一种gm-csf-tat-cea重组蛋白及其方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组蛋白及其方法和应用，具体为一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白及其方法和应用，其氨基酸序列表如SEQ?ID?NO：1所示，制备时，将GM-CSF、TAT和CEA通过酶切克隆到质粒pET-15b的克隆位点中构建重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，进行重组蛋白的表达，最后进行重组蛋白转化体的纯化收集，本发明的重组蛋白可应用于肿瘤治疗药物。本发明将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动；避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用；为肿瘤临床治疗提供了新的依据。
【专利说明】—种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白及其方法和应用
[【技术领域】]
[0001]本发明涉及一种重组蛋白及其方法和应用，具体为一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白及其方法和应用。
[【背景技术】]
[0002]肿瘤发生发展的根本原因之一是机体的免疫系统不能对其生长进行有效地控制，对此加以纠正，使机体的免疫系统能有效产生对肿瘤细胞的免疫排斥反应是近百年来人们一直研究的课题。肿瘤疫苗是该方面研究的主要内容，在众多的肿瘤疫苗中，根据抗原提呈细胞在肿瘤免疫中的重要作用而设计的树突状细胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最热门方向。机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)捕获、加工和处理抗原，再将抗原递呈给T，B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell, DC)作为功能最强的APC,能激活静息型T细胞(naive T cell),激发初始免疫应答，在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受，使肿瘤得以发生发展。应用DC瘤苗治疗肿瘤最引人瞩目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏(pulsing) DC，然后将之回输或免疫接种至行瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗已建立的荷瘤模型，这些研究为肿瘤的治疗提供了新的思路，将DC过继回输已在临床用于肿瘤病人的治疗，取得了一定疗效，表明该疗法具有一定的临床应用的可行性。
[0003]DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础，DC的体外大量诱导扩增是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的前提，DC瘤苗的体外构建是DC瘤苗的抗肿瘤免疫治疗的关键。
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【发明内容】
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[0004]针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞具有抗原特异性不高以及过早凋亡等方面的不足。本发明提供了一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白的制备方法，使诱导的DC细胞在抗原特异性和生存周期上都有了很大程度的提高，为后续的特异性免疫应答提供了很好的基础条件。本发明为肿瘤免疫治疗奠定了良好的基础。
[0005]为实现上述目的，设计一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，其氨基酸序列表如SEQ IDNO:1所示。
[0006]本发明还涉及一种制备上述重组蛋白的方法，该方法由以下步骤组成:
[0007]a.将GM-CSF、TAT和CEA通过酶切克隆到质粒pET_15b的克隆位点中构建重组质粒，
[0008]b.重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，进行重组蛋白的表达，
[0009]c.重组蛋白转化体的纯化收集:通过N1-NTA柱分离纯化所述的重组蛋白。
[0010]在所述的步骤(a)中的酶切为:在GM-CSF的基因序列两端添加酶切位点Nde I和Nco I，在TAT的基因序列两端添加酶切位点Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列两端添加酶切位点BamH I和Xho I。
[0011]本发明的重组蛋白可应用于肿瘤治疗药物。
[0012]本发明还包括一种上述重组蛋白制备DC疫苗的方法，将所述重组蛋白刺激诱导健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。
[0013]所述的重组蛋白的浓度为25~100ug/ml,优选为25~50ug/ml。
[0014]本发明将特异性的肿瘤抗原与DC瘤苗相关因子基因相重组，得到可肿瘤免疫治疗所需的特异、高效的重组蛋白。无论从理论上还是实际治疗上都有着很大的进步。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应用于DC瘤苗构建方法的发现，使得产量增大、纯度提高、制备更容易等优点，更能满足实验和临床研究的需要。DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。故发明了一种肿瘤特异性抗原结合细胞因子等刺激DC细胞制备DC疫苗所需的GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，并可有效激发体内抗原特异性免疫反应用于肿瘤的预防及治疗。
[0015]与常规利用肿瘤细胞裂解物诱导DC细胞的方法相比，本发明创新优越之处有以下几点:首先，利用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了 DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动；其次，重组蛋白的成功制备，避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用；再者增强了肿瘤抗原的特异性，针对性的解决了以CEA为标志性抗原的肿瘤免疫治疗，为肿瘤临床治疗提供了新的依据。
[【专利附图】
【附图说明】]
[0016]图1是不同疫苗刺激机体ELSPOT检测IFN-gama斑点数的图表，
[0017]图2是不同疫苗刺激机体特异性反应ELSPOT检测IFN-gama斑点数的图表，
[0018]图3是不同组肿瘤块体积的图表，
[0019]图4是不同剂量重组蛋白刺激机体特异反应ELSPOT检测分析图表，
[0020]图5是MC-38_cea2细胞毒实验图表，
[0021]图6是MC38细胞毒实验图表，
[0022]图7是质粒pET_15b的图谱
[【具体实施方式】]
[0023]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]实施例1:
[0025]本实施例中:
[0026]人源结肠癌Lovo细胞株特异性抗原CEA来自NCBI，序列号为CAE75559 ；
[0027]TAT跨膜肽来自NCBI，序列号为NP_057853，
[0028]粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF来自NCBI，序列号为AAA52578。[0029]质粒pET_15b图谱如图7所示，
[0030]a、利用基因合成技术，分别合成人源结肠癌Lovo细胞株特异性抗原CEA的基因序列、TAT跨膜肽的基因序列以及GM-CSF的基因序列。其中，粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF基因序列两端加酶切位点Nde I和Nco I ;TAT跨膜肽的基因序列两端加酶切位点Xho I和Nde I ;在CEA基因序列两端加酶切位点BamH I和Xho I ;利用基因重组技术将合成的这三段基因序列通过酶切克隆到质粒pET-15b上面构建成重组质粒；再将重组质粒转染大肠杆菌BL21细胞，并确保细胞密度在2X IO6进行转染，37°C培养4天后取出细胞悬液；利用N1-NTA柱分离纯化GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，即可得到GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，其氨基酸序列为 GM-CSF27-138aa-TAT47-57-CEA605-613，详细如 SEQ ID NO:1 所示。
[0031]其中结肠癌Lovo细胞株和质粒pET_15b为本公司所有；其中CEA、TAT跨膜肽和粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF的相关基因序列为第三方合成提供。
[0032]b、构建表达人源CEA的小鼠结肠癌细胞株MC-38，即MC-38_cea2细胞株，并用DMEM培养基，10%热灭活的胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，2mmol的L-谷氨酰胺进行培养；
[0033]C、选取C57BL/6小鼠，并以IX IO6个细胞数量按照每2天进行腹腔注射，以构建MC-38-cea2动物模型；
[0034]d、取健康C57BL/6小鼠四肢骨骨髓制备成单细胞悬液，去除红细胞，加入完全培养基、IL-4等细胞因子，体外诱导出小鼠DC细胞，再加入已获得的GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，37°C、5%C02条件下进行培养诱导、以激活得到DC疫苗。
[0035]㈠常规方法与GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白诱导DC激发机体免疫反应能力的对比常规方法是指，利用肿瘤·细胞株裂解物去诱导DC细胞。
[0036]取两种方法诱导的DC疫苗回输C57BL/6小鼠，利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测疫苗回输后T细胞产生IFN-gama的量，以及⑶4+和⑶8+T细胞应答产生IFN-gama的量去评估机体产生特异性免疫反应的能力。
[0037]由图1数据显示，GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白诱导机体产生免疫反应的能力要高于常规方法，且两者之间的差异具有统计学意义(P < 0.05)。
[0038]由图2数据显示，GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白刺激机体产生CEA特异性免疫反应的能力要高于常规方法，且两者之间的差异具有统计学意义(P < 0.05)。
[0039]㈡GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白最佳剂量
[0040]MC-38-cea2细胞株是由携带人源CEA的cDNA经逆转录病毒转染小鼠结肠癌MC-38细胞株构建而成的。
[0041]选取C57BL/6小鼠构建MC-38-cea2结肠癌动物模型，按照空白、生理盐水、融合蛋白浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml五组分别注射小鼠，每组10只，每5天测量并计算肿瘤块体积大小mm3= (a*b2) /2，a、b为肿瘤块的大小中心轴的直径。
[0042]由图3数据显示，GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白可明显抑制肿瘤的生长，抑制效果跟注射剂量相关，并且之间具有统计学意义(P < 0.05)。
[0043]利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测按以上五组分别注射小鼠后使T细胞产生IFN-gama的量。根据图4显示的数据表明，低剂量GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白就可以诱导机体发生特异性免疫应答。[0044]㈢细胞毒实验
[0045]分别以MC-38_cea2和MC-38细胞作为靶细胞。分别取注射常规蛋白和GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白7天后的C57BL/6小鼠脾细胞，经4%多聚甲醛孵育后以作为效应细胞。按照不同效靶比将细胞混合培养，每组做三个平行，5天后利用铬释放法检测特异性细胞毒性。 [0046]图5数据显示，GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白杀伤表达特异性CEA细胞的效果要高于常规法，两者之间具有统计学意义，且不同效靶比之间的差异性也具有统计学意义(P< 0.05)。
[0047]图6数据显示表明，常规法和GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白均可杀伤结肠癌MC-38细胞，两者之间无明显差异性，并且不同效靶比之间也无明显差异。
【权利要求】
1.一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种制备权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成: a.将GM-CSF、TAT和CEA通过酶切克隆到质粒pET_15b的克隆位点中构建重组质粒， b.重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，进行重组蛋白的表达， c.重组蛋白转化体的纯化收集。
3.如权利要求2所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于在所述的步骤(a)所述的酶切为:在GM-CSF的基因序列两端添加酶切位点Nde I和Nco I，在TAT的基因序列两端添加酶切位点Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列两端添加酶切位点BamH I和Xho I。
4.如权利要求2所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于:通过N1-NTA柱分离纯化所述的重组蛋白。
5.一种权利要求1所述重组蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。
6.一种权利要求1所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于将所述重组蛋白刺激诱导健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。
7.如权利要求6所述的重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于所述的重组蛋白的浓度为 25 ~100ug/ml。
8.如权利要求7 所述的重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于所述的重组蛋白的浓度为 25 ~50ug/ml。
【文档编号】C12N15/70GK103788213SQ201310684716
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2012年12月14日
【发明者】叶永清, 张超, 苏国新 申请人:上海柯莱逊生物技术有限公司