一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途
【专利摘要】本发明公开了一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测。在63℃条件下进行LAMP反应20分钟后，LAMP产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳显示呈阶梯状图案。该方法具有高特异性，高灵敏度，时间短且操作简便的特点。
【专利说明】一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的 试剂中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘 无浆体病原的试剂中的用途。
【背景技术】
[0002] 牛边缘无浆体病是一种由边缘无浆体经蜱传播的专性寄生于红细胞内的血液传 染疾病,主要引起牛、羊等反刍动物发病，。其特征为高热、贫血、消瘦、黄疸和胆囊肿大并 广泛分布于世界热带和亚热带地区引起奶牛和肉牛产业相当大的经济损失（Katherine et al.，2010)。检测牛边缘无浆体的常见基因包括16S rRNA，热休克蛋白（groEL基因） (Lew et al.，2003)，主要表面蛋白-Ia(Mspla) (Lew et al.，2002;Molad et al.，2004), Msp4(Molad et al·，2004)和 Msp5(Molad et al·，2004 ;Corona et al·，2009)。牛边缘 无浆体主要表面蛋白Msp5是由633bp单拷贝基因编码高度保守的19ku的蛋白，在免疫印 迹试验中通过与单克隆抗体表面蛋白结合，Msp5 ANAF16C1证明在已知的无楽体属的几个 亚种中是高度保守的（Visser et al. ,1992 ;Ybafiezet al. ,2012)。因此，Msp5可以作 为一种有效的诊断抗原。传统的检测边缘无浆体Msp5基因的方法是竞争性酶联免疫吸 附法（CELISA) (Strik et al·，2007 ;Echaide et al·，1998)竞争抑制性酶联免疫吸附法 (CI-ELISA) (NI et al.，2011)，间接荧光抗体试验（IFAT) (0ΙΕ，2009)，套式PCR法（Echaide et al.，1998)，实时荧光定量 PCR(Picoloto et al.，2010)和半套式 PCR 测定法（Singh et al.，2012)。但是这些方法还有许多缺陷，例如，它们必须在实验室进行并且反应需要 很长的时间。自2000年以来，Notomi开发出了环介导等温扩增方法（LAMP)，在恒温条件 (60°C _65°C )下，不到Ih的时间里进行核酸扩增，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物 易检测等优点。环介导等温扩增技术已经广泛应用于快速检测动物病原（病毒、细菌、寄生 虫）（Tomita et al.，2008)。然而，使用LAMP技术诊断牛边缘无浆体病尚未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种环介导等温扩增引物在 制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，根据牛边缘无浆体保守基因 Msp5设计了引 物，评估LAMP技术的检测方法。
[0004] 其具体技术方案为：
[0005] -种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，
[0006] 特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名 为Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名 为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物 Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测；
[0007]
【权利要求】
1. 一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，其特征在 于， 特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为 Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名 为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物 Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测； Msp5-F3b ACCTTCTGCTGTTCGTTG Msp5-B3b GAGAAGCCATGCCTAACTC Msp5-FIPb GTTGAAAGACGCGGAGGCTAAATCGGCGA (Flc+F2) GAGGTTTAC Msp5-BIPb CCGTCAGTAGCGGCGATTTGTACTTACAGG (Blc+B2) CTGAGAAGC Msp5-LFb TGCCCTCACTTACAACTTCG Msp5-LBb CGGCAAGCACATGTTGGTA。
2. 根据权利要求1所述的环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂 中的用途，其特征在于，采用以下步骤完成： LAMP反应体系是25 μ L，包括0. 4 μ Μ外引物，1. 6 μ Μ内引物，0. 8 μ Μ环引物，1 μ LDNA 样品，硫酸缓11111(11'01:>]\^11111111，11111]1甜菜喊，2.5 4 1^10\11161'1]1(^〇1131^€61'111的138七0嫩聚 合酶，加 ddH20共25 μ L ;混匀后，加入20 μ L油混匀并离心；在PCR管的中下部加入0. 5 μ L SYBR GREEN I染料然后轻轻盖上，以防止SYBR GREEN I染料降入管底；将混合物在63°C下 恒温反应20分钟；反应后，在光亮视野下观察到混合物与SYBR GREEN I染料在PCR管中的 颜色变化，并在紫外线照射下365nm处也可观察到；之后LAMP产物3 μ L用0. 8 %琼脂糖凝 胶电泳分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104293936SQ201410509621
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】倪宏波, 王欣, 王云光, 安先全, 蒋慧婷 申请人:黑龙江八一农垦大学