一种抗菌重组多肽及其表达载体的制作方法
【专利摘要】一种抗菌重组多肽及其表达载体，解决了现有的通过人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin（Lfcin）和Lactoferampin（Lfampin）的一种嵌合结构肽链（N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N）存在的生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产问题。该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ?ID?NO:2所示。本发明具有抑菌效果强，生产工艺简单，成本低，产量高，适合规模化生产的优点。
【专利说明】一种抗菌重组多肽及其表达载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种抗菌重组多肽及其表达载体。
【背景技术】
[0002]1928年，英国细菌学家弗莱明发现了青霉素，从此拉开了人类使用抗生素的序幕。抗生素自使用以来，虽然挽救了无数生命，但是抗生素具有一定的毒副作用，长期不规范使用很容易使菌、毒株产生抗药性，同时使机体免疫功能受到抑制。世界卫生组织建议，抗生素在医院内使用率不得超过30%，而中国却高达74%。
[0003]近年来，抗生素不仅在疾病防治中大量使用，在食品、卫生保健品和动物饲料等方面也被无限制使用，致使抗生素的使用效果逐年下降，一些抗药的超级病菌、抗药病毒不断涌现，给疾病防治带来极大困难，严重损害了人以及动物的健康。目前，亚洲和欧洲都成为了耐药性菌的高发地区，而在我国三级医院中，耐药性细菌发生率在30%~40%，甚至达到50%。从世界卫生组织了解到，在中国，诊断为结核病的病例当中，有6.8%为耐药性结核，远远高于大多数发达国家2%的比例。据统计资料显示，我国每年有8万人死于过度使用抗生素，7岁以下儿童因不合理使用抗生素造成耳聋的数量高达30万人。
[0004]在动物疾病防治方面，仅以奶牛乳房炎为例，我国奶牛乳房炎呈阳性率为46.4%~85.7%，发病率为20%~70%，抗生素一直是治疗奶牛乳房炎的重要手段，自从1945年试用青霉素治疗奶牛乳房炎以来，因其疗效显著而使抗生素治疗奶牛乳房炎得到了不断的发展，但是，长期大量使用抗生素不仅导致耐药性细菌的产生、治疗效果降低，同时还使奶牛免疫功能受到抑制，容易造成重复感染，更严重的是，耐药性细菌还可以通过乳汁传染给人，牛奶中残留的抗生素也会诱发人体产生超敏反应。人类正面临失去这些宝贵药物的危险，而失去这些药物的速度已经超过替代药物的开发速度，世界将进入所谓的后抗生素时代。在合理使用抗生素的同时，研制安全、高效、不易产生抗药性的新型药物替代和辅助传统抗生素成为新一代药物研究的必然要求。
[0005]如图1所示,乳铁蛋白(lactoferrin, LF)是一种铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，以乳汁特别是初乳中含量最高，具有广谱的抗菌功能，抗菌机理有别于抗生素，不易产生抗药性，应用前景及市场潜力广阔，越来越受到国内、外科研工作者的关注，但是乳铁蛋白不能单独作为抗菌药物使用，如何增强其抗菌活性成为目前研究的热点。
[0006] 如图2所示，Bolscher等通过人工合成蛋白肽的方法合成了 Lactoferampin(Lfcin)和 Lactoferampin (Lfampin)的一种嵌合结构肽链(N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N),测得该种妝抗菌活性显著高于Lactoferampin和Lactoferampin及两者混合物。合成方法是:采用Mill1-Gen9050肽链合成仪，从赖氨酸(Lys)开始先合成LFcinl7~30肽链,到N端的苯丙氨酸(Phe)结束,再通过肼解作用将C末端赖氨酸(Lys)上的保护基团(ivDde)释放,继续合成LFampin265~284肽链,通过这个方法合成的肽链含有一个C末端赖氨酸氨基化合物,两个含N末端的肽链在C末端两侧,米用RP-HPLC进行纯化，收集到的肽采用离子肼质谱(LCQ Deca XP)进行分析检验。
[0007]现有技术的缺点是:生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产。
【发明内容】
[0008]为了解决现有的通过人工合成蛋白肽的方法合成的Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)的一种嵌合结构肽链
[0009](N-FKCRRffQffRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKffILD-N)存在的生产工艺繁琐，成本昂贵，产量低，不适合规模化生产问题，本发明提供一种抗菌重组多肽及其表达载体。
[0010]本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
[0011]本发明提供的一种抗菌重组多肽，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。
[0012]本发明还提供上述的抗菌重组多肽的基因表达载体，该基因表达载体通过以下方法得到:合成抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因，将该基因与pGEM_T Easy Vector连接，转化入大肠杆菌C_感受态细胞，筛选阳性克隆测序，将序列正确的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K通过T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C600感受态细胞，筛选阳性克隆，经酶切筛选出正确连接的重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc，所述重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc经过线性化后，转化到巴斯德毕赤酵母菌中表达，所述巴斯德毕赤酵母为毕赤酵母宿主菌GS115，表达产物在培养物上清中，利用盐培养基，通过发酵罐培养可以获得较高产量，经检测，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的表达量为5mg/mL ~12mg/mL。
`[0013]本发明的有益效果是:
[0014]1、乳铁蛋白分子中的两个抗菌活性部分Lactof erampin( Lfcin^P Lactoferampin(Lfampin)均位于分子的相似区域N端,本发明根据Lfcin和Lfampin两个肽段在乳铁蛋白中的二级结构和空间排列状态，利用生物软件，设计出抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的氨基酸序列，并且合成了该抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的基因序列，同时,通过真核表达系统制备出一种具有稳定性好、抗菌作用广谱的新型抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc。由于乳铁蛋白抗菌机理的特殊性，使得该抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc具有不易产生抗药性的优点，为新型抗菌药物的研制打下坚实基础。
[0015]2、通过抗菌活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、坏死梭杆菌等细菌均具有较强的抗菌活性，与硫酸庆大霉素抗菌活性相当，表明本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc抗菌谱广泛，有希望替代抗生素使用。
[0016]3、通过金属离子影响活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的活性不受金属离子即钠、钾、钙、铁、镁离子的影响；通过酸碱度影响活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对酸碱不敏感，即在pH2~11范围内其抗菌活性不受影响；通过温度影响活性试验发现，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对温度不敏感，即在_80°C~120°C范围内其抗菌活性无变化。通过上述实验得知，本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc抗菌活性比较稳定。
[0017]4、利用盐培养基，通过发酵罐培养就可以获得较高产量，大大降低了研制成本。经检测，本发明抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的表达量为5mg/ml~12mg/mL，并且表达产物在培养物上清液中。该方法不仅成本低廉，而且生产工艺简单，适合规模化生产，有利于工业规模的分离和下游加工。因此，可以推断，这种廉价、简便、高效的制备方法为抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的产业化生产提供了条件。
[0018]5、本发明中，将第36位和第75位氨基设计为半胱氨酸，便于形成二硫键，同时在LfampinB和LfcinB两个肽链之间加入一定长度的寡肽-NA,有利于肽段的折叠。
[0019]6、本发明中所设计的基因也可以克隆到其他表达系统中表达生产，也可以利用蛋白质合成方法制备本发明中所设计的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1 为乳铁蛋白(lactoferrin, LF)的结构不意图及 Lactoferampin (Lfcin)和Lactoferampin (Lfampin)位置分布不意图。
[0021]图 2 中，图 2A 为 Lactoferampin(Lfcin)和 Lactoferampin(Lfampin)在乳铁蛋白(lactoferrin,LF)中的位置分布不意图，图 2B 为 Lactoferampin(Lfcin)和 Lactoferampin(Lfampin)的一种嵌合结构肽链
[0022](N-FKCRRffQffRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKffILD-N)的结构示意图。
[0023]图3为本发明的抗菌重组多肽的表达载体结构示意图。
[0024]图4为本发明中重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc的酶切鉴定结果图；
[0025]图中:M 为 DNAMarkerDL2000，I 为重组质粒 pPIC9K-Lfa-NA_Lfc EcoR V酶切。
[0026]图5为本发明中酵母转化子的PCR鉴定结果图；
[0027]图中:M为IOObp DNA Ladder，I为空载体pPIC9K PCR产物，2为酵母转化子PCR产物。
[0028]图6为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对大肠杆菌抑菌检测效果图。
[0029]图7为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对鼠伤寒沙门氏杆菌抑菌检测效果图。
[0030]图8为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对金黄色葡萄球菌抑菌检测效果图。
[0031]图9为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对绿脓杆菌抑菌检测效果图。
[0032]图10为本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc对无乳链球菌抑菌检测效果图。
[0033]图6至图10中:A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为不同浓度的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc (其中Ix和原倍是指50ug/ml浓度，其他数字是指50ug/ml浓度的倍数)。
[0034]图11为不同金属离子(Ca2+，Fe2+，Na+，Mg2+，K+)对本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc活性影响抑菌检测效果图；
[0035]图中:A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为50ug/ml的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lf c，C为不同金属离子作用后的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc (C高离子浓度为50mmol/L，C中离子浓度为10mmol/L, C低离子浓度为lmmol/L)。
[0036]图12为酸碱度对本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc活性影响抑菌检测效果图；
[0037]图中:A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为50ug/ml的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，C2~Cll分别指pH2~11对应的样品。
[0038]图13为温度对本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc活性影响抑菌检测效果图；
[0039]图中:A为50ug/ml的硫酸庆大霉素，B为50ug/ml的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，其中BI~B5分别指经过-80°C、-20°C、25°C、10(rC、12(rC处理后的样品。
【具体实施方式】
[0040]一、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的设计与表达载体构建
[0041](一)材料
[0042]pGEM-T Easy Vector (Promega公司)；分泌型表达载体pPIC9K和毕赤酵母宿主菌GS115 (Invitrogen公司);大肠杆菌(上海北诺生物科技有限公司);绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和坏死梭杆菌(国家兽医微生物菌种保藏中心)JaKaRaLA Taq DNA聚合酶、dNTP Mixtures、DNA Ladder Marker (15000)、DNA Ladder Marker (2000)、蛋白质分子量标准(低)、蛋白质分子量标准、琼脂粉、甘氨酸(宝生物工程有限公司)；限制性内切酶(Hind II1、SnaB 1、EcoR 1、EcoR V、Sail、Dra I )、T4DNA Ligase、KlenowFragment、小鼠牛小肠喊性憐酸酶(MBI Fermentas公司);D_山梨醇和L-谷氨酸(Amresco);D_生物素、L-亮氨酸、L-赖氨酸和L-蛋氨酸(上海生工生物工程公司);氨基糖苷类抗生素G418 (GIBC0公司);酵母氮源碱(Difco公司);Tris饱和酹和Biospin胶回收试剂盒(杭州博日公司);BCA试剂盒(上海生工生物工程公司);酵母提取物和胰化蛋白胨(英国0X0ID);氨苄青霉素和硫酸庆大霉素(华北制药)；NaCl、氯仿、甲醇和无水乙醇(北京化工厂)；LiCl (国药集团化学试剂有限公司)；羧苄青霉素(美国INALCO公司)；SDS (电泳级)、Pepsinl (胃蛋白酶1:10000), PEG3350 (ff/V)、L-异亮氨酸和Salmon spermDNA (Sigma公司);其他常规试剂均为进口或国产分析纯。
[0043] (二)主要仪器
[0044]PTC-100型PCR仪(MJResearch公司)；W_9403C型紫外透射仪(北京六一仪器厂)；79-B-60型电热恒温培养箱(吉林省农安县柴岗医疗器械厂)Centifuge5415R型低温冷冻离心机(EPPEND0RF公司)；DYY_10C型电泳系统(北京六一仪器厂)；ALPHA2-4LP Plus型冷冻干燥机(CHRIST公司)；AKTA PurifierlO蛋白纯化系统(美国GE Healthcare公司)。
[0045](三)技术实施方案
[0046]如图3所示，本发明利用巴斯德毕赤酵母中分泌型表达载体PPIC9K的SnaBI多克隆位点，将合成的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因插入到分泌型表达载体pPIC9K中，转化入毕赤酵母宿主菌GS115，筛选到G418高抗性的甲醇利用型Mut+转化子。
[0047]以合成的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因序列为模板，以P1、P2为上、下游引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，与pGEM-T EasyVector连接，转化入大肠杆菌(:_感受态细胞，筛选阳性克隆测序；用限制性内切酶EcoR I酶切重组质粒ΤΕ-Lfa-NA-Lfc,回收Lfa-NA-Lfc片段,用Klenow Fragment酶补平；巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K用限制性内切酶SnaB I酶切回收，2种回收产物经T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C_感受态细胞；提取重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc，通过限制性内切酶EcoR V酶切鉴定出正向连接克隆质粒，用P2、P3引物对其进行PCR扩增，PCR扩增产物送交生物公司测序；将重组质粒口?1091(-1^&-熟-1^(3用限制性内切酶5&11酶切后回收，立即转化入制备的毕赤酵母感受态细胞，筛选His+转化子；将筛选到的His+转化子培养物均匀涂布于含不同浓度G418的YPD平板培养至单菌落出现，挑取含高浓度G418培养板中生长出的单菌落分别接种在丽平板和MD平板上，30°C培养观察，筛选Mut+表型转化子；提取Mut+表型转化子的DNA，以P3、P2作为上、下游引物，同时以转化有pPIC9K载体的酵母DNA作为阴性对照，进行PCR扩增鉴定，实现组合的Mut+表型转化子。
[0048]1、抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的设计
[0049]本发明根据美国国家生物技术信息中心(GenBank)中已报道的乳铁蛋白基因(登录号匪180998 )序列，利用生物软件设计出本发明的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc，为使LfampinB和LfcinB两个肽链能正确折叠并呈现出原有的结构特性,对这两个肽链中的个别氨基酸进行了替换，并将第36位和75位氨基设计为半胱氨酸，便于形成二硫键，同时在LfampinB和LfcinB两个肽链之间加入一定长度的寡肽-NA,有利于肽段的折叠。
[0050]抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc的氨基酸序列为:
[0051]
【权利要求】
1.一种抗菌重组多肽，其特征在于，该抗菌重组多肽的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌重组多肽，其特征在于，所述抗菌重组多肽的表达量为 5mg/ml ~12mg/ml。
3.如权利要求1所述的一种抗菌重组多肽的基因表达载体，其特征在于，该基因表达载体通过以下方法得到:合成抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因，将该基因与pGEM-T EasyVector连接，转化入大肠杆菌(:_感受态细胞，筛选阳性克隆测序，将序列正确的抗菌重组多肽Lfa-NA-Lfc基因与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K通过T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌C_感受态细胞，筛选阳性克隆，经酶切筛选出正确连接的重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc。
4.根据权利要求3所述的基因表达载体，其特征在于，所述重组质粒pPIC9K-Lfa-NA-Lfc经过线性化后，转化到巴斯德毕赤酵母菌中表达。
5.根据权利要求3所述的基因表达载体，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母为毕赤酵母宿主菌GS115。
【文档编号】C12R1/84GK103724435SQ201310749969
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】苗青青 申请人:苗青青