一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法
【专利摘要】本发明公开一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，包括药物干预作用、试剂配制、测量总蛋白浓度、SDS-PAGE电泳和测定溶血毒素的表达，将不同浓度的黄芩苷和黄芩素加入到含有金黄色葡萄球菌的培养基中，分别测定其总蛋白浓度，SDS-PAGE电泳进行分析，测定其溶血毒素的表达。
【专利说明】—种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物与基因【技术领域】，具体涉及一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌是引起严重感染的常见病原菌，其致病性除形成生物膜外，还包括一系列胞外毒性产物的合成和释放，其中包含了参与生物膜形成的胞外多糖粘附素、自溶素、酚溶性调节肽等，还包括金黄色葡萄球菌特有的强致病因子，如肠毒素、血浆凝固酶、杀白细胞素、溶血毒素、耐热核酸酶、中毒休克综合征毒素-1等。它们在金黄色葡萄球菌感染的相关疾病的发生发展中扮演着重要的角色。并非所有的金黄色葡萄球菌都分泌相同类型的毒素，金黄色葡萄球菌表型的不同，其所产生的毒素类型也不尽一样。
[0003]金黄色葡萄球菌的致病性是由多因子决定的复杂过程，其毒力因子产生越多，其致病性越强。毒力因子的产生受到细菌本身调控网络的调节控制，这些调控网络由许多调控系统及调控路径构成，它们既互相独立又相互影响，从而使细菌接受环境中不同的信号，并对环境的改变作出适应性的反应。
[0004]金黄色葡萄球菌肠毒素是重要的超抗原之一，可引起食物中毒、毒素休克综合征、过敏性疾病等，症状表现为恶心、呕吐、腹痛及腹泻，以肠毒素A、B和D三型最多见，它是一种热稳定的蛋白质，100°C下30分钟不被分解，且不易被胃蛋白酶所消化，非常小的剂量即可引起食物中毒，一旦食物被污染则很难去除。金黄色葡萄球菌毒力因子引起的相关性感染已经成为影响人 健康的一大威胁，而控制毒力因子调控是现今面临的最大问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的调控，实现本发明目的使用的技术方案是:一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，包括药物干预作用、试剂配制、测量总蛋白浓度、SDS-PAGE电泳和测定溶血毒素的表达，具体步骤如下，
(I)药物干预作用，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种至3ml含0.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，35^37 0C >250rpm/min培养12h，后接种到300mlTSB液体培养基中放大培养，培养至0D_=0.3分成N份，分别加入黄芩苷和黄芩素，加入黄芩苷的浓度为(T1/2MIC，加入黄芩素的浓度为(T1/2MIC，置于 35~37°C、250rpm/min 培养 5h 后取样，12000rpm/min 离心 5min，分离菌体和上清液，上清液用0.22 μ m滤膜过滤,备用；
测定最低抑菌浓度MIC，在无菌的96孔细胞培养板的第I至第10孔加入步骤(3)菌液，加入菌液的量为100 μ I,再将的黄岑苷和黄岑素分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第I至第10孔，第I孔加入量为50μ 1，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为菌液的生长对照孔，第12孔为TSB-G培养基，静置于35~37 °C培养24h，获得黄芩苷和黄芩素最低抑菌浓度MIC，最低抑菌浓度(MIC)的判定:96培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC。[0006](2)试剂配制，配制10%过硫酸铵、12%的分离胶、浓缩胶、封闭液和显影定影液；
(3)测量总蛋白浓度，取10μ I 5mg/ml牛血清白蛋白用TSB液体培养基稀释至100 μ 1，后按O、1、2、4、8、12、16、20 μ I分别加到96孔板，加入TSB液体培养基将体积补足至20μ I,再取20 μ I步骤(1)获得的上清液，加入到上述各孔中，后各孔加入200 μ IBradford染色液，震荡混匀5min用酶标仪测定A595,根据标准品测得数值绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出上清液的总蛋白浓度；
(4)SDS-PAGE电泳，包括制备凝胶、电泳上样、转膜、封闭、孵育抗体、发光显影定影和凝胶图像分析；
(5)测定溶血毒素的表达，
O引物设计，包括上游引物和下游引物；引物序列如下
【权利要求】
1.一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，包括药物干预作用、试剂配制、测量总蛋白浓度、SDS-PAGE电泳和测定溶血毒素的表达，其特征在于，具体步骤如下， (1)药物干预作用，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种至3ml含0.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，35~37°C、250rpm/min培养12h后，接种到300mlTSB液体培养基中放大培养，培养至0D_=0.3分成N份，分别加入黄芩苷和黄芩素，加入黄芩苷的浓度为(T1/2MIC，加入黄芩素的浓度为(T1/2MIC，置于 35~37°C、250rpm/min 培养 5h 后取样，12000rpm/min 离心 5min，分离菌体和上清液，上清液用0.22 μ m滤膜过滤,备用； (2)试剂配制，配制10%过硫酸铵、12%的分离胶、浓缩胶、封闭液和显影定影液； (3)测量总蛋白浓度，取10μI 5mg/ml牛血清白蛋白用TSB液体培养基稀释至100 μ 1，后按O、1、2、4、8、12、16、20 μ I分别加到96孔板，加入TSB液体培养基将体积补足至20μ I,再取20 μ I步骤(1)获得的上清液，加入到上述各孔中，后各孔加入200 μ IBradford染色液，震荡混匀5min用酶标仪测定A595,根据标准品测得数值绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出上清液的总蛋白浓度； (4)SDS-PAGE电泳，包括制备凝胶、电泳上样、转膜、封闭、孵育抗体、发光显影定影和凝胶图像分析； (5)测定溶血毒素的表达， O引物设计，包括上游引物和下游引物； 2)提取RNA，将步骤(1)获得菌体加入0.5mlDEPC水漂洗，10000rpm/min转离心lmin，取上清液加入60 μ I 10mg/ml溶菌酶、5 μ I溶葡萄菌酶及TE buffer后震荡重悬细菌，置于35~37°C、40min裂解菌壁后，4°C、12000rpm/min离心3min,得沉淀液；加入1mlTrizol均质化5min,再加入200 μ I氯仿摇15s,混匀放置3min后,4°C、12000rpm/min离心15min ;将上层水相移至新的EP管中，加入480 μ I异丙醇，混匀后置于_20°C 20min, 4°C、12000rpm/min离心15min得沉淀，弃上清液；EP管加入lml75%酒精，摇晃使沉淀溶解，4°C、12000rpm/min离心1min得沉淀,室温晾干；加入RNase-free水溶解,测RNA浓度； 3)RNA逆转录，以2 μ g步骤2)获得的RNA为模板，具体过程及反应体系如下: 试剂用量 RNAX μ I 01igo(dT)18 1μ I DEPC水补至 12 μ I 第一步反应体系为12 μ 1，反应条件为65°C 5min，4°C 5min ； 试剂用量 40mg/L5X反应缓冲液4μ1 20U/ μ I RNA酶抑制剂 I μ I 1mMdNTP Mix 2 μ I 200U/ μ I逆转录酶 I μ I 第一步欲结合完成后加入上述试剂，使得反转录体系总体积为20μ 1，第二步反应条件为 42°C 60min,70°C 5min，最后降至 4°C ;即 cDNA ； 4)普通PCR验证，以cDNA为模板，进行普通PCR扩增，反应条件为95°C预热5min，94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，一共35个循环，最后72°C温育5min，取10 μ IPCR扩增产物，加至已加入I型核酸染料的2%琼脂糖凝胶加样孔中，在TBE缓冲液中电压为10V进行电泳25min，凝胶成像系统下观察结果并拍照；普通PCR的反应体系如下:
2 X Taq PCR Master Mix12.5 μ I 灭菌去尚子水9.5 μ I 上游引物?μL 下游引物?μL cDNA1 μ I 总计25 μ I 5) mRNA水平定量检测，荧光定量PCR试剂盒进行反应液配制，反应液配制在冰上进行，实时定量PCR仪进行扩增反应，荧光定量PCR的反应条件:95°C预变性lOmin，95°C变性15s，58°C退火60s，40个循环，在每个循环延伸阶段读取荧光信号，最后生成扩增曲线、产物溶解曲线；反应体系如下:
2 X Taq PCR Master Mix 12.5 μ I
灭菌去尚子水9.5 μ I 上游引物1μL 下游引物1μL cDNA1 μ I 总计25 μ I。
2.根据权利要求1所述的抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，其特征在于，所述的N至少为2份。
3.根据权利要求1所述的抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，其特征在于，所述的MIC是黄芩苷或黄芩素的最低抑菌浓度。
4.根据权利要求1所述的抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，其特征在于，所述的10%过硫酸铵的配制方法为将0.1g过硫酸铵溶于Iml去离子水中，避光4°C储存；所述的12%的分离胶包括3.3ml去离子水、4.0ml 30%丙烯酰胺溶液、2.5ml 1.5mol/LTris_HCl(PH8.8)、0.Iml 10%SDS、0.1ml 10% 过硫酸铵和 0.004ml TEMED ;所述的浓缩胶包括 2.7ml 去离子水、0.67ml30% 丙烯酰胺溶液、0.5mll.0mol/LTris-HCl、0.04mll0%SDS、0.04ml 10% 过硫酸铵和 0.004ml TEMED。
5.根据权利要求1所述的抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，其特征在于，所述的制备凝胶，将步骤(2)配制的12%的分离胶注入玻璃板，胶顶加入1ml去离子水，待分离胶凝固后将上层水倒出，吸干水份，再将浓缩胶溶液注入玻璃板间直至顶部后插入固定物，垂直放置待溶液凝固移除固定物，将凝胶玻璃板放入电泳槽，连接电源，在槽中加入5 X SDS-PAGE电泳缓冲液；所述的孵育抗体，将SEA —抗用TBST稀释至1:5000，将封闭好的PVDF膜放入，室温摇晃孵育Ih后，4°C培养8~12h，用TBST在摇床上洗三次，每次1min ;再将PVDF膜放入稀释为1:4000的SEA 二抗溶液中，室温摇晃孵育Ih后，用TBST在摇床上洗三次，每次10分钟。
【文档编号】C12N1/36GK104031876SQ201310748317
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】陈一强, 黄莹莹, 陈艳, 孔晋亮, 黄宏 申请人:陈一强