专利名称：弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用，弯曲菌属中包括空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌等弯曲菌的同步分离和鉴定方法，利用选择性分离培养基对应生长的弯曲菌典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌在内的其他弯曲菌的试剂盒和使用方法。
背景技术：
弯曲菌属目前有30多个种，广泛寄生在自然界中的飞鸟和养殖的禽、畜动物中的肠道(结肠或空肠部位)，长期定殖并随排泄物污染环境和食品，其中的空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌属于已知的禽、畜动物类肉类制品明确检疫的病 原菌，同时，也是能引起食源性传播和暴发的重要病原菌之一。国内的许多实验室(包括临床实验室和公共卫生实验室)在实际工作中无法通过可选择的常规微生物分离方法和材料达到分离空肠弯曲菌等弯曲菌的预期效果，反而受制于弯曲菌微需氧的苛氧条件、标准菌株不易保存和选择性培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低以及缺少简单有效的对疑似菌落筛选方法和依赖鉴定用自动化生化反应试剂材料所需的昂贵费用，既费工又费时。本发明是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对多种复杂样品的预处理和增值，使用选择性平板的筛选、甄别包括空肠弯曲菌在内的所有弯曲菌的典型菌落，结合简易快速鉴别方法和特异性酶-底物反应组合试验在2个培养周期内鉴定空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术必须依赖自动化生化鉴定仪器或分子生物学为主的方法更具有易学、综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便(或者粪便拭子)、食品、环境水样等多种标本中包括空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌的同步分离和鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种可利用弯曲菌属所有不同种细菌的生物学特性和酶反应试验鉴定的弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决对空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选效能不够直观的技术难题。本发明针对多种不同类型标本分别使用可选择性增菌液或专一性分离平板配合简单的生长条件甄别模式、独特的革兰染色形态和细菌特异性呼吸酶-底物反应特征综合建立而成的一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对包括空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌的分离、筛选和准确鉴定的效果。本发明的技术方案为弯曲菌分离、鉴定的试剂盒及其制备方法，包括
I、选择性增菌液I (卫斯理肉汤)基础成分胰化酪蛋白胨20. Og, N, N- 二羟乙基甘氨酸缓冲液(Bicine buffer) 10. Og (sigmaB3876),氯化钠5. Og,酵母浸出物2. 5g,琼脂粉l.Og，亚硫酸铁O. 25g, Na2S2O3 O. 25g，丙酮酸钠O. 25g，蒸馏水983. 75ml。碱性高铁血红素溶液6. 25ml (每IOOml配方高铁血红素O. 32g,0. 15N氢氧化钠溶液IOOml溶解混匀后，5磅30分钟，108°C冷却备用)，10ml抗生素组合氨曲南10mg/L，两性霉素B2mg/L，万古霉素10mg/L。肉汤基础经15磅15分钟(121°C )灭菌后冷却至50°C加入高铁血红素溶液和抗生素组合液后分装225ml/瓶备用。2、选择性增菌液II :按照上述培养基分装9ml/管，备用。3、改良卡尔马里(KARMALI)琼脂平板成分活性炭4. Og，哥伦比亚琼脂基础990. 0ml，一起加热溶解经15磅15分钟(121°C)灭菌后冷却至50°C加入抗生素添加剂IOml(丙酮酸钠50. Omg，放线菌酮50. Omg，头孢哌酮16. Omg，氯化铁血红素16. Omg，万古霉素10. Omg)，调整pH至7. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。倾注无菌平板置冰箱中，备用。4、哥伦比亚血平板哥伦比亚血琼脂基础950ml :特殊蛋白胨23. Og，琼脂份10. Og,氯化钠5. Og,淀粉I. Og,加蒸馏水950ml煮沸3次 后冷却后调整pH至7. 3 (按冷却至25°C后测量值为标准)经15磅15分钟(121°C)灭菌后冷却至50°C加入50ml无菌脱纤维绵羊血，混匀后倾注无菌平板置冰箱中，备用。5、微需氧产气袋成分碳酸氢钠8. Og,活性炭3. Og,枸橼酸2. Og,铁粉7g，无水硫酸铜I. 5g，硅藻土 10g，均匀干燥脱水后置锡纸袋内，真空封口，预计产气量为2. 5-3. 5升。使用方法取剪刀在袋口 1/3处斜开一小口，加入IOml蒸馏水后之置入容量为3. 5升或7升的乐扣乐扣(L0CK-L0CK)密封盒中，加盖密封盒体后放入42°C培养。6、革兰染色液革兰染色液I液即结晶紫取结晶紫酒精饱和液(结晶紫13. 8g溶于95%酒精IOOml内)10ml，1%草酸铵水溶液(草酸铵0. 9g溶于90ml蒸馏水)90ml，混合均匀即可；革兰染色液II液即碘酒取碘化钾2. Og溶于IOml蒸馏水中，再加碘粒l.Og，充分摇动使之溶解，再加蒸馏水300ml即可。储存于棕色瓶中备用；革兰染色液III液纯酒精液；革兰染色液IV液即复红染液(碱性复红8. 16g，溶于质量百分比浓度95%酒精IOOml内，取IOml加入质量百分比浓度5%石碳酸水溶液90ml，临用时再以蒸馏水稀释10倍)或沙黄染色液(用2. 5%沙黄酒精溶液10ml，加蒸馏水90ml)。使用方法涂片用火焰固定后，加结晶紫染液I分钟，倾去染液，加碘液染液I分钟，水洗。用酒精液脱色半分钟，快速用流水冲去染液。最后加稀释复红复染半分钟，流水冲洗干净后待自然干燥后即可镜检。结果观察革兰阳性菌呈深紫色；革兰阴性菌呈淡红色。7、氧化酶试剂成分质量百分比浓度1%对-氨基-4-甲基苯胺盐酸盐水溶液。使用方法取I片3X3cm的无菌滤纸，2次对折后将中心锐角部位与待测菌落表面接触后展开滤纸片后将氧化酶试剂直接滴加于纸片上，试剂与菌落接触扩散后立即(3秒左右)呈现红色-深红色-紫红色反应者为阳性，超过10秒后出现阳性者不作为阳性结果判断；不显色者为阴性。8、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂马尿酸纸片制备方法马尿酸钠l.Og，溶于50ml蒸馏水中(2%质量百分比浓度)，经0. 22 μ m孔径滤膜加压过滤后滴加于直径6. 35mm无菌厚纸片中，烘干备用；马尿酸酶反应试剂茚三酮溶液茚三酮3. 5g，加50ml丙酮和50ml正丁醇溶解混均后分装2. 5ml于无菌棕色滴瓶中备用。快速马尿酸水解酶试验方法取生理盐水0. Iml加于清洁小试管中，并投入马尿酸盐纸片I张，再加入50μ I经f2d培养的用被测菌的新鲜菌落或菌苔调制成的> IO1Vml浓厚菌悬液，36°C水浴2h，缓缓加入马尿酸盐试剂0. 1ml，摇匀后36°C放置5分钟，呈深紫色变化者即为阳性。快速氧化酶与马尿酸水解酶试验(阳性)是判定空肠弯曲菌的唯一依据。
本发明的有益效果是根据多种不同类型的标本选择先进行预增菌或直接使用选择性分离平板的方式达到对标本中目的菌进行有效分离，通过选择性分离平板生长的“疑似”典型菌落接种于纯化、非选择性平板的传代，在细菌的2次传代周期内完成培养条件甄别试验、独特的革兰染色形态、氧化酶试验、马尿酸酶水解试验等简易、有效、特异、准确的鉴定空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌的目的，而简易有效的操作过程也极大提高了单位时间的工作效率，使专业人员更易掌握和接受，客观上能有效减少整个试验过程中人为因素造成的随机误差。
具体实施例方式首先按照技术方案内容配制试剂盒，使用者根据不同检材选择使用增菌分离步骤或直接用选择性平板的分离步骤，选择3-5个疑似菌落的使用组合鉴别试验完成甄别试验。
I、不同检材的解释、采集要求和预处理方法。I)、粪便包括人(患者和带菌者)、家禽(畜)等动物性粪便标本尽可能新鲜采集约Ig (拇指大小)，液状便采约lrnl，在lh-2h内进行接种培养。若短时间不能检测时，应使用商品化运送培养基保存，24h内送至实验室。粪便类样品一般采用直接分离法，即用棉签(拭子)挑取标本直接接种卡尔马里(KARMALI)平板后划线分离，平板置容量为3. 5升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入I个微需氧产气袋(已加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养48h观察菌落生长结果。2)、水包括饮用水、生活用水、江、河、湖水和污水等液态标本用无菌玻璃或塑料瓶采集250ml-500ml,液体清澈者可使用孔径O. 22 μ m-0. 45 μ m滤膜进行负压过滤后将滤膜剪碎后置弯曲菌选择性增菌液II中进行选择性增菌，增菌管置容量为7升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入2个微需氧产气袋(已各加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养24_48h后挑取增菌液I满环接种KARMALI平板后划线分离，平板置容量为3. 5升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入I个微需氧产气袋(已加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养48h观察菌落生长结果。3)、食品采集定型包装或非定型包装500g_1000g，对部分表面含水的样品可以先使用棉签(拭子)直接接触样品表面进行多点涂抹后直接接种KARMALI平板后划线分离，平板置容量为3. 5升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入I个微需氧产气袋(已加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养48h观察菌落生长结果；所有定型或非定型食品样品剪碎或均质后按照食品与弯曲菌选择性增菌液I 1:10比例进行混匀，增菌容器置容量为7升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入2个微需氧产气袋(已各加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养24-48h后挑取增菌液Iml转种于弯曲菌选择性增菌液II中，增菌管置容量为7升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入2个微需氧产气袋(已各加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养24-48h后挑取增菌液I满环接种KARMALI平板后划线分离，平板置容量为3. 5升的L0CK-L0CK塑料盒中，放入I个微需氧产气袋(已加入IOml蒸馏水)后盖紧密封后置42°C培养48h观察菌落生长结果。2、检查方法
I) KARMALI选择性分离平板生长的“疑似”典型菌落的判断(48h):初代分离的空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌落为无色，空肠弯曲菌落有明显的透明质样感，结肠弯曲菌落相对呈灰白色；空肠弯曲菌落为1_2_，结肠弯曲菌落为2-3_ ;总体来说湿润、较透明、小且不规则的扁平菌落符合弯曲菌疑似菌落的特征。观察并选择3-5个弯曲菌疑似菌落进行组合鉴定试验。2)哥伦比亚血平板纯化弯曲菌落特征典型的空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌经42 °C微需氧培养48h后菌落特征分别为空肠弯曲菌落或菌苔为灰白、湿润、单个菌落2mm、呈扁平不规则状；结肠弯曲菌等非空肠弯曲菌落或菌苔为白色、湿润、单个菌落3mm、呈相对凸起的不规则形状。3)组合鉴定试验程序I :培养条件甄别试验-革兰染色-氧化酶-马尿酸盐水解酶试验-报告结果。即首先挑取弯曲菌疑似菌落分别划线接种于1/2个哥伦比亚血平板后分别置36°C普通培养箱进行常规培养和42°C微需氧培养4 8h后分别观察菌落生长情况挑取普通培养箱不生长但是微需氧生长的同一样品对应生长的哥伦比亚血平板培养物依次进行革兰染色和氧化酶试验革兰染色结果为典型的革兰阴性近似“短杆菌”且“似杆非杆”的呈扭曲状或螺旋状形态；氧化酶试验结果为非常快速的阳性反应。完成培养条件甄别试验-革兰染色-氧化酶试验的菌落符合弯曲菌属的生物学典型特征；随后当马尿酸盐水解酶试验为阳性结果时应报告为空肠弯曲菌；当马尿酸盐水解酶试验为阴性结果时应报告为弯曲菌属的阳性结果。4)组合鉴定试验程序II :革兰染色-培养条件甄别试验-氧化酶-马尿酸盐水解酶试验-报告结果。即首先挑取弯曲菌疑似菌落进行革兰染色当革兰染色结果为典型的革兰阴性近似“短杆菌”且“似杆非杆”的呈扭曲状或螺旋状形态时初步判断“高度怀疑”，反之则排除弯曲菌；挑取革兰染色结果“高度怀疑”的菌落分别划线接种于1/2个哥伦比亚血平板后分别置36°C普通培养箱进行常规培养和42°C微需氧培养48h后分别观察菌落生长情况挑取普通培养箱不生长但是微需氧生长的同一样品对应生长的哥伦比亚血平板培养物进行氧化酶试验。如果氧化酶试验结果为非常快速的阳性反应可以认为已经完成革兰染色-培养条件甄别试验-氧化酶的菌落符合弯曲菌属的生物学典型特征；随后当马尿酸盐水解酶试验为阳性结果时应报告为空肠弯曲菌；当马尿酸盐水解酶试验为阴性结果时应报告为弯曲菌属的阳性结果。
权利要求
1.弯曲菌分离、鉴定的试剂盒，包括 1)、选择性增菌液I: 基础成分胰化酪蛋白胨20. Og, N，N-二羟乙基甘氨酸缓冲液10. 0g，氯化钠5. 0g，酵母浸出物2. 5g，琼脂粉l.Og，亚硫酸铁O. 25g, Na2S2O3 O. 25g，丙酮酸钠O. 25g，蒸馏水983. 75ml ； 碱性高铁血红素溶液6. 25ml ； IOml抗生素组合液氨曲南10mg/L,两性霉素B2mg/L,万古霉素10mg/L ； 上述组分混合后分装225ml/瓶备用； 2)、选择性增菌液II:选择性增菌液I分装9ml/管，备用； 3)、改良卡尔马里琼脂平板成分 活性炭4. Og, 哥伦比亚琼脂基础990. Oml, 抗生素添加剂IOml :丙酮酸钠50. Omg,放线菌酮50. Omg,头孢哌酮16. Omg,氯化铁血红素16. Omg,万古霉素10. Omg, 上述组分混合后倾注无菌平板置冰箱中，备用； 4)、哥伦比亚血平板哥伦比亚血琼脂基础950ml:蛋白胨23. 0g，琼脂粉10. 0g，氯化钠5.Og,淀粉I. Og,加蒸懼水950ml煮沸3次后加入50ml无菌脱纤维绵羊血,混勻后倾注无菌平板置冰箱中，备用； 5)、微需氧产气袋成分碳酸氢钠8.0g，活性炭3. 0g，枸橼酸2. 0g，铁粉7g，无水硫酸铜I. 5g，硅藻土 10g，均匀干燥脱水后置锡纸袋内，真空封口 ； 6)、革兰染色液革兰染色液I液结晶紫酒精饱和液IOml和1%草酸铵水溶液90ml的混合液；革兰染色液II液碘酒；革兰染色液III液纯酒精液；革兰染色液IV液即复红染液； 7)、氧化酶试剂成分质量百分比浓度1%对-氨基-4-甲基苯胺盐酸盐水溶液； 8)、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂所述的马尿酸酶反应试剂为茚三酮溶液。
2.权利要求I所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤 1、选择性增菌液I制备 基础成分胰化酪蛋白胨20. Og, N，N-二羟乙基甘氨酸缓冲液10. 0g，氯化钠5. 0g，酵母浸出物2. 5g，琼脂粉l.Og，亚硫酸铁O. 25g，Na2S2O3 0.25g，丙酮酸钠0. 25g，蒸馏水983. 75ml ； 碱性高铁血红素溶液6. 25ml :每IOOml配方高铁血红素0. 32g,0. 15N氢氧化钠溶液IOOml溶解混匀后，5磅30分钟，108°C冷却备用； IOml抗生素组合氨曲南10mg/L,两性霉素B2mg/L,万古霉素10mg/L 基础成分经121°C 15磅15分钟灭菌后冷却至50°C加入高铁血红素溶液和抗生素组合液后分装225ml/瓶备用； 2、选择性增菌液II制备选择性增菌液I分装9ml/管，备用； 3、改良卡尔马里琼脂平板制备成分活性炭4.0g，哥伦比亚琼脂基础990. 0ml，一起加热溶解经121°C 15磅15分钟灭菌后冷却至50°C加入抗生素添加剂10ml，所述的抗生素添加剂由下述组分混合而成丙酮酸钠50. Omg,放线菌酮50. Omg,头孢哌酮16. Omg,氯化铁血红素16. Omg，万古霉素10. Omg,按冷却至25°C后测量值为标准，调整pH至7. 2，倾注无菌平板置冰箱中，备用； 4、哥伦比亚血平板制备哥伦比亚血琼脂基础950ml:蛋白胨23. Og，琼脂粉10. 0g，氯化钠5. Og,淀粉I. Og,加蒸馏水950ml煮沸3次，按冷却至25°C后测量值为标准，调整pH至7.3，经121°C 15磅15分钟灭菌后冷却至50°C加入50ml无菌脱纤维绵羊血，混匀后倾注无菌平板置冰箱中，备用； 5、微需氧产气袋制备成分碳酸氢钠8.Og,活性炭3. Og,枸橼酸2. Og,铁粉7g，无水硫酸铜I. 5g，硅藻土 10g，均匀干燥脱水后置锡纸袋内，真空封口 ； 6、革兰染色液制备革兰染色液I液即结晶紫取结晶紫酒精饱和液10ml，1%草酸铵水溶液90ml，混合均匀即可；革兰染色液II液即碘酒取碘化钾2. Og溶于IOml蒸馏水中，再加碘粒I. 0g，充分摇动使之溶解，再加蒸馏水300ml即可，储存于棕色瓶中备用；革兰染色液III液纯酒精液；革兰染色液IV液即复红染液碱性复红8. 16g，溶于质量百分比浓度95%酒精IOOml内，取IOml加入质量百分比浓度5%石碳酸水溶液90ml，临用时再以蒸馏水稀释10倍或沙黄染色液； 7、氧化酶试剂制备成分质量百分比浓度1%对-氨基-4-甲基苯胺盐酸盐水溶液；8、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂制备马尿酸纸片制备方法马尿酸钠l.Og，溶于50ml蒸馏水中，经0. 22 μ m孔径滤膜加压过滤后滴加于直径6. 35mm无菌厚纸片中，烘干备用；马尿酸酶反应试剂茚三酮溶液茚三酮3. 5g，加50ml丙酮和50ml正丁醇溶解混均后分装2. 5ml于无菌棕色滴瓶中备用。
3.权利要求I所述试剂盒在水中弯曲菌的同步分离和鉴定中的应用。
4.权利要求I所述试剂盒在食品中弯曲菌的同步分离和鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用，主要解决对空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选效能不够直观的技术难题。本发明技术方案弯曲菌分离、鉴定的试剂盒，包括选择性增菌液Ⅰ、选择性增菌液Ⅱ、改良卡尔马里琼脂平板、哥伦比亚血平板、微需氧产气袋、革兰染色液、氧化酶试剂、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂；利用选择性分离培养基对应生长的弯曲菌典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌。
文档编号C12Q1/04GK102816831SQ20121026844
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者许学斌, 袁政安, 金汇明 申请人:上海市疾病预防控制中心