具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用。本发明菌株名称为B-RS-06，保藏编号为CGMCCNo.5352。本发明从植物根际土壤分离出菌株，并将菌株的代谢物作用于植物寄生线虫。本发明的杀线虫剂原材料来源于植物根际土壤，对于环境及植物、人、动物等所有生物无不良影响，而且生产成本低，生产过程简单，不污染环境。
【专利说明】具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用，属于微生物农药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]植物寄生线虫是植物的主要病原物之一，是我国乃至世界农业生产上一类重要的土传病害。据FAQ的保守估计，全世界每年因线虫的危害所造成的经济损失约1000亿美元。我国每年仅大豆因线虫造成的损失就达I亿美元，各种蔬菜线虫的危害损失达30亿美元以上。目前，生产上急需防治线虫的作物面积至少在5000万亩。严重威胁我国农林业生产的线虫病害有各种作物的根结线虫spp.)病、马铃薯腐烂莖线虫(Λ? tylenchus des true tor )病、胞囊线虫(/? terodera spp.)病、水稻干尖线虫(.Aphelenchoides Ae1S1Seja')病和松材线虫(及xylophiIusV病等。植物寄生性线虫病的防治目前多采用化学防治、轮作及抗病品种，但效果均不太理想，且存在弊端多。如目前使用的化学杀线虫剂多为剧毒或高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层带来严重污染或破坏，而且药物在植物体内残留会直接对人类造成危害。因此，急需开发对环境友好，对人、畜无毒的防治植物寄生线虫的药剂。
[0003]植物寄生线虫生防细菌的研究是最近几年兴起的新的研究热点，越来越多的细菌被分离，不同的作用方式被报道。目前主要研究的有植物根围促生细菌(Plantgrowth-promoting rhizobacteria, PGPR)、穿刺巴氏杆菌ira/75.)、假单胞杆菌spp.)、苏云金芽孢杆菌等,它们在线虫生物防治中有着巨大的开发潜力，其价值也为人们逐渐认识。如PGPR主要通过诱导作物的系统抗性来防治作物病虫害；穿刺巴氏杆菌为线虫专性寄生菌，对线虫防效显著，但是该菌必须依靠线虫才能大量繁殖，而线虫的生长又必须通过寄主植物来实现，故大量生产受到限制。此外，铜绿假单胞菌0°.aerwgifliosa)和突光假单孢菌0°./Ywore1Scefl1S)也具有防治根结线虫病的能力，而且荧光假单孢菌产生的一种胞外蛋白酶在防治南方根结线虫(#.的过程中发挥了重要作用。苏云金芽孢杆菌在微生物防治病虫害方面占有极其重要的地位，其伴孢晶体蛋白具有杀线虫能力。
[0004]植物根际微生物定殖于植物根际系统，通过产生抵抗多种病原菌的抗生素类物质或毒素，帮助植物抵抗生物类侵害，包括病原细菌、真菌、病毒及线虫等，是重要的植物病害防治菌种资源。由于植物根际微生物和植物寄生线虫同时生存在植物根际微生态系统内，因此，将具有杀线虫作用的植物根际微生物的代谢物作用于植物寄生线虫病得感病部位，使代谢物直接到达感染寄生线虫的植物组织中发挥作用，不仅可以防治寄生线虫还能发挥根际微生物促进植物生长的作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌及其制备方法和应用。
[0006]本发明从植物根际土壤分离出菌株，并将菌株的代谢物作用于植物寄生线虫。
[0007]一种具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌，菌株为芽孢杆菌UaciBm sp.)B-RS-06 ;该菌株B-RS-06已于2011年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是 100101，保藏编号为 CGMCC N0.5352。
[0008]本发明所提供的菌株B-RS-06属于芽孢杆菌属Ofeci77M)，其菌落白色，光滑湿润，具有光泽。革兰氏阳性菌，细胞长杆状，单生，芽孢卵圆形，端生，膨大。
[0009]一种具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于该方法用无菌磷酸缓冲液(phosphate buffered Saline,PBS)浸泡并振荡瑞香狼毒(Stellera chamaejasmL.)根系，获得瑞香狼毒根际土壤悬浮母液，对悬浮液进行系列梯度稀释，得到不同浓度的稀释液，分别取一定体积的不同浓度稀释液，均匀涂抹在细分离培养基(nutrient agar,NA)平板上，将平板在特定的培养条件下培养，待长出肉眼可见的细菌菌落后，挑取适合计数的浓度平板，进行计数，并将所有的菌落在新鲜的NA培养基上纯化，得到纯的细菌菌株后，在低温短期或长期保存。
[0010]本发明所述的制备方法中，无菌磷酸缓冲液(phosphate buffered Saline, PBS)由 NaCl 8 g、KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g 以及无菌水 1000 ml 组成，pH 7.3。
[0011]本发明所述的制备方法中，将瑞香狼毒(Stellera chamae jasm L.)根系浸入无菌磷酸缓冲液中，充分振荡瑞香狼毒新鲜根系，将附着在根系表面的土壤洗进缓冲液，得到1/10的瑞香狼毒根际土壤悬浮母液。
[0012]本发明所述的制备方法中，瑞香狼毒根际土壤悬浮液的梯度稀释方法，以10倍体积为单位，用无菌水进行系列稀释，得到浓度梯度为10_\10_2直至10_8的系列稀释液。
[0013]本发明所述的制备方法中，取一定体积的系列稀释液的方法，就是从浓度梯度为10_4-10_8的系列稀释倍数中，分别取0.1 ml均匀涂布在NA平板培养基上。
[0014]本发明所述的制备方法中，NA细菌分离培养基由牛肉膏3 g,蛋白胨5 g, NaCl8 g,琼脂粉12 g，蒸馏水1000 ml组成，pH 7.2-7.4。
[0015]本发明所述的制备方法中，特定培养条件为在NA平板培养基上，28±2°C避光培养。
[0016]本发明所述的制备方法中，肉眼可见的细菌菌落(colony-forming units,CFU)为平均直径在I mm (含I mm)以上的菌落。
[0017]本发明所述的制备方法中，选择适合计数的浓度平板方法，在直径为90 mm的培养皿中，肉眼可见的单个分散的菌落数在100-150 CFU。
[0018]所述的细菌菌株保存方法，短期保存可采用NA斜面培养基划线在4°C下保存，如果做长期保存，可在NA液体培养基和甘油的混合液中在_70°C下保存，NA液体培养基和甘油的体积比为1:1。
[0019]一种用菌株为芽孢杆菌(Mcillus sp.) B-RS-06作为杀虫剂，其特征在于B-RS-06的代谢物对植物寄生线虫的具有触杀活性。
[0020]本发明菌株适合于以其代谢物触杀植物寄生线虫，是开发微生物源杀线虫剂的优良活性先导物质。[0021]本发明的生物杀线虫剂为纯生物制剂，可用于对松材线虫、马铃薯腐烂茎线虫等植物寄生线虫的生物防治。不同稀释浓度代谢物的处理和对照NA培养液处理有显著差异，代谢物原液的杀线虫效果可达到100%以上。
[0022]本发明的杀线虫剂原材料来源于植物根际土壤，对于环境及植物、人、动物等所有生物无不良影响，而且生产成本低，生产过程简单，不污染环境。
[0023]本发明对于植物线虫的生物防治、微生物杀线虫剂的开发应用和农产品的无公害生产，具有极其重要的意义，适合于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为菌株B-RS-06CGMCC N0.5352的代谢物原液作用于植物寄生线虫24 h后的情况，主要展示线虫的触杀死亡情况(X40倍，A为对照，B为处理)。
[0025]图2为菌株B-RS-06CGMCC N0.5352的代谢物10倍液作用于植物寄生线虫24 h后的情况，主要展示线虫死亡形态(X 250倍，A为对照，B为处理)。
[0026]图3为菌株B-RS-06CGMCC N0.5352的代谢物原液作用于植物寄生线虫24 h后的情况，主要展示线虫部分体壁破损，内含物溢出(X400倍，A为对照，B为处理)。
[0027]图4菌株B-RS-06的不同浓度代谢物对马铃薯腐烂茎线虫触杀活性，示代谢物原液和10倍稀释液的线虫触杀活性。
[0028]图5菌株B-RS-06的不同浓度代谢物对松材线虫触杀活性，示代谢物原液和10倍稀释液的线虫触杀活性。
【具体实施方式】
[0029]下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。
[0030]实施例1.利用系列梯度稀释法分离植物根际土壤细菌
1、甘肃省兰州市兰州大学榆中校区萃英山瑞香狼毒根际样品细菌的分离从采自兰州大学榆中校区萃英山顶(35° 56’ N, 104° 08’ W ;海拔1965.8 m)的瑞香狼毒(Sie J7 era chamae jasm L.)根际土壤中分离菌株B-RS-06。其方法如下:选取长势旺盛的瑞香狼毒，整株挖出后，轻轻抖落根系上的多余土壤，将3 g根系样品浸入I体积的无菌PBS缓冲液中，得到1/10的稀释液样品，充分振荡的新鲜根系5 min，将附着在根系表面的土壤洗进缓冲液，然后以10倍体积为单位进行系列稀释，直到得到最小浓度为10_8的系列稀释液，从浓度梯度为10-4-10-8的稀释液中，分别取0.1 ml均匀涂布在NA平板培养基上，28±2°C避光培养，待平板上长出肉眼可见的细菌菌落后，用无菌牙签挑取少许菌落转移至新的NA培养基上进行纯化，没有污染，则转入NA斜面培养基，4°C短期保存。
[0031]2、甘肃省定西市岷县寺沟乡崖寺村瑞香狼毒根际样品细菌的分离
从采自甘肃省定西市岷县寺沟乡崖寺村(34° 24’ N, 104° 05’ W ;海拔2588.1 m)的瑞香狼毒根际土壤中分离菌株B-RS-06。其方法同实施例1-1。
[0032]3、甘肃省武威市天祝藏族自治县抓西秀龙乡碳窑沟村瑞香狼毒根际样品细菌的分离 从采自甘肃省武威市天祝藏族自治县抓西秀龙乡碳窑沟村(37° 07’ N, 102° 47’W ;海拔3280.4 m)的瑞香狼毒根际土壤中分离菌株B-RS-06。其方法同实施例1_1。[0033]PBS缓冲液和NA培养基的具体组成成分与
【发明内容】
中的一致。
[0034]本发明所提供的菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.) B-RS-06?该菌株B-RS-06已于2011年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101，保藏编号为CGMCCN0.5352。
[0035]实施例2.菌的培养及代谢物的制备
1、一级菌种培养:将保存在斜面培养基上的菌株B-RS-06转接活化到NA平板培养基上，28-30°C避光培养，待长出肉眼可见的菌落后作为一级菌种。
[0036]2、二级菌种培养:将经过活化的一级菌种接种到NA液体培养基上，放置在温度为28-30°C，转速为180 rpm的摇床上避光培养，定期观察记录，待培养液变浑浊(约72 h)后，停止振荡培养，转入4°C冰箱短期保存。
[0037]3、代谢物的制备:将液体菌剂置于低温高速离心机中，设定离心温度为4°C，转速为10000转，离心10 min后，缓慢收集上清液，即为菌株B-RS-06的代谢物。
[0038]4、不同浓度代谢物的制备:采用NA培养液作为稀释剂，将菌株B-RS-06的代谢物配成10倍、50倍、100倍的稀释液，用紫外可见分光光度计(岛津，UV-1750)测定代谢物原液及各稀释液的吸光值及浓度。
[0039]实施例3.芽孢杆 菌B-RS-06代谢物的线虫触杀活性
1、线虫的培养
本实施例中以马铃薯腐烂莖线虫iDitylenchus destructor)和松材线虫{Bursaphelenchus xylophilus)为实验材料,线虫是按照常规方法培养获得的。待线虫繁殖长满整个培养皿后，将培养皿倒置，给培养皿盖中加入3-5 ml无菌水，放置6 h以上，线虫进入无菌水中。在显微镜下镜检，根据线虫密度，进行适当的稀释，使显微镜放大倍数在40倍时，每视野的线虫数约在100-200条。
[0040]2、不同浓度代谢物对线虫的触杀活性
实验在24孔板中进行，选取按照实施例2-4中，菌株B-RS-06代谢物及不同倍数稀释液的制备方法得到的代谢物，将原液、10倍液、50倍液和100倍液的菌株代谢物，分别加入按照实施例3-1中得到的线虫悬浮液，代谢物和线虫悬浮液的体积比为1:1，以加入NA液体培养液为阴性对照，每个处理重复3次。处理后3 h、7 h、12 h、16 h和24 h观察记录线虫的死亡情况，每次观察不同的5个视野，记录的线虫死亡数，计算公式为:线虫死亡率(％)=(死亡线虫数/供试线虫总数)X 100%,实验结果用SPSS vl6.0软件进行统计分析。
[0041]3、结果
(I)代谢物对植物寄生线虫的触杀活性
处理后3 h和7 h观察，加入原液和10倍液的代谢物的线虫行动缓慢，活性受到抑制，50倍和100倍液的处理线虫未见变化，运动速度快，活力旺盛；处理后12 h观察，在原液中大部分线虫，虫体僵直，10倍液中也有小部分线虫死亡；而50倍液的线虫活力稍有下降，运动速度变慢，100倍液处理的线虫和对照无差别；处理16 h后，原液中的线虫基本全部死亡，10倍液中线虫死亡数量也有增加,但仍可活动缓慢的活线虫,50倍液和100倍液的线虫未见死亡，但是50倍液的线虫活力低于100倍液中得线虫；处理24 h后，原液中已几乎全部死亡，虫体干枯(见图1), 10倍液中线虫也大部分死亡(见图2)，50倍液和100倍液中线虫活力有所下降，但未出现死亡。具体数据见表1，2和图4，5。
[0042](2)线虫死亡后的形态变化
用菌株B-RS-06代谢物原液处理线虫24 h后，所有线虫死亡，死亡的线虫大部分虫体僵直，干枯，内含物溢缩，体壁与内含物发生了严重的分离；线虫的部分体壁破损，内含物溢出，有的线虫甚至所有体壁全部消失，仅剩内含物的残骸，死亡虫体的残骸明显比对照线虫小(见图2，3)，由此表明，菌株B-RS-06代谢物触杀植物寄生线虫的毒力强，且这种触杀不是短暂的麻醉或活性抑制，而是彻底的破坏线虫结构，达到不可逆的致命毒杀。
[0043]表1菌株B-RS-06的不同浓度代谢物对马铃薯腐烂茎线虫触杀活性 表1菌株B-RS-06的不同浓度代谢物对马铃薯腐烂茎线虫触杀活性
【权利要求】
1.一种具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌，菌株为芽孢杆菌sp.B-RS-06 ；该菌株的保藏编号为CGMCC N0.5352。
2.一种如权利要求1所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于该方法用无菌磷酸缓冲液浸泡并振荡瑞香狼毒根系，获得瑞香狼毒根际土壤悬浮母液，对悬浮液进行系列梯度稀释，得到不同浓度的稀释液，分别取一定体积的不同浓度稀释液，均匀涂抹在细分离培养基即nutrient agar, NA平板上,将平板在特定的培养条件下培养，待长出肉眼可见的细菌菌落后，挑取适合计数的浓度平板，进行计数，并将所有的菌落在新鲜的NA培养基上纯化，得到纯的细菌菌株后，在低温短期或长期保存。
3.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于无菌磷酸缓冲液由 NaCl 8 g、KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g 以及无菌水 1000 ml组成，pH 7.3。
4.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于将瑞香狼毒根系浸入无菌磷酸缓冲液中，充分振荡瑞香狼毒新鲜根系，将附着在根系表面的土壤洗进缓冲液，得到1/10的瑞香狼毒根际土壤悬浮母液。
5.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于瑞香狼毒根际土壤悬浮液的梯度稀释方法，以10倍体积为单位，用无菌水进行系列稀释，得到浓度梯度为10_\10_2直至10_8的系列稀释液。
6.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于取一定体积的系列稀释液的方法，就是从浓度梯度为10_4-10_8的系列稀释倍数中，分别取0.1ml均匀涂布在NA平板培养基上。
7.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于NA细菌分离培养基由牛肉膏3 g,蛋白胨5 g, NaCl 8 g,琼脂粉12 g，蒸馏水1000 ml组成，pH 7.2-7.4。
8.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于特定培养条件为在NA平板培养基上，28 ±2°C避光培养。
9.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于肉眼可见的细菌菌落即colony-forming units, CFU为平均直径在大于等于I mm以上的菌落。
10.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于选择适合计数的浓度平板方法，在直径为90 _的培养皿中，肉眼可见的单个分散的菌落数在 100-150 CFU。
11.如权利要求2所述的具有杀线虫活性的芽孢杆菌属细菌的制备方法，其特征在于短期保存可采用NA斜面培养基划线在4°C下保存，如果做长期保存，可在NA液体培养基和甘油的混合液中在_70°C下保存，NA液体培养基和甘油的体积比为1:1。
12.—种 用菌株为芽孢杆菌sp.B-RS-06作为杀虫剂，其特征在于B-RS-06的代谢物对植物寄生线虫的具有触杀活性；用于对松材线虫、马铃薯腐烂茎线虫等植物寄生线虫的生物防治。
【文档编号】C12N1/20GK103773707SQ201210413059
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2012年10月26日
【发明者】秦波, 金辉, 刘权, 张等宏, 燕志强 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所