富含dha及dpa的油脂及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种富含多不饱和脂肪酸油脂及其制备和应用，特别是指富含DHA及DPA的油脂及其制备和应用。在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻；培养结束后收集藻体细胞；从藻体细胞中提取回收富含多不饱和脂肪酸的油脂；连续培养过程包括连续流加培养基质、细胞的截留返回、发酵液的放流等工艺步骤。富含DHA及DPA的油脂可以用于制备普通食品添加剂、特殊膳食食品添加剂及药品。本发明解决了现有技术中存在的细胞活性低、生产周期长等问题，具有细胞活性高、生长周期短、不饱和脂肪酸产量高等优点。
【专利说明】富含DHA及DPA的油脂及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种富含多不饱和脂肪酸油脂及其制备和应用，特别是指富含DHA及DPA的油脂及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]多不饱和脂肪酸是人体必需的营养物质，摄取不足会造成身体机能不适。它们可保持细胞膜的相对流动性，保持细胞的正常生理功能，也可以降低甘油三酯，改善微循环，促进脑和神经细胞发育，增强记忆和思维能力。长链多不饱和脂肪酸中最重要的有DHA (二十二碳六烯酸)和DPA (二十二碳五烯酸)。
[0003]DHA是人脑的主要组成物质之一，约占大脑灰质磷脂的24.3%_36.6%。DHA可促进脑细胞的分裂、增殖、突起的生长和神经网络的形成，有利于智力、学习和记忆能力的提高。
[0004]DHA具有调节中枢神经系统的功能，体内DHA的含量与婴幼儿成长过程中的反应灵敏程度、早产儿出生后的生长呈正相关。如果出生后，早产儿的膳食中不能提供足够的DHA，就会对早产儿的生长发育带来极为不利的影响。DHA在人的视网膜中含量丰富，是神经和视觉发育的一种必要营养素，它可以提高婴幼儿视觉的敏锐度。婴幼儿膳食中若缺乏DHA，视网膜的DHA含量减少，对光的视觉敏感性会受到影响，视力会降低。
[0005]DHA可以降血压，调节人体内血脂和脂蛋白的正常代谢，降低血液粘稠度和血液中胆固醇水平，预防心血管疾病。DHA还是一种中枢神经保护素的前体，能够促进人脑的综合代谢活力同时减缓神经退化性疾病的进程，对老年人有防止老年痴呆症的作用。近些年来有研究也发现了二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,简称DPA)对胆固醇的吸收和代谢方面的的生理功效，指出DPA可以降低血清总胆固醇和非高密度脂蛋白胆固醇，同时DPA和DHA对于大动脉的功能也有一定的改善作用。
[0006]有关这些长链多不饱和脂肪酸的生理功能及其实际应用的研究已有较多报道。传统的长链多不饱和脂肪酸多是从深海鱼油中提取的，但是由于从鱼油中提取的PUFA含有强烈的鱼腥味，而且鱼油中脂肪酸成份复杂，DHA的分离提取过程不仅步骤多而且损失大，所以现在有很多专利是用来申请PUFA分离及纯化方法的。而且近期也有研究调查指出，鱼油中所含有的持续性有机污 染物(POPs)及其危害多年来一直被人们所忽视。持续性有机污染物(POPs)是指在海洋中需要几十年或更长时间才能降解消失的污染物，如人们所熟悉的滴滴涕(DDT)、其它化学杀虫剂、多氯联苯类物质(PCBs)、二恶英(Dioxin)和六氯苯(HCB)等等，这些物质对人体的健康有极大的危害，可以干扰人体内分泌系统、损害神经系统、影响成年人的生育能力以及诱发和促进癌细胞生长发育。此外鱼油还含有如汞等重金属化合物，对孕妇、哺乳期妇女和儿童有很大的伤害。目前多不饱和脂肪酸，特别是DHA的另一个来源是海洋微藻油。从海洋生物的食物链来看，藻类是鱼类的最基本食物，研究表明鱼体内的多不饱和脂肪酸来源于藻类。
[0007]因此利用藻类工业化高效生产DHA具有重要的技术和市场需求。
[0008]微藻细胞可以采用以下培养方式:分批式培养、流加分批式培养和连续培养。分批式培养是将底物基质一次性投加到发酵罐中，将预先培养好的种子培养液接种到发酵罐中，在适宜的条件下培养，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。目前，发酵制品的生产中多采用这种方式。流加分批操作是指先将一定量的发酵底物基质投加到发酵罐中，接种微生物并在适宜的条件下培养一段时间，之后开始按一定要求流加特定的底物基质，当反应终止时取出全部的反应物料的操作方式。连续发酵培养是指底物基质不断流加入发酵罐内，同时又把反应物料连续不断的取出，发酵罐内的反应液体积保持恒定，反应条件不随时间变化的操作方式。分批式发酵因其设备制作费用低，设备的通用性高，是发酵工业中使用广泛的方法之一，但是反应器的非生产周期长，每批发酵结束后都需进行洗罐和灭菌，由于频繁的高温高压灭菌，易使检测装置损伤及设备的腐蚀等损害，而且，种子逐级放大培养过程中任何一级发酵罐染菌均会造成经济损失和生产周期的延迟。分批发酵过程中随培养的进行，底物浓度下降，细胞浓度增加，产物浓度增加，细胞活性逐步降低。流加分批式发酵可以控制反应器中底物基质的浓度，确保细胞生长所需的条件，产率可提高。但分批式流加受罐体积所限，持续的时间短，仍然不能克服非生产周期长的问题。相比之下，连续发酵更容易实现机械化和自动化节约劳动力，减少人工操作带来的污染，只在发酵之初对发酵罐进行一次灭菌后便可长期运行，避免频繁灭菌对设备的损害，也省去了频繁的种子培养过程。因为底物基质的不断添加和反应液的不断排出，可控制发酵罐内代谢产物的浓度，避免底物限制和代谢产物抑制作用，保持了细胞的活性和生长速率。 [0009]在本专利申请之前，尚未有利用连续培养方式进行藻类多不饱和脂肪酸生产的中国专利，现有的专利均是利用分批或流加分批培养，如CN101979623A和ZL01806451.5。通过分批补充某种物质诱导产生脂质。但在这个培养系统中，诱导脂质产生的营养限制条件使得培养过程缺少了细胞生长所必需的营养物质，影响了细胞浓度，造成产量的下降，因为细胞在生长过程中，必需有足够的营养物质或溶解氧的供给才能维持细胞量的增长，而不是限定在某种水平或降低。同时，细胞培养过程中通过新陈代谢作用产生代谢副产物，而这些物质对细胞的生长有负作用，可导致细胞生长速度下降，因此在现有的专利中，所要求的培养技术没有消除培养系统中后期代谢所产生的毒副产物的积累问题，毒副产物一直保留在培养系统中，从而不能达到细胞的高效连续培养。
[0010]微藻油脂生产的目标物为胞内产物，而非胞外分泌物，发酵培养的主要目的是收获高油脂含量的细胞，所以提高发酵液中的细胞生物量是优化发酵条件的主要考虑因素之一。裂壶藻(Schizochytrium)在无性繁殖过程中，每个营养细胞经过分裂释放2_8个游动孢子，这些孢子成熟后又经过细胞分裂使细胞数目成倍增加。因此，最终细胞量的生产和脂肪酸的积累是和细胞的生长及活性相关。微生物发酵过程的连续培养通常都是在连续流入培养基的同时流出反应液，以维持罐内一定的反应液体积、细胞浓度和营养物质浓度，所以随着反应液不断排出的同时也造成细胞的流失，短期内罐内可收集的细胞浓度是较低的。
[0011]发明目的
[0012]本发明的目的在于提供一种富含DHA及DPA的油脂及其制备和应用，通过连续流加基质和排出反应液有利于解除发酵底物限制和产物抑制导致的细胞活性降低，避免细胞生长进入停滞期和衰老期，有利于维持发酵罐内细胞的活性和脂肪酸的积累；并将该富含DHA及DPA的油脂用于制备普通食品添加剂、特殊膳食食品添加剂、功能食品以及药品。[0013]本发明的整体技术构思是:
[0014]富含DHA及DPA的油脂，该油脂中不饱和脂肪酸DHA和DPA分别占总脂肪酸质量百分比的25-55%以及5-20%。
[0015]富含DHA及DPA的油脂的制备方法，在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻；培养结束后从发酵罐中收集藻体细胞；从所述的藻体细胞中提取回收所述的富含多不饱和脂肪酸的油脂；所述的培养为连续培养，连续培养过程包括如下工艺步骤:
[0016]A、连续流加培养基质:培养基质泵入发酵罐，发酵液由出料泵经出料口泵出罐外；
[0017]B、细胞的截留返回:步骤A中的发酵液进入封闭无菌的固液分离装置进行细胞与发酵培养基分离，分离后的细胞浓缩液泵回发酵罐；
[0018]C、发酵液的放流:当发酵罐内的细胞达到额定浓度时，将发酵罐内的部分培养基排出。
[0019]富含DHA及DPA的油脂在制备普通食品添加剂、特殊膳食食品添加剂、药品中的应用。
[0020]本发明的具体技术构思还有: [0021]步骤A是发酵过程中当发酵培养基中碳源浓度为5-20克/升时，开始将培养基质泵入发酵罐并维持罐内5-20克/升的碳源浓度。
[0022]所述的步骤A培养基质中碳源的添加比例高于其他营养物质，其他营养物质选自氮源，维生素，磷酸盐，微量元素及其混合物。
[0023]步骤B中细胞与发酵培养基的分离采用固液分离装置。
[0024]步骤B中细胞浓缩液由发酵罐底部灌流回发酵罐内。
[0025]优选的实施方式是，所述的培养过程的温度为20°C -35°C。
[0026]所述的连续培养过程发酵培养基的溶解氧含量为5%_60%饱和度。
[0027]所述的裂壶藻优选裂壶藻CGMCCN0.7693。
[0028]本发明中所米用的裂壶藻(Schizochytrium sp.)CGMCCN0.7693已于2013年6月9日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，该保藏单位的地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0029]可以显而易见的是，为缩短发酵周期、降低发酵成本，常见的技术实现方式是，所述的培养是将裂壶藻原始藻种经活化、扩大培养后制成种子液，将种子液接种至发酵培养基进行培养。
[0030]所述裂壶藻的活化传代培养基采用如下组分组成:
[0031]葡萄糖10-30g/L，胰蛋白胨2-8g/L，酵母提取物l_5g/L，氯化钠15_25g/L，硫酸镁 l_5g/L，磷酸二氢钾 0.5-5g/L,氯化钾 0.Ι-lg/L,氯化钙 0.01-0.6g/L,硫酸铵 0.5_3g/L,碳酸氢钠0.01-0.05g/L,乙二胺四乙酸二钠盐10-60mg/L,硼酸10-34.2mg/L,氯化锰0.01-lmg/L，三氯化铁 0.5-3mg/L，氰钴胺素 5_50mg/L，氯化锌 0.Ι-lmg/L，氯化 3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羟基乙基)-4-甲基噻唑0.5-10mg/L，氯化钴0.01-0.lmg/L，硫酸铜 0.01-0.15mg/L，余量为水，琼脂 10g/L, pH=6_7。
[0032]所述的裂壶藻的扩培、发酵培养基、流加培养基质采用如下组分组成:[0033]葡萄糖40_60g/L，酵母提取物5_20g/L，氯化钠10_20g/L，硫酸镁l_5g/L，磷酸二氢钾0.5-5g/L,氯化钾0.Ι-lg/L,氯化钙0.01-0.6g/L,硫酸铵0.5_3g/L，碳酸氢钠0.01-0.05g/L,氯化锰0.01-lmg/L,三氯化铁0.5_3mg/L，氰钴胺素5_50mg/L，氯化锌0.1-lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羟基乙基)-4-甲基噻唑 0.5-10mg/L,氯化钴 0.01-0.lmg/L，硫酸铜 0.01-0.15mg/L，硼酸 10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二钠盐20-60mg/L，余量为水，pH=6-7。可以显而易见的是，在发酵过程中按需添加适量消泡剂，以维持发酵过程的正常进行。
[0034]本发明总脂的测定采用传统的溶剂浸提法，根据经典的Bligh-Dyer脂肪酸提取及酯化方法，称取一定量的冻干细胞，与甲醇:氯仿:水=1:2:0.8的混合液一起搅拌30分钟，离心后收集上清液，反复清洗数次后合并上清液，用氮气吹干溶剂得到藻细胞的脂，称重，测得总脂含量。取适量油脂按一定比例加入KOH-甲醇溶液及一定量17烷酸的内标物与三氟化硼-乙醚，由此进行甲酯化，从而得到多不饱和脂肪酸甲酯，进行气相色谱测定。 [0035]本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于:
[0036]本发明在反应液流出端口增加细胞捕获反流装置富集细胞，再将细胞浓缩液返回发酵罐。利用沉降-逆灌流偶联的细胞连续培养方式，通过连续流加基质和排出反应液的方式，有利于解除发酵底物限制和产物抑制导致的细胞活性降低的问题，避免细胞生长进入停滞期和衰老期，有利于维持发酵罐内细胞的活性和脂肪酸的积累。进而通过细胞本身的生长特性自然诱导脂质产生，从而达到较高的多不饱和脂肪酸生产量。细胞截留返回避免了细胞流失，维持了发酵罐内高细胞浓度，同时补充基质，节省了发酵罐接种后的延迟期，缩短了生产周期。这一方法可维持发酵罐中较高的细胞浓度，高效生产所需的产物。
[0037]在现有技术中DHA及DPA已被文献报道可应用于制备食品添加剂、功能食品、保健品甚至预防心脑血管等药品的制备，本发明中所述的富含DHA及DPA的油脂经检测符合相关的产品要求，且已有相关的产品出售，因此， 申请人:不再对其用于制备食品添加剂、功能食品、保健品甚至药品的制备方法进行赘述。
[0038]本发明中所米用的裂壶藻(Schizochytrium sp.)CGMCCN0.7693已于2013年6月9日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏。
【具体实施方式】
[0039]以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。本发明中的固液分离装置采用了简易的细胞沉降槽和中空纤维过滤膜，但不限于这两种装置，对于采用更先进的沉降型固液分离装置和膜过滤型固液分离装置也属于本发明的保护范围。
[0040]实施例1
[0041]微藻藻种的保藏培养:本实施例中的藻种选用裂壶藻(Schizochytriumsp.)CGMCCN0.7693。其在固体培养基上可以正常生长，所以藻种传代活化采用半天然化学合成培养基进行。所述的裂壶藻活化传代培养基采用如下组分组成:
[0042]葡萄糖10g/L,胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,氯化钠15g/L,硫酸镁lg/L,磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钾0.lg/L，氯化钙0.01g/L，硫酸铵0.5g/L，碳酸氢钠0.01g/L,乙二胺四乙酸二钠盐10mg/L,硼酸10mg/L,氯化猛0.01mg/L,三氯化铁0.5mg/L,氰钴胺素5mg/L,氯化锌0.lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基_5_嘧啶基)-甲基]_5_ (2-羟基乙基)_4_甲基噻唑0.5mg/L,氯化钴0.01mg/L,硫酸铜0.01mg/L,琼脂10g/L,余量为水，pH=6_7。
[0043]培养基配好后，121°C蒸汽灭菌20分钟。转接后的藻种于20-30°C培养箱静置培养4天后，观察菌落形态和显微镜镜检，以确保藻种无杂菌污染。
[0044]所述的裂壶藻的扩培、发酵培养基、流加培养基质采用如下组分组成:
[0045]葡萄糖40g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,硫酸镁lg/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钾0.lg/L,氯化钙0.01g/L,硫酸铵0.5g/L，碳酸氢钠0.01g/L,氯化锰0.01mg/L,三氯化铁0.5mg/L,氰钴胺素5mg/L，氯化锌0.lmg/L,氯化3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5_ (2-羟基乙基)-4_甲基噻唑0.5mg/L,氯化钴0.01mg/L,硫酸铜0.01mg/L,硼酸10mg/L，乙二胺四乙酸二钠盐20mg/L，余量为水，pH=6_7。
[0046]将平板活化的藻种接种于装有50ml活化传代培养基的250ml三角瓶中，在温度为30°C、转速为150转/分钟条件下摇瓶培养36小时，以质量百分含量为10%的接种量转接入装有100ml扩培培养基的500ml三角瓶中，继续培养48小时，经过连续两次的传代扩培后，接种到30°C的2L发酵罐中，pH控制在6-7之间，培养过程中酸碱度的控制由向发酵罐添加0.5M的氢氧化钠溶液或0.5M的盐酸溶液完成，通气量为1.5L/min,搅拌转速为350转/分钟。在发酵过程中按需添加适量消泡剂，以维持发酵过程的正常进行。当葡萄糖浓度降为10g/L时，开始进行连续流加和细胞沉降逆灌流耦合。初始流加速度为0.3ml/min,调节通气量和搅拌速度，控制溶氧量为10%。随发酵进行，发酵罐内细胞浓度和耗糖速度增加，发酵过程中控制进料泵的流速，维持罐内葡萄糖浓度在10g/L左右。发酵罐泵出反应液的出口处连接容积为1.5L的细胞沉降槽，所述微藻的沉降速率为2-3cm/min，沉降细胞回流速度为30ml/min，废液以与料液相同的流加速度排出罐外，以避免发酵液的溢出。发酵罐内细胞干重浓度达到39.56g/L时，放流三分之一体积的发酵液，并收集细胞。放流后，发酵罐以0.5ml/min的速度继续流加培养基直到恢复原体积，并控制进料泵的流速，维持罐内葡萄糖浓度在10g/L。如此反复三次放流。三次放流收集藻细胞，富含DHA及DPA的油脂采用常规方法从藻细胞中提取，分别进行分析测试。DHA的产量为9.47±0.97g/L, DPA的产量为3.11±0.77g/L。细胞内主要脂肪酸的组成如下表所示。
[0047]
【权利要求】
1.富含DHA及DPA的油脂，其特征在于该油脂中不饱和脂肪酸DHA和DPA分别占总脂肪酸质量百分比的25-55%以及5-20%。
2.富含DHA及DPA的油脂的制备方法，在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻；培养结束后从发酵罐中收集藻体细胞；从所述的藻体细胞中提取回收所述的富含多不饱和脂肪酸的油脂；其特征在于所述的培养为连续培养，连续培养过程包括如下工艺步骤: A、连续流加培养基质:培养基质泵入发酵罐，发酵液由出料泵经出料口泵出罐外； B、细胞的截留返回:步骤A中的发酵液进入封闭无菌的固液分离装置进行细胞与发酵培养基分离，分离后的细胞浓缩液泵回发酵罐； C、发酵液的放流:当发酵罐内的细胞达到额定浓度时，将发酵罐内的部分培养基排出。
3.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的步骤A是发酵过程中当发酵培养基中碳源浓度为5-20克/升时，开始将培养基质泵入发酵罐并维持罐内5-20克/升的碳源浓度。
4.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的步骤A培养基质中碳源的添加比例高于其他营养物质，其他营养物质选自氮源，维生素，磷酸盐，微量元素及其混合物。
5.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的步骤B中细胞与发酵培养基的分离采用固液分离装置。
6.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的步骤B中细胞浓缩液由发酵罐底部灌流回发酵罐内。
7.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的培养过程的温度为20°C -35°C。
8.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的连续培养过程发酵培养基的溶解氧含量为5%-60%饱和度。
9.根据权利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的裂壶藻选用裂壶藻CGMCCN0.7693。
10.根据权利要求1或9所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的培养是将裂壶藻原始藻种经扩大培养后制成种子液，将种子液接种至发酵培养基进行培养。
11.根据权利要求1或9所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的裂壶藻活化传代培养基采用如下组分组成: 葡萄糖10_30g/L，胰蛋白胨2-8g/L，酵母提取物l_5g/L，氯化钠15_25g/L，硫酸镁l-5g/L,磷酸二氢钾 0.5-5g/L,氯化钾 0.Ι-lg/L,氯化钙 0.01-0.6g/L,硫酸铵 0.5_3g/L,碳酸氢钠0.01-0.05g/L,乙二胺四乙酸二钠盐10-60mg/L,硼酸10-34.2mg/L,氯化锰0.01-lmg/L，三氯化铁 0.5-3mg/L，氰钴胺素 5_50mg/L，氯化锌 0.Ι-lmg/L，氯化 3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羟基乙基)-4-甲基噻唑0.5-10mg/L，氯化钴0.01-0.lmg/L，硫酸铜 0.01-0.15mg/L，余量为水，琼脂 10g/L, pH=6_7。
12.根据权利要求10所述的富含DHA及DPA的油脂的制备方法，其特征在于所述的裂壶藻的扩培、发酵培养基、流加培养基质采用如下组分组成:葡萄糖40-60g/L，酵母提取物5-20g/L，氯化钠10_20g/L，硫酸镁l_5g/L，磷酸二氢钾0.5-5g/L,氯化钾0.Ι-lg/L,氯化钙0.01-0.6g/L,硫酸铵0.5_3g/L，碳酸氢钠.0.01-0.05g/L,氯化锰 0.01-lmg/L,三氯化铁 0.5_3mg/L，氰钴胺素 5_50mg/L，氯化锌.0.1-lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羟基乙基)-4-甲基噻唑 0.5-10mg/L,氯化钴 0.01-0.lmg/L，硫酸铜 0.01-0.15mg/L，硼酸 10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二钠盐20-60mg/L，余量为水，pH=6-7。
13.根据权利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制备普通食品添加剂中的应用。
14.根据权利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制备特殊膳食食品添加剂中的应用。
15.根据权利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制备药品中的应用。
【文档编号】A23L1/30GK103642860SQ201310683597
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】姜悦, 陈璇, 柳泽深 申请人:润科生物工程（福建）有限公司