的cDNA时，PCR产物大小300 500bp，用于检测DNA甲基转移酶总体表达水平的引物对，为检测 DMT701、DMT702、DMT703、DMT704、DMT707 表达水平的 DMT_A，以及检测 DMT706、DMT708、DMT709、DMT710 表达水平的 DMT_B DMT_A OsDMT_AF WRTGGTGGSCCTCCRTGTCARGGYOsDMT_AR =YCCffARYGKDRCYTGRTAHYBCAT 扩增cDNA时的产物大小为249bp或243bp，模板为DMT702和DMT707或为 DMT701, DMT703, DMT704 ；DMT_B OsDMT_BF =MTSTffYffSTGGffATTGGAGGTGCAOsDMT_BR RATMRYYAKGTCAAARCCRCCAAA 扩增cDNA时的产物大小为23Ibp或234bp,模板为DMT706, DMT708和DMT709或为DMT710 ； DMT701的引物放在第一和第三外显子上，中间隔131bp和97bp的第一、二内含子，及26bp的第二外显子；0sDMT701-F GGAGGACTCAGATGACCACTT0sDMT701-R GGTAGTGACATCGAGCCTTC 无内含子时PCR产物152bp，扩增基因组DNA时产物406bp，DMT702的引物放在第四和第五外显子上，中间隔Illbp的第四内含子；0sDMT702-F CCTGTGGTGATGATAGAGGGAA0sDMT702-R CAAGTCTAACATTGGGCGGTA无内含子时PCR产物157bp，扩增基因组DNA时产物268bp，DMT703引物放在第四和第五外显子上，中间隔183bp的第四内含子；0sDMT703-F GGCAGGTTGCTAGAGTTCTTC 0sDMT703-R TCCTCGGGTCATGTGATTG无内含子时PCR产物118bp，扩增基因组DNA时产物301bp，DMT704引物放在第三和第四外显子上，中间隔Illbp的第三内含子；0sDMT704-F GGGACTGACCACTGCCACT0sDMT704-R CACGCTTGAGATCATGCTTTT无内含子时PCR产物115bp，扩增基因组DNA时产物226bp，DMT705引物放在第一和第二外显子上，中间隔104bp的第一内含子；0sDMT705-F GAAAGTCCTCGAGTTCTATAGCG0sDMT705-R GTTGGCAACGTCGTTGATG无内含子时PCR产物109bp，扩增基因组DNA时产物213bp，DMT706引物放在第一和第二外显子上，中间隔117bp的第二内含子；0sDMT706-F ACAATGATAAGTTCGAGTGGGA0sDMT706-R CAGCAACCAAAGCACCTGA无内含子时PCR产物147bp，扩增基因组DNA时产物264bp，DMT707引物放在第一和第二外显子上，中间隔122bp的第一内含子；0sDMT707-F CATCAAGTAGTTCTAACCACCAGG0sDMT707-R TGTTTTCAAGACAGGCTCACA无内含子时PCR产物182bp，扩增基因组DNA时产物304bp。DMT708引物放在第七和第八外显子上，中间隔36bp的第七内含子；0sDMT708-F AGGAAGTGGAACCTTGTCTGG 0sDMT708-R CCTGCTAACTCCCCTGGTATG无内含子时PCR产物lllbp，扩增基因组DNA时产物147bpDMT709引物放在第七和第八外显子上，中间隔407bp的第七内含子；0sDMT709-F CTTGGAAGAATGTAGGAAGTGGA0sDMT709-R GCCATTAGGGAATATGTCCCTC无内含子时PCR产物199bp，扩增基因组DNA时产物606bp。DMT710引物放在第二和第三外显子上，中间隔136bp的第二内含子；0sDMT710-F CTCCAGTCATGTAAGATCACAATTTOsDMT7IO-R CAAAAGAGCCTCCAGTATAGTATCT无内含子时PCR产物115bp，扩增基因组DNA时产物25 Ibp。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种组合式检测DNA甲基转移酶家族表达的方法。DNA甲基转移酶家族中的各个成员，在不同组织和发育阶段中具有不同的活性和特异性，它们共同作用直接影响着DNA的甲基化状态。所述DNA甲基转移酶指DMT701，DMT702，DMT703，DMT704，DMT705，DMT706，DMT707，DMT708，DMT709，DMT710。本发明通过使用一系列PCR引物，以mRNA反转录产物cDNA为模板，通过特异地结合到模板的保守区或可变区，可以同时检测植物不同组织、不同发育阶段的DNA甲基转移酶家族总表达水平，并可以区分单个家族成员的表达水平。
文档编号C12Q1/48GK102703580SQ20121005009
公开日2012年10月3日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者刘宝, 庞劲松, 李宁 申请人:东北师范大学