鸡外周血单核淋巴细胞pd-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子病理学与免疫学【技术领域】，具体涉及鸡外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。通过采集雏鸡淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；采用普通PCR扩增PD-1目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；将PD-1目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，按拷贝浓度绘制成标准曲线；根据荧光信号变化及标准曲线测出PD-1的基因丰度。本发明的PD-1基因丰度实时检测方法具有检测通量高、敏感性高、特异性强、操作简便、成本低及定量准确等优点。
【专利说明】鸡外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子病理学与免疫学【技术领域】，具体涉及鸡外周血单核淋巴细胞ro-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起雏鸡的一种急性、高度接触性传染病。研究表明，IBDV感染后可引起机体的免疫抑制状态和持续性感染。病毒感染的靶器官为法氏囊，病毒在B细胞内复制导致法氏囊淋巴滤泡损伤、破坏，B淋巴细胞溶解。同时，病毒在法氏囊单核-巨噬细胞系统内复制导致炎性介质的大量分泌、病毒扩散和损伤加剧，形成败血性休克综合征，导致严重的B细胞免疫反应抑制，并加剧了病鸡的死亡。另外，IBDV感染后前B淋巴细胞增殖的抑制和凋亡的发生，也是造成体液免疫抑制的重要原因。
[0003]程序性死亡分子I (programmed death-1, F1D-1或0)279)是免疫球蛋白超家族成员之一，最早在T细胞杂交瘤细胞凋亡调节研究中发现，Ahmed及其同事在LCMV慢性感染小鼠模型中证实，PD-1是τ细胞表面的一种抑制性受体，阻断ro-1与其配体的结合可以使病毒持续性感染时功能障碍或衰竭的CD8+ T细胞功能恢复。经研究证实，当T细胞受到一些激活因素刺激后，PD-1能够被 诱导表达在⑶4+、⑶8+ T细胞、自然杀伤性T细胞、B细胞、单核细胞及树突状细胞等表面。在免疫调节方面，PD-1与其配体ro-Ls共同介导ro-l = PD-Ls信号通路的激活，在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，对抗原特异性T、B细胞的功能、T细胞的增殖、细胞因子的分泌和杀伤能力都有抑制作用，阻断该通路后可以恢复T细胞的大部分功能。经相关研究证实，一些病毒的感染可以诱导ro-1及其配体ro-Ls的表达从而影响ro-l:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系统的监视与杀伤，引起机体产生免疫抑制和持续性感染。因此，PD-1及其配体ro-Ls近年来逐渐成为人们在慢性持续性病毒感染、免疫耐受性疾病、肿瘤等免疫抑制性疾病研究中所关注的热点，而在动物免疫抑制性疾病或病毒持续性感染方面，T细胞免疫抑制性受体ro-l = PD-Ls的研究才刚刚起步，特别是在家禽类该方面的研究还少见报道。
[0004]近年来，荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术为基因丰度检测提供了全新的方法，和传统的方法相比，该方法具有敏感性高、特异性强、操作简便、成本低以及定量准确等优点被广泛应用，它可以通过检测目标序列PCR扩增的荧光信号强度达到实时监控的目的；然而对鸡外周血单核细胞中ro-l基因丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于:本发明提供了一种鸡外周血单核淋巴细胞ro-1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法；在此基础上本发明建立了一种ro-1基因丰度的实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；
本发明通过研究外周血单核细胞中ro-1的变化规律，为鸡ro-1分子检测的定量分析提供了技术平台，并能用于分析鸡感染免疫抑制性疾病如IBD后ro-1基因的转录水平的变化规律。
[0006]本发明的技术方案:
鸡外周血单核淋巴细胞ro-1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，包括以下步骤:
采集雏鸡的外周血，分离出淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20°C，备用；采用普通PCR方法扩增ro-l目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，然后将ro-l目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5 α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；
普通PCR扩增时的反应体系为25 μ L，反应体系如下:2 μ L样品cDNA模板，2.5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTP，浓度均为20μπιο1/1的正向引物和反向引物各0.5 μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水；
其中，正向引物 F 为:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'，
反向引物 R 为:5' -TCTTTCC TCGCTCTGGTGTG-3'。
[0007]所述目的基因片段为序列表中的SEQ ID N0.1序列。
[0008]其中普通PCR扩增时的反应程序为:95°C热启动Imin ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30个循环，最后72°C延伸IOmin0
[0009]一种鸡外周血单核淋巴细胞ro-1基因的丰度实时检测方法，包括以下步骤:
(1)将回收纯化的ro-l目的基因片段与pMD18-T载体连接，然后转化至感受态细胞DH5a中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与ro-l目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，测定标准品质粒的DNA浓度，并换算成质粒的拷贝浓度，按I: 10倍的浓度梯度稀释阳性质粒；
(2)以稀释的阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，反应结束后绘制出标准曲线，然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出样品DNA中ro-1的基因丰度；
其中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20 μ L，包括2 μ L质粒模板，浓度均为20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2yL，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6μ L ；
其中，正向引物 F 为:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'，
反向引物 R 为:5' -TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
[0010]所述目的基因片段为序列表中的SEQ ID N0.1序列。
[0011]其中实时荧光定量PCR反应程序为:95°C热启动30s ;94°C变性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C时收集荧光信号，再40个循环。
[0012]采用的实时荧光定量PCR仪为ABI 7500 Fast型荧光定量PCR仪。
[0013]所述稀释的阳性质粒浓度范围为4.36X 1010-4.36X IO1 copies/μ L ;所述标准曲线的相关系数R2=1.0，斜率为-3.484。
[0014]所述的检测方法在分析鸡感染免疫抑制性疾病后ro-1基因的转录水平变化规律中的应用。
[0015]本发明的积极有益效果:
本发明建立了鸡外周血单核细胞中ro-1基因丰度的实时荧光定量PCR的方法，为更好地对鸡免疫抑制状态下ro-1的转录水平进行准确定量，进而研究外周血单核细胞中ro-1的变化规律，为鸡ro-1分子检测的定量分析提供了技术平台，并为ro-1在鸡免疫抑制性疾病中发挥的生物学功能及其应用机制奠定基础。
[0016]本发明所公开的技术方案与传统技术相比，PD-1检测的敏感性较高，利用所建立的方法对IO9~lOkopies/y L的9组不同浓度标准阳性质粒进行检测，结果显示:本发明中ro-l的检测下限为10 copies/μ L，其浓度与Ct值之间有较好的线性关系，相关系数R2=I ;利用建立的方法进行重复性试验,组内和组间重复性试验结果表明,变异系数均在3%以内，具有较好的重复性；从溶解曲线图可知，ro-Ι分子溶解曲线出现单一狭窄峰(图4)，且琼脂糖凝胶电泳分析表明，Real-time RT-PCR扩增结果为单一特异性目的片段(图5)，说明本发明具有较好的特异性；另外本技术方案还具有检测通量高、操作简便、成本低以及定量准确等特点。
[0017]本发明通过实验证实，鸡传染性法氏囊病病毒IBDV感染后，随着病毒在机体内复制ro-Ι的表达量逐渐升高，说明IBDV的感染及病毒载量与鸡ro-1基因丰度的变化关系十分密切；并证实了鸡IBDV感染后ro-l表达变化与IFN- y、IL-2细胞因子的表达变化之间存在一定关系，鸡ro-Ι表达升高后激活了 ro-1 =PD-Ls信号通路，引起了鸡τ细胞免疫功能和增殖活性的下降，导致康复鸡或亚临床感染鸡免疫抑制反应的持续存在。
[0018]本发明的鸡ro-1基因实时荧光定量PCR检测方法，为检测鸡感染免疫抑制性疾病(如鸡传染性法氏囊病IBD、鸡马立克氏病MD、鸡传染性贫血CIA、鸡白血病ALD和鸡网状内皮组织增生病RE等)所导致的免疫抑制状态中ro-1的表达变化规律提供了技术平台，进一步丰富了鸡免疫抑制性疾病引起免疫抑制的机理。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为琼脂糖凝胶检测鸡ro-1基因扩增结果；
图2为鸡ro-1实时荧光定量分析扩增曲线；
图3为鸡ro-1实时荧光定量分析标准曲线；
图4为鸡ro-1实时荧光定量分析标准品溶解曲线；
图5为鸡ro-1实时荧光定量产物特异性分析结果；
图6为鸡感染IBDV不同时期τ细胞中ro-1基因的拷贝数；
图7为鸡感染IBDV不同时期体内IBDV病毒载量半定量PCR检测结果；
图8为鸡感染IBDV不同时期IFN-Y基因的拷贝数；
图9为鸡感染IBDV不同时期IL-2基因的拷贝数；
图10为实验组鸡感染IBDV康复后胸腺T细胞增殖活检测；
图11为对照组鸡感染IBDV康复后胸腺T细胞增殖活检测。 [0020]【具体实施方式】在本发明中，基因拷贝数、基因丰度代表同样的概念；Real-time PCR、实时荧光定量PCR表不同样的概念；ddH20表不双蒸水；IBDV表不鸡传染性法氏囊病病毒；CFSE为一种可以标记活体细胞的突光染料。
[0021]实施例中的实验动物和菌种:1日龄健康雏鸡，SPF隔离器中饲养至4周龄；IBDV，LD50IOV0.1 mL，为本实验室分离并保存；大肠杆菌感受态细胞DH5 α，为本实验室保存。
[0022]主要试剂和仪器:淋巴细胞分离液，购自天津灏阳生物制品科技有限公司；IBDV快速检测试纸条，购自河南百奥生物工程有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒、pMD 18-T载体，均购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Green I,购自Invitrogen公司。
[0023]实施例1鸡ro-l实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建
采集4周龄雏鸡外周血，参照淋巴细胞分离液的说明书分离外周血的淋巴细胞，参照Invitrogen公司TRIzoI试剂盒说明书和相关文献进行总RNA的提取，将提取的总RNA参照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，保存于_20°C，用于扩增ro-l目的基因片段的模板。
[0024]采用普通PCR方法扩增ro-1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，然后将ro-l目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5 α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；
所述目的基因片段为序列SEQ ID N0.1:
GGACTACGGTGTGCTGGAGTTCCAACGGGACCCACACAGCCAGGTGCCCCTCGAGACCTGCCCAGCCGAGCAGACCGAGTATGCCACCATCGTCTTCCCTGAGGAGAAACCCATCACACCAGAGCGAGGA AAGA。
[0025]用以构建ro-l实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的普通PCR反应体系:
普通PCR反应体系为25 μ L，反应体系如下:2 μ L样品cDNA模板，阴性对照以无菌三
蒸水为模板，2.5μ L 的 IOXPCR Buffer,2y L dNTP，正、反向引物各 0.5 μ L (20Mmol/L),
0.5yL Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程公司)，以无菌三蒸水补足25 μ L ;将反应体系轻柔混合，于普通PCR仪中进行扩增反应。
[0026]普通PCR程序为:95°C热启动Imin ;94 °C变性30s ;55 °C退火30s ;72 °C延伸30s, 30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0027]鸡ro-l实时荧光定量PCR引物由某生物公司合成，引物序列如下:
正向引物 F: 5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'；
反向引物-TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
[0028]将普通PCR产物进行2%的琼脂糖电泳分析，电压100V，35min后在紫外灯下观察产物，结果显示扩增出单一条带，片段大小在IOObp左右。
[0029]扩增结果见附图1，图中M为DL2000分子量标准，I为H)_l基因的扩增产物，扩增条带较清晰，无引物二聚体影响。扩增序列经克隆、测序后，在GenBank中进行核酸同源性比对，结果显示，获得的序列SEQ ID N0.1与GenBank中鸡I3D-1基因(XM422723)的序列同源性为100%，说明引物及扩增产物都正确，可用于下一步实验研究。
[0030]将特异性片段进行琼脂糖凝胶回收后，进行克隆转化，将获得的阳性克隆交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析。
[0031]实施例2鸡ro-1实时荧光定量PCR体系的建立(I)质粒DNA模板的制备
利用实施例1琼脂糖凝胶回收后的ro-l目的基因片段与pMD 18-T载体(TaKaRa，大连)连接，然后转化至感受态细胞DH5ci中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，测序结果显示与GenBank中I3D-1基因的序列100%同源，说明所获得序列正确，阳性质粒可用于质粒标准品的制作。使用微量核酸蛋白分光光度仪测定该标准品质粒的DNA浓度为135.5 μ g/mL,将初始标准品质粒溶液进行1:10倍的倍比稀释。
[0032](2)标准质粒浓度计算和鸡ro-1标准曲线的制作
提取经过测序验证的阳性克隆的质粒，将获得的质粒DNA浓度换算成拷贝数。
[0033]质粒拷贝数的计算方法:拷贝数(copies/μ L)=浓度(μ g/μ L) X 6.02 X IO23 (copies/ μ L) / MW (g/mol)。
[0034]其中MW=(克隆载体长度+目的片段长度)(bp) X660 g/mol/ bp。
[0035]已知:cDNA=135.5μ g/mL，质粒PMD18-T序列长度为2692bp，PD-l基因插入片段长度为134bp ;单个碱基的平均摩尔质量为660 g/mol，计算公式为:
分子量(MW)= (2692+134) X 660=1.87 X IO6 g/mol。
[0036]质粒拷贝浓度:6.02X IO23X ( 135.5X 10_9)+ (1.87X 106)=4.36X IO10 copies/μ L0
[0037]将上述已知拷贝浓度的质粒溶液作为标准质粒，在进行Real-time PCR标准曲线绘制时按1:10倍梯度稀释(浓度范围为4.36X IO1c1UexiO1 copies/μ L)。将已知拷贝数的质粒进行1:10倍梯度稀释，获得质粒标准品。
[0038]以稀释好的质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应采用Real-timePCR试剂盒SYBR PremixExTaqTM (Invitrogen公司)。反应体系为20 μ L:包括2 μ L标准质粒模板，F、R 引物(20Mmol/L)各 0.2μ L，SYBR Green I PreMix (Real-time PCR 试剂盒SYBR PremixExTaqTM, Invitrogen 公司)IOKL,三蒸水 7.6 μ L。每次 Real-time PCR 反应中均设置阴性对照(模板为2 μ LddH2OX
[0039]Real-time PCR程序为:95°C热启动30s ;94°C变性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C时收集荧光信号，再40个循环。其中的F、R引物与实施例1相同。
[0040]标准曲线及所有待测样品均设置3个平行反应。反应在ABI 7500定量PCR仪(美国Life Technologies)中进行，利用ABI 7500软件检测和收集荧光信号，并进行数据分析。ABI 7500软件实时荧光定量分析软件自行绘制出反应的扩增曲线(见附图2)。
[0041]扩增曲线显示从左至右6条曲线，依次代表标准品107、106、105、104、103、102的梯度稀释液的扩增曲线，6个质粒标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型曲线，且各循环阈值(Ct值)间隔均匀。
[0042]根据扩增曲线提供的标准品各浓度梯度及反应的循环阈值(Ct值)，利用ABI7500软件自行绘制出反应的标准曲线(见附图3)。该标准曲线的相关系数R2=1.0，斜率为-3.484，标准曲线为Υ=_3.484Χ + 41.381，其中Y为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X为PD-1基因构建的标准质粒拷贝数对数值。计算其扩增效率为Eff%=93.643%，符合ABI 7500荧光定量分析对标准曲线的要求。
[0043]测定各浓度稀 释梯度的标准品在实时荧光定量PCR过程中的溶解温度，并绘制溶解曲线(见附图4)。标准品及样品的溶解曲线型峰单一，且标准品溶解温度相同(87.5±0.5°C)，表明扩增反应产物的溶解温度均一，特异性好，且无引物二聚体。
[0044]根据荧光信号的变化及标准曲线即可测出样品DNA中ro-l的基因丰度。
[0045]实施例3:鸡ro-l实时荧光定量PCR体系的敏感性、特异性及重复性分析
采用实施例1构建的鸡ro-Ι重组质粒作为阳性重组标准质粒，采用实施例2所建立的鸡ro-l实时荧光定量PCR检测体系；实时荧光定量PCR仪采用Life Technologies公司(美国)生产的ABI 750荧光定量PCR仪。用1:10倍系列稀释的101~IO109 copies/μ L鸡PD-1阳性重组标准质粒做敏感性试验。结果表明，PD-1的检测下限为10 copies/μ L0
[0046]对鸡ro-l分子Real-time-PCR溶解曲线(见附图4)及产物琼脂糖凝胶电泳做特异性分析，结果表明，溶解曲线出现单一狭窄峰，能够扩增到与预期目的片段同样大小的特异性片段，没有生成非特异性的产物和引物二聚体(见附图5)。
[0047]用本发明建立的方法分别进行批内和批间重复性检测，结果显示，批内和批间的变异系数小于3%，重复性良好(见表1)。
[0048]表1鸡ro-l实时荧光定量PCR方法批内与批间重复性评价结果
【权利要求】
1.鸡外周血单核淋巴细胞ro-1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 采集雏鸡的外周血，分离出淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20°C，备用；采用普通PCR方法扩增Η)-1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，然后将ro-Ι目的基因纯化片段与PMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5 α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒； 普通PCR扩增时的反应体系为25 μ L，反应体系如下:2yL样品cDNA模板，2.5yLIOXPCR Buffer,2y L dNTP，浓度均为20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5μ L，0.5μ L的TaqDNA聚合酶，其余为无菌三蒸水； 其中，正向引物 F 为:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'， 反向引物 R 为:5' -TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于:所述目的基因片段为序列表中的SEQID N0.1 序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于:其中普通PCR扩增时的反应程序为:95°C热启动Imin ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，30个循环，最后72°C延伸IOmin0
4.一种鸡外周血 单核淋巴细胞ro-1基因的丰度实时检测方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)将回收纯化的ro-l目的基因片段与pMD18-T载体连接，然后转化至感受态细胞DH5a中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与ro-l目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，测定标准品质粒的DNA浓度，并换算成质粒的拷贝浓度，按I: 10倍的浓度梯度稀释阳性质粒； (2)以稀释的阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，反应结束后绘制出标准曲线，然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出样品DNA中ro-1的基因丰度； 其中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20yL，包括2yL质粒模板，浓度均为20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2yL，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6μ L ； 其中，正向引物 F 为:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'， 反向引物 R 为:5' -TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
5.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于:所述目的基因片段为序列表的SEQ ID N0.1序列。
6.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于:实时荧光定量PCR反应程序为:95°C热启动30s;94°C变性5s;60°C退火和延伸34s，60°C时收集荧光信号，再40个循环。
7.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于:实时荧光定量PCR反应时采用的实时荧光定量PCR仪为ABI 7500 Fast型荧光定量PCR仪。
8.根据权利要求4-7任一项所述的丰度实时检测方法，其特征在于:所述稀释的阳性质粒浓度范围为4.36X 1010-4.36 X IO1 copies/μ L ;所述标准曲线的相关系数R2=L 0，斜率为 _3.484。
9.权利要求4-7任一项所述的检测方法在分析鸡感染免疫抑制性疾病后ro-1基因的转录水平变化规律中的应用。
【文档编号】C12N15/66GK103789432SQ201410037329
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】王选年, 孙国鹏, 王爱国, 朱艳平, 张艳芳, 岳锋, 李鹏, 张万方, 李博文, 杨媛, 阮涛, 王军 申请人:新乡学院