一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤为：取海胆卵研磨，将研磨液涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃恒温培养2天；挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2；将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃发酵1天，牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6%；4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4℃静置过夜，10000r/min离心处理30min，将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白。本方法操作简单、成本低廉。
【专利说明】一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，特别是一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]海胆为棘皮动物门(Echinoderma-to)海胆纲(Echinoidea)动物。海胆以其生殖腺供食，其生殖腺又称海胆卵、海胆籽、海胆黄、海胆膏，色橙黄，味鲜香，占海胆全重的8%~15%。目前世界上已发现的海胆有850余种，常见的包括光棘球海胆(也称大连紫海胆)、紫海胆以及马粪海胆。
[0003]海胆纲的一些种类自古即为滋补佳品，常用于预防和治疗一些疾病，这些功能主要是由其所含多糖、蛋白、脂肪酸、色素、微量元素等活性物质成分决定的，各成分的鉴定及功效正在被逐渐证明。另外海胆中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、利用海胆卵制备海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的方法，克服现有技术的不足。
[0005]本发明的一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤如下:
a.取健康、新鲜的海胆卵研磨后，将200PL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37 °C恒温条件下培养2天；
b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2(Bacilluspolymyxa);该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7078 ；
c.将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35°C条件下发酵I天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6% ；
d.在4000r/min的条件下离心去除菌体,在上清液中加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为60%，4°C静置过夜，在10000 r/min条件下离心处理30 min,将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中的物质冷冻干燥，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白。
[0006]本发明的海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的应用。
[0007]本发明的方法操作简单、成本低廉，从海胆共生多粘芽孢杆菌菌株DNC2的发酵液中所提取的抗肿瘤活性蛋白抗肿瘤活性强，对白血病k562细胞株、人肝癌H印G2，乳腺癌MDA-MB-231和MFC-7均有明显的抑制活性，因此可应用于抗肿瘤药品的制备，具有产业价值。
[0008]本发明中的海胆源多粘芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7078。
【具体实施方式】
[0009]本发明的实施例依次按如下步骤进行:
a.将打捞后的新鲜海胆，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海胆卵用研磨机充分研磨成匀浆后，将200 PL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37 °C恒温培养2天。
[0010]b.挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，用滤纸片法检测各纯菌株的抑菌活性作为初步筛选标准，结果表明DNC2菌株抑菌活性明显。
[0011]对DNC2活性菌株利用16sRNA分子鉴定确定其为芽孢杆菌属，通过耐盐性试验、对溶菌酶抗性试验、V.P实验、苯丙氨酸、丙二酸盐实验、柠檬酸盐利用、产糊精结晶、油脂水解、淀粉水解、二羟丙酮的形成、过氧化氢酶、酪氨酸水解、产硫化氢、明胶水解、对溶菌酶抗性、石蕊牛乳实验、糖发酵、硝酸盐还原、产生吲哚、动力实验、卵磷脂酶、甲基红实验、酪素水解等生理生化试验将其鉴定到种，该活性菌株为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa),该菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7078 ；
c.以抑菌圈平均直径为标准，优化次级代谢产物产生的最佳条件，在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35°C发酵I天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨的质量百分比分别为3%和6% ；
d.在4000r/min条件下离心处理,去除菌体,在上清液中加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为60%，4°C静置过夜，在10000 r/min条件下离心处理30 min,将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中的物质冷冻干燥，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白；SDS-PAGE电泳结果表明沉淀物为蛋白质。
[0012]e.体外抗肿瘤活性的检测:取冻干样品用DMEM溶解，培养肿瘤细胞(将肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病细胞K562)，样品设定浓度梯度，用MTT法测蛋白作用后肿瘤细胞存活率。具体操作如下:
首先培养肿瘤细胞，将肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病细胞K562复苏到20%的血清培养集中，培养4飞天，接种到六孔板中，换成10%培养基培养，细胞密度达到2 X IO6后接种到96孔板中，每空100 PL，过夜；将蛋白用DMEM溶液溶解，然后用DMEM做梯度稀释(10、20、30、40、60、80、100、150 Pg/mL)，将96孔板中培养基弃掉加入蛋白样品孵育6小时，空白对照只加DMEM。配制MTT，6小时后每空加入10 μL ΜΤΤ，孵育4小时，然后将孔内液体弃掉，每空加入100 μL DMSO溶解紫色结晶，37 °C水浴保持20分钟。然后用酶标仪在490 nm下测吸光度值进而处理数据计算细胞存活率。结果该蛋白在60 μδ/mL时对白血病细胞K562抑制率就可达65.8%，在300 Pg/mL时抑制率高达95.87% ;该蛋白在60 μg/mL对肝癌细胞HePG2抑制率为73.29%，在300 μg/mL时抑制率为90.41% ;在150^gZmL时对乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率为81.64%，300 Pg/mL时抑制率为95.67% ;而对MCF-7细胞株的抑制率在30 Pg/mL时就可达60.93%，该菌株发酵液在低剂量范围内抑制肿瘤细胞 ，因此可作为粉剂或针剂应用于抗肿瘤药物的制备。
【权利要求】
1.一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于:步骤如下: a.取健康、新鲜的海胆卵研磨成均浆后，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37 °C恒温条件下培养2天； b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2{Bacillus
该菌株已于2013年I月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号:CGMCC No: 7078 ； c.将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35°C条件下发酵I天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6% ； d.在4000r/min的条件下离心去除菌体,在上清液中加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为60%，4°C静置过夜，在10000 r/min条件下离心处理30 min,将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中的物质冷冻干燥，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白。
2.一种根据权利要求1所述所的海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的应用。
【文档编号】C12R1/12GK103966285SQ201310034685
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】张付云, 徐凤, 苍桂璐, 杨阳, 刘晔 申请人:大连海洋大学, 张付云