专利名称：一种多重竞争性pcr定量基因表达谱分析方法
技术领域：
本发明涉及生物技术基因表达分析领域，尤其涉及一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法。
背景技术：
目前已发现有些基因的表达差异与疾病发生、药物反应相关，这些基因能够作为疾病的遗传标志。研究特定组织中基因的表达情况，发现新的疾病遗传标志基因，是现代医学研究的热点。人类复杂性状疾病是当前研究的热点与难点。糖尿病、癌症、老年性性痴呆和精神分裂症等疾病的遗传机理和相关效应基因仍未最终揭晓。通过全基因组转录图谱来查找候选基因是复杂性疾病研究的重要步骤，也对进一步理解人类复杂性疾病和分子药物的研发提供了帮助。目前，已有研究将转录图谱用于癌症诊断和疗效比较、肿瘤分类，预测肿瘤对化学治疗药剂的疗效等临床分析中。随着分子生物学技术的发展，基因表达谱分析手段也迅速发展起来。cDNA芯片能成功的从各种反应条件下筛选出差异表达的基因，且被作为候选基因进行假设验证和功能分析。芯片技术优势是一次分析几千至上万基因，可用于大规模的基因表达筛选，但同时存在定量准确度低的缺陷，极高的实验成本亦限制其广泛推广。基因表达分析中最常用的技术就是实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)，它具有Northern blot等技术所不具有的定量分析能力，可对芯片结果进行进一步确认。其具有稳定性好、灵敏度高和7个数量级的定量线性等优势，但同时它也存在单管检测通量小、样本处理费时费力成本高等缺点。 虽然有研究表明哺乳动物细胞约含3万个基因，平均每个细胞约有1万个基因参加表达，但是通常的状况是，10到50个基因表达与一种特定的疾病相关，10到50个基因和一个特定的通路和药物反应相关。此外，考虑到多基因性状(Multigenic traits)受到基因-环境相互作用影响。因此一种可针对10种或数十种基因表达鉴定的分析方法亟待开发，可对不同环境下大量的样本进行多个基因分析。贝克曼GeXP多重基因表达分析系统作为芯片和 PCR技术的换代产品，将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合，采用通用引物和特异引物相结合的方法，实现多重基因定量检测，其优势在于可在同一样本中对多个基因进行检测， 大大提高了反应效率，节约临床资源和成本。但扩增过程中位点间扩增效率易相互影响，一个基因的表达会影响其他基因，而且这种终点法检测，不能完全反应初始模板的浓度。美国 Sequenom公司基于竞争性PCR结合质谱分离技术进行mRNA定量分析。竞争性PCR最早是 wang等人于1989年发明用于目标基因表达量的确定，其理论基础是人工合成一段内对照序列，其与目标基因序列相似，但存在长度上的差异，两者用共同引物进行扩增，具备类似的扩增效率，因此两种扩增产物量比值可以真实反映掺入内对照与目标基因mRNA量的比， 这样根据内对照掺入量可以很好评估目标基因mRNA的量。这种竞争PCR技术运用到基因表达分析中降低了位点扩增效率差异以及实验操作和检测环境等外界环境的影响，从而降低实验结果误差，提高数据准确性。但质谱平台中产物质谱峰比较低，检测准确性需控制背景信号，且保证合适的样本与内对照用量比，同时整个过程中反应步骤比较多，显得较为繁琐。
发明内容
本发明的目标是要克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、定量通量较高、样本需要量低、检测灵敏性高的多基因表达分析方法。该方法是基于竞争性PCR原理，结合荧光通用引物和多重嵌合特异引物使用，实现多重PCR扩增以及包括毛细管电泳在内的长度差异片段分离，对多个目标基因及一个或以上的参照基因进行同时定量，并以参照基因校正获取每个目标基因的相对表达量。本发明的技术方案之一是提供一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法，包括以下步骤(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物组成所述通用荧光引物长度范围为10 25bp,5'端用荧光标记，且对待测基因组无特异性匹配；所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为32 46bp，3’端为15 25bp的特异引物序列段，5’端为所述通用引物序列； 所述参照引物针对待测基因组的非待测基因设计，且与待测基因无特异性匹配；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；(2)定量合成内对照DNA片段针对待测基因和参照基因的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测基因和参照基因的扩增产物片段相比插入或缺失至少:3bp的DNA片段；(3)多重竞争性PCR的反应过程a)用oligo (dT)引物逆转录合成所述待测基因和参照基因的cDNA ；b)将所述cDNA与所述的定量内对照片段混合，加入所述的通用荧光引物、嵌合特异引物和参照引物进行多重竞争性荧光PCR扩增；使上下游的嵌合特异引物将通用引物序列加到各基因扩增片段两端；并使用高浓度的荧光通用引物完成PCR反应过程；c)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测基因与参照基因和内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；(4)数据分析计算待测基因扩增产物( 和内对照扩增产物(I)的荧光峰高或峰面积之比(S/I)；计算参照基因扩增产物( 和内对照扩增产物(I)的荧光峰高或峰面积之比(S/I)；将待测基因的比值(S/I)除以参照基因的比值(S/I)即可获得样本目标基因的相对表达量。所述分析方法的优选方案之一为，所述通用荧光引物长度范围为18 20bp。所述分析方法的优选方案之二为，所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为 38 40bp。所述分析方法的优选方案之三为，多重PCR引物对应的不同扩增产物片段的长度差异为8 50bp。所述分析方法的优选方案之四为，所述嵌合特异引物和所述参照引物的3’端的特异引物序列段长度为18 20bp。所述分析方法的优选方案之五为，所述的多重竞争性PCR引物由一到四对不同荧光标记的通用荧光引物、一到二十五对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和一到三对针对相同或不同基因的参照引物组成。优选地，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一到五对针对不同待测基因的嵌合特异引物和一对参照引物组成。极端地，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一对嵌合特异引物和一参照引物组成。所述分析方法的优选方案之六为，所述的荧光通用引物的3’端为两个碱基的固定组合，如ct、ag、tc、gc、gt等等，在同一多重竞争性PCR的反应中保持一致。本发明的技术方案之二是提供上述的分析方法在找寻差异基因中的应用。本发明的技术方案之三是提供一种基于上述的分析方法的试剂盒，提供通用荧光引物、嵌合特异引物、参照引物和定量的内对照DNAJP /或多重竞争性PCR的反应的试剂。本发明在总结现有技术中各种检测方法的优缺点基础上，经过自主创新研发，成功地试用于疾病相关基因研究等领域，并且有广泛的潜在临床应用市场。本发明令人惊奇地发现具有以下优点1、竞争PCR技术的运用。目标/参照基因片段与内对照基因片段间序列基本一致性，保证终扩增产物真实反应初始模板量比；内对照降低了位点扩增效率差异以及实验操作和检测环境等外界环境的影响，从而降低实验结果误差，提高数据准确性；2、荧光通用引物的使用。针对所有的检测位点，应用荧光通用引物，引物的3 ’端统一为两个碱基如ct，保证了不同位点扩增的同步性和起始效率的一致性，大大降低了 PCR 反应的复杂性，同时大大降低了实验成本；3、多个基因位点同时检测。采用的多重PCR体系可一次性对少量样本多个基因同时检测，大大缩短了实验周期，提高了实验效率。
图1为一个参照基因和三个目标基因的多重PCR的试验结果。图2为图1的多重PCR的试验的原理示意图(分析过程中涉及两组引物一组是多重上下游嵌合特异引物；另一组是荧光通用引物)。图3为实施例1中样本检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式有同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1利用本发明所述的方法对20个正常人及20个哮喘病人进行通路基因检测，选取了疾病通路中的5个目标基因IL4、IL13、IL4Ra、STAT6、FCERI α，1个参照基因GAPDH同时进行检测。实验步骤1、通用引物、嵌合特异引物的设计(1)通用引物的设计设计原则保证上下游引物的TM值≤57°C，针对人基因组特异，避免通用引物带来非特异产物，通用引物的长度为18bp，上游通用引物 5，端用Fam荧光标记。通用引物序列为上游5，-TTCGTCCGTTCCGTCTAC-3’ ；下游 5， -GTTCCGTCCATCGTTCGT-3，。(2)上下游嵌合特异引物的设计根据GenBank数据库5个目标基因和1个参照基因的cDNA序列(GAPDH)信息，设计了 6对18 20bp长的序列作为嵌合特异引物3’端特异引物序列段，要求TM值> 62 ，扩增产物的长度在120 350bp之间，相邻产物长度的差至少为8bp。之后与通用引物组合成嵌合特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基。所有的引物均经过Blast和Oligo mask软件的分析，从而减少非特异扩增和引物二聚体。表一目标基因与参照基因嵌合特异引物序列
权利要求
1.一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法，包括以下步骤(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物组成所述通用荧光引物长度范围为10 25bp，5’ 端用荧光标记，且对待测基因组无特异性匹配；所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为32 46bp，3’端为15 25bp的特异引物序列段，5’端为所述通用引物序列；所述参照引物针对待测基因组的非待测基因设计，且与待测基因无特异性匹配；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；(2)定量合成内对照DNA片段针对待测基因和参照基因的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测基因和参照基因的扩增产物片段相比插入或缺失至少:3bp的DNA片段；(3)多重竞争性PCR的反应过程a)用oligo(dT)引物逆转录合成所述待测基因和参照基因的cDNA ；b)将所述cDNA与所述的定量内对照片段混合，加入所述的通用荧光引物、嵌合特异引物和参照引物进行多重竞争性荧光PCR扩增；使上下游的嵌合特异引物将通用引物序列加到各基因扩增片段两端；并使用高浓度的荧光通用引物完成PCR反应过程；c)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测基因与参照基因和内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；(4)数据分析计算待测基因扩增产物( 和内对照扩增产物(I)的荧光峰高或峰面积之比(S/I)；计算参照基因扩增产物( 和内对照扩增产物(I)的荧光峰高或峰面积之比(S/I)；将待测基因的比值(S/I)除以参照基因的比值(S/I)即可获得样本目标基因的相对表达量。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述通用荧光引物长度范围为18 20bp。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为38 40bp。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，多重PCR引物对应的不同扩增产物片段的长度差异为8 50bp。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的3’端的特异引物序列段长度为18 20bp。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一到四对不同荧光标记的通用荧光引物、一到二十五对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和一到三对针对相同或不同基因的参照弓I物组成。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一到五对针对不同待测基因的嵌合特异引物和一对参照引物组成。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的荧光通用引物的3’端为两个碱基的固定组合。
9.权利要求1所述的分析方法在找寻差异基因中的应用。
10.一种基于权利要求1所述的分析方法的试剂盒，提供通用荧光引物、嵌合特异引物、参照引物和定量的内对照DNAJP /或多重竞争性PCR的反应的试剂。
全文摘要
本发明涉及基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测基因表达谱分析方法，包括下列步骤(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物组成；(2)定量合成内对照DNA片段；(3)多重竞争性PCR反应过程；和(4)数据分析。本发明还提供基于以上分析方法的试剂盒，适用于5～25个基因的研究特定药物反应或信号转导通路等特定基因表达谱分析，是一种准确的、中通量的、经济的基因表达分析方案。
文档编号C12Q1/68GK102534042SQ201210066050
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者肖君华, 陆炯, 陈烨, 陈轶群 申请人:上海翼和应用生物技术有限公司