专利名称：三嵌段共聚物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及结合强度特别高、分子量在2000道尔顿至200000道尔顿的范围内且符合通式(1)的三嵌段共聚物， 通式(1)式中，R1是H、CH3、C2H5或C6H5；R2是H、CH3、C2H5或C6H5，上述两位置上的R2可相同或不同；X是酯键或酰胺键；m为3至500；n为2至50；L是OH、NH2、OCH3或NHCH(CH3)2；Y是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖(erythrolose)、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素或直链淀粉，本发明还涉及制备通式(1)的三嵌段共聚物的简单有效方法和预防和/或治疗微生物感染的方法，所述方法包括以下步骤使微生物接触通式1的三嵌段共聚物，然后该聚合物与微生物结合，从而抑制微生物感染。
背景技术：
许多生物学活动涉及配体与宿主受体的多价结合。碳水化合物能够与蛋白质相互反应，导致许多生物学上重要的活动，诸如细胞粘附、细胞识别、免疫测定和受精作用。近来人们已经开始认识到碳水化合物在生物学相关识别过程中的重要性。(Feizi等人，Biochem.J.2451，1987)。
Belvilacqua等人(Science 2431160，1989)证明了碳水化合物与蛋白质和核酸一起作为主要的生物信息载体。Rouhi，A.M.，(Chem.Engg.News，Sept.23，62-66，1996)报导了碳水化合物在各种生物过程如细胞识别、细胞粘附、细胞分化、炎症、病毒和细菌感染、肿瘤发生和转移中有重要作用。鉴定到如酶、蛋白质和病毒之类的碳水化合物的各种靶，可在治疗学中有许多应用。Sharon等人(Science 246227-234，1989)提出糖偶联分子中的碳水化合物部分在生物学中是一种重要的实体。
碳水化合物修饰的主要优点是几乎不会影响其物理性质如溶解性、稳定性、活性、抗体识别性和对酶易感性。可将碳水化合物结合到聚合物链中，并用于与受体结合。因而，该聚合物可以与其它含有配体的聚合物偶联而发生多价效应。
Stahl等人(美国专利6,037,467，2000)说明了通过碳水化合物部分与亲水性聚合物部分偶联来制备亲水性聚合物。
最近授予Mandeville等人的专利(美国专利5891862，1999和6187762，2001)中报导了使用含有碳水化合物的多价聚合物来治疗轮状病毒感染。Krepinsky等人(美国专利6184368，2001)提出了碳水化合物在预防感染中的应用。
大部分天然发生的相互作用，尤其是碳水化合物的相互作用被认为是低亲和力的。单价配体对于受体结合位点表现出弱亲和力和差特异性，因此需要制备多价配体来增强这种结合。所得的多价形式糖可以更强的亲和力和特异性与同样的底物结合。细胞表面受体与多价碳水化合物分子的结合与单价相互作用相比表现出广泛的生物学反应性和独有的灵敏度。(Mammen等人，Angew.Chem.，Int.Ed.，37，2754-2794，1998)。
多价相互作用的特征在于一个实体的多个配体与另一个实体的多个受体之间可同时结合。多价部分可通过识别宿主结合位点而制备，而且它们可构建成具有分子柔韧性并围绕着宿主取向的多价部分。多价相互作用的特征与其相应的单价作用的特征不同，后者涉及一对一的结合，而多价相互作用涉及宿主分子多个位点的多个配体同时结合。
包含多个配体的聚合物对于宿主细胞受体来说可能是更有效的抑制剂，因为该聚合物对于病原体具有更高的亲和力。另外，该聚合物配体的高分子量也可以通过空间排斥作用阻止感染(Spaltenstein，A.和Whitesides，G.M.，J.Am.Chem.Soc.，113，686687，1991)。Laura Kiessling和Nicola L Pohl报导了(Chemistry & Biology，371-77，1996)用来产生可用于生物识别的含有多价糖类衍生物的多价碳水化合物的新型结构模板。
需要设计一种简单的方法，来得到多分子性不同的多价配体。可通过使用多价唾液酸抑制剂来预防流感病毒引起的红血球凝结。Mammen，M.，和Whitesides，G.，M.(J.Med.Chem.3821，4179-90，1995)报导了这种新方法，该方法是用于病原体-宿主相互作用的模型。作者报道了含唾液酸的聚合物可作为流感病毒的有效抑制剂。而且，作者还提出了病毒表面和红血球之间抑制作用的两种合理机理，1)通过多价键的高亲和力结合，2)空间稳定性。
Sigal等人(J.Am.Chem.Soc.，11816，3789-3800，1996)研究了含有唾液苷(sialoside)基团的聚合物抑制流感病毒粘附红血球的作用。他们描述了增强底物配体的结合与空间因素对抑制效率的贡献。这些研究人员报导了能被开发用来抑制流感病毒的唾液酸配体。单体抑制剂的抑制作用需要较高的浓度，因为需要它们占据病毒上至少一半的唾液酸结合位点，而高分子量抑制剂只需要很少的结合，就可以实现同样的效果。过去已经报导了合成多价配体的各种方法，例如开环易位(metathesis)聚合(ROMP)。ROMP已由Gibson等人(Chem.Comm.，1095-1096，1997)和Biagini等人(Polymer，39，1007-1014，1998)用来产生组成明确的生物活性聚合物。
过去许多研究者报导了含唾液苷的聚丙烯酰胺流感病毒抑制剂的合成和评价。Whitesides和同事Mammen，M.，Dahmann，G.& Whitesides，G.M.(J.Med.Chem.38，4179-4190，1995)证明可从含活性酯基团的聚合物合成抑制流感病毒血凝作用的有效抑制剂。他们采用了各种各样的唾液酸取代的丙烯酰胺共聚物，来探索通过多价碳水化合物抑制血凝作用的机理。
根据对多价唾液苷作用模式的理解，提出了一种设计流感病毒抑制剂并了解天然多价配体可能作用机理的方法。
先前报导的聚合物大部分依据碳水化合物与聚丙烯酰胺主链结合。该主链构成的其它聚合物可能比此类聚合物更有效。合成糖类修饰聚合物的方法对其抑制效率的作用可以归结于官能团的密度。
已经将开环易位聚合(ROMP)法用在合成碳水化合物取代的物质中(Mortell，K.H.，Gingras，M.& Kiessling，L.L.(J.Am.Chem.Soc.116，12053-12054，1994)。如同丙烯酰胺聚合一样，ROMP可以使用在极性溶剂中，并且不需要保护碳水化合物残基。Jason E.Gestwicki，Laura E.Strong，Christopher W.Cairo，L.，Frederick J.Boehm和Laura L.Kiessling，Chemistry &Biology，第9卷，163-169，2002中说明了使用由开环易位聚合(ROMP)生成的聚合物作为支架来非共价性组装凝集素、四价蛋白质伴刀豆球蛋白A(Con A)的多个拷贝。
刺激反应性聚合物和相互作用分子的协同应用可产生用于各种试验、分离、处理的位点特异性偶联物，以及揭示在Hoffman；A.S.；Patrick，S(美国专利5998588，1999)中所述的其它用途。所用的相互作用分子可以是生物分子如多糖或糖蛋白、蛋白质或肽，如抗体、受体或酶，它们在合适的环境中能与配体特异性结合。本发明人制备了在特定位点偶联有识别性生物分子的刺激反应性聚合物，因而可以通过刺激来改变毗邻的结合位点如链霉亲和素的生物素结合位点、抗体的抗原结合位点或酶的底物结合位点的配体-生物分子结合，调控该聚合物。随着环境的变化，偶联于结合生物分子活性位点的聚合物的配体也必然会被逐出该结合位点。发现此类聚合物的偶联物可用于生物分子的选择性相分离或亲和性沉淀。用于此类应用的聚合物可以对合适的环境刺激具有刺激反应性。
多齿糖类取代的配体在蛋白质碳水化合物识别过程中的确显示出亲和力和特异性的增强。Kiessling，L.L.；Pohl，N.L.Chem.& Biol.1996，3，71-77)报导了多价配体与细胞表面受体的结合，该结合引起了不同于单价相互作用的生物学反应、多价相互作用。
因此，用旨在提高相互作用的明确的多价配体来合成三嵌段共聚物的方法提供了一种探索生物学重要过程的手段。一般来说，结合的表位密度高将导致每个聚合物结合更多数目的受体、簇集速率更快和受体间距离缩短。含低密度结合表位的配体在结合表位中是最有效的。而且，这些结果提供了设计用于控制受体-受体相互作用的配体的想法，即可模拟人与天然多价配体结合于底物的机理。
Damschroder等人(美国专利2,548,520，1951)揭示了通过蛋白质与不饱和单体偶联或蛋白质与预形成的聚合物偶联的共聚反应来制备高分子量物质。这些高分子量物质的合成一般需要高达100℃的温度。对于大部分蛋白质来说，这样的高温是不能忍受的。因此，所述的方法不适用于产生生物活性分子的聚合物。
如NAG等碳水化合物可用作血凝素和溶酶体的配体。Roy等人(J.Chem.Soc.Chem.Comm.，1611-1613，1992)报导了通过三元聚合反应合成的专门(custom)设计的糖聚合物(glycopolymer)。利用N-丙烯酰基前体和丙烯酰胺作为效应分子，以提供特定的性质例如疏水性和模拟蛋白质的酪氨酸残基。
Mochalova等人(Antiviral Research，23，179-190，1994)报导了结合于聚合物或脂质体载体上的碳水化合物抑制剂如唾液酸。使甘氨酰氨基苄基唾液苷与丙烯酸和丙烯酰氨的共聚物和葡聚糖偶联。评价了这些聚合物配体结合细胞培养物中流感A和流感B病毒株的能力。
Dimick等人(J.Am.Chem.Soc.，121，44，10286，1999)探索了基于提高相互作用的新方法。报导了多价配体的合成，证明了糖苷簇在提高与植物凝结素伴刀豆球蛋白A的结合中的作用。
在另一个方法中，Kanai等人(J.Am.Chem.Soc.，1999，9931-9932，1997)报导了通过开环易位聚合(ROMP)使多价甘露糖与伴刀豆球蛋白A结合。但是该方法比较复杂，并且不能控制糖聚合物的“生命”特性。
Yamada等人(Macromolecules，32，3553-3558，1999)报导了两性嵌段共聚物与侧链N-乙酰葡糖胺(NAG)残基通过活性阴离子聚合进行的受控合成。共聚物结构使麦芽凝集素(WAG)和NAG之间的结合得到增强。
Krepinsky等人(美国专利6184368，2001)报导了通过对含有一种糖基化剂或糖基化剂的混合物且受到部分保护的多糖进行糖基化反应来合成多价碳水化合物分子的方法。该专利解释了脱乙酰壳多糖与溶菌酶的无效结合。
脱乙酰壳多糖(通式4)是直链二元杂多糖，由2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc；A-单元)和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，D-单元)组成。溶菌酶的活性位点包含称为为A-F的亚位点。脱乙酰壳多糖序列与溶菌酶的专一结合开始于亚位点C中的NAG单元的结合。而且，衍生自葡萄糖的天然配体对微生物繁殖易感。需要合成不会被溶菌酶水解的类似于脱乙酰壳多糖重复单元的配体。预计这些聚合物比壳多糖和脱乙酰壳多糖更稳定。
通式(4)脱乙酰壳多糖除了配体的类型，配体沿聚合物链的分布在影响抑制效率中也起着重要作用。
本发明提供用于生物分子靶标的三嵌段共聚物及其合成方法，该三嵌段共聚物表现出对于靶酶的选择性结合。
发明目的本发明工作的主要目的是合成含有多价配体的三嵌段共聚物，以提高与底物的相互作用的。
本发明的另一个主要目的是提供简单新颖的制备三嵌段共聚物的方法，所述三嵌段共聚物包含表现出多价相互作用的多价NAG。本方法的优点非常突出，可用NAG进行说明。
本发明的另一个目的是提供含有NAG的三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物如其结合常数Kb值所显示的那样能与溶菌酶更有效地结合，和如I50值所显示的那样能更有效地抑制溶菌酶。
本发明的另一个目的是提供可应用在医学和生物技术中的三嵌段共聚物。
本发明的另一个目的是提供制备含有多价配体NAG、甘露糖、半乳糖或唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素和直链淀粉的三嵌段共聚物的简便方法。
本发明的另一个目的是提供制备含有丙烯酰基、甲基丙烯酰基或对乙烯基苯甲酰基(PVB)部分的三嵌段共聚物的简便方法。
本发明的另一个目的是提供结合分子量不同的多价偶联物的简便方法。
本发明的另一个目的是提供制备分子量不同和多价配体不同的三嵌段共聚物的简便方法。
另一个目的是提供一种制备含有NAG配体的用于增强相互作用的三嵌段共聚物的方法。
另一个目的是提供比天然聚合物如含有天然配体NAG的壳多糖和脱乙酰壳多糖更稳定的用于与生物分子相互作用的配体。
发明概述本发明涉及结合强度特别高、分子量在2000道尔顿至200000道尔顿范围内的通式(1)的三嵌段共聚物， 通式(1)
式中，R1是H、CH3、C2H5或C6H5；R2是H、CH3、C2H5或C6H5，这里，在上述两位置上的R2可相同或不同；X是酯键或酰胺键；m为3至500；n为2至50；L是OH、NH2、OCH3或NHCH(CH3)2；Y是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素或直链淀粉，本发明还涉及制备通式(1)的三嵌段共聚物的简单有效的方法和预防和/或治疗微生物感染的方法，其中所述方法包括以下步骤使微生物接触通式1的三嵌段共聚物，然后通过该聚合物与微生物的结合而抑制微生物感染。
发明的详细说明因此，本发明涉及结合强度特别高、分子量在2000道尔顿至200000道尔顿范围内的通式(1)的三嵌段共聚物， 通式(1)式中，R1是H、CH3、C2H5或C6H5；R2是H、CH3、C2H5或C6H5，这里，在上述两位置上的R2可相同或不同；X是酯键或酰胺键；m为3至500；n为2至50；L是OH、NH2、OCH3或NHCH(CH3)2；Y是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素或直链淀粉，本发明还涉及制备通式(1)的三嵌段共聚物的简单有效的方法和预防和/或治疗微生物感染的方法，其中所述方法包括以下步骤使微生物接触通式1的三嵌段共聚物，然后通过该聚合物与微生物结合而抑制微生物感染。在本发明的一个具体实施方式
中，提供结合强度特别高、分子量在2000道尔顿至200000道尔顿范围内且符合通式(1)的三嵌段共聚物， 通式(1)式中，R1是H、CH3、C2H5或C6H5；R2是H、CH3、C2H5或C6H5，这里，在上述两位置上的R2可相同或不同；X是酯键或酰胺键；m为3至500；n为2至50；L是OH、NH2、OCH3或NHCH(CH3)2；Y是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素或直链淀粉。在本发明的另一实施方式中，所述三嵌段共聚物如权利要求1所述，所述共聚物是稳定且有用的。
在本发明的另一个具体实施方式
中，所述共聚物的结合强度与单独的配体相比提高了约11000倍。
在本发明的另一个主要实施方式中，提供一种制备通式1的三嵌段共聚物的简单有效的方法，所述方法包括以下步骤·将两端含有两个官能团的通式3的聚合物溶解在溶剂中，·以双官能团对多价低聚物约1∶2的比例将通式2的多价低聚物加入到步骤(a)中溶解的聚合物中，得到反应混合物，·以约1∶1的比例将偶联剂加入到该反应混合物中，以引发反应，·使反应在15℃至45℃的室温下进行24小时至48小时，·在反应后，通过过滤除去未反应的偶联剂，得到三嵌段聚合物，·在15℃至45℃的室温下使三嵌段聚合物在非溶剂中沉淀，得到干燥的三嵌段共聚物。
在本发明的另一个实施方式中，A方法如权利要求4中所述，两端含有两个官能团的聚合物选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰氯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)、2-酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)甲基丙烯酸酯、丙烯酰氯、丙烯酰基吗啉、乙烯基吡咯烷酮、苯乙烯、烯丙醇和烯丙胺。
在本发明的另一个实施方式中，所述在两端含有两个官能团的聚合物含有COOH基。
在本发明的另一个实施方式中，所述含有活性端基的多价低聚物配体选自聚甲基丙烯酰基NAG、聚丙烯酰基NAG和聚乙烯基苄基NAG。
在本发明的一个实施方式中，所述含有活性端基的低聚物含有OH或NH2基。
在本发明的一个实施方式中，所述有机溶剂选自二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲亚砜。
在本发明的一个实施方式中，所用的偶联剂选自二环己基碳二亚胺(DCC)、1-环己基3-(2-吗啉代乙基碳二亚胺甲基对甲苯磺酸酯(CMC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)。
在本发明的一个实施方式中，偶联剂与聚合物的摩尔比约为1∶1。
在本发明的一个实施方式中，所述非溶剂选自丙酮、二乙醚、热水和己烷。
在本发明的一个实施方式中，提供预防和/或治疗微生物感染的方法，所述方法包括以下步骤使微生物接触通式1的三嵌段共聚物，然后通过该聚合物与微生物的结合而抑制微生物感染。
在本发明的另一个实施方式中，不可能存在耐药性。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法有助于预防和/或治疗由流感病毒、麦芽凝集素和轮状病毒引起的感染。
在本发明的一个实施方式中，微生物的相对抑制(Imax)百分率提高了约60％。
本发明的一个实施方式中，所述共聚物的结合强度与单独的配体相比提高了约11000倍。
本发明涉及含有N-乙酰基葡糖胺(NAG)的三嵌段共聚物，其分子量约为2000道尔顿至200000道尔顿，且结构如通式(1)， 通式(1)式中，R1是H、CH3、C2H5、C6H5；R2是H、CH3、C2H5、C6H5，这里，在上述两位置上的R2可相同或不同，X是酯键或酰胺键，m为3至500，n为2至50，L是OH、NH2和NHCH(CH3)2。Y可以是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素和直链淀粉。
更具体地，本发明涉及含有碳水化合物配体的所述BAB三嵌段共聚物及其制备方法。
更具体地，本发明涉及与NAG本身相比能更强结合溶菌酶的三嵌段共聚物。
上述本发明的三嵌段共聚物由如通式(2)所述的含有活性端基的低聚物与如下所示(通式3)的含有两个端基官能团的聚合物发生偶联反应、并且按照下文所述的每一步来制备，其中，通式(2)为 通式(2)
式中，R是H、CH3、C2H5、C6H5，n为2至50，Z是OH或NH2基，Y可以是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素和直链淀粉；通式3为 通式(3)式中，L是OH、NH2、OCH3、NHCH(CH3)2，R是H、CH3、C2H5、C6H5，m为3至500。
该三嵌段共聚物可用于抑制病毒感染和生物分子的回收。制备含有多价配体N-乙酰基葡糖胺(NAG)的三嵌段聚合物的方法是通用性的，可用于如唾液酸、半乳糖和甘露糖之类的其它配体。
本发明还提供一种得到可用于从溶液中分离生物分子的亲和配体的方法。在该方法中，文中所报导的三嵌段共聚物含有不同链长的活性聚合物，该活性聚合物与其它含有多价配体的活性聚合物偶联。因此，该三嵌段聚合物即使在极低的配体浓度下也表现出较高的结合常数和抑制浓度。文中所报导的聚合物是分子量适宜的三嵌段共聚物，其比目前所知的聚合物具有更宽广的聚合物结构。而且，文中所报导的含有N-乙酰基葡糖胺的三嵌段聚合物配体易于制备，能抵抗降解，可再使用、稳定且不会被微生物污染。
本发明涉及可用于医学和生物技术的三嵌段共聚物及其合成方法。该三嵌段共聚物包含多价N-乙酰基葡糖胺(NAG)，其比单独的NAG能更有效地结合溶菌酶。与现有技术所报导的情况相比，即使在极低的配体浓度下也可以有效抑制。该三嵌段共聚物可用于预防和治疗细菌和病毒感染。而且，这些聚合物可具有刺激敏感性，可用于回收生物分子。文中所报导的三嵌段共聚物的制备方法可以扩展到其它聚合物和配体如唾液酸的制备，用于预防流感和/或轮状病毒感染。本发明还提供一种制备三嵌段共聚物的方法，该共聚物中所含特异性配体的序列的聚合物是主要部分。
本发明涉及含有碳水化合物配体的三嵌段共聚物及其制备方法。使含有端基官能团的聚合物与含有官能多价NAG的聚合物偶联。
含碳水化合物的三嵌段共聚物也可以进一步用于治疗细菌或病毒感染，并且预计不会引起耐药性。
含有NAG的三嵌段BAB共聚物与含有NAG的天然聚合物如脱乙酰壳多糖和壳多糖相比，表现出更优异的水解稳定性和水溶解性。它们也可以用作预防和治疗疾病的抗感染药物，用于天然以及遗传改造的生物分子的回收。
文中所述的方法是通用性方法，也可扩展使用到其它系统中。例如，已知的可与流感病毒和轮状病毒结合的唾液酸配体。因此，预计包含唾液酸的聚合物与这些病毒或其它含有类似受体位点的物质的结合，比相应的单体、低聚物和大分子单体和共聚物要强。而且，三嵌段共聚物即使在结合的NAG减少的情况下，仍然表现出增强的相互作用。还发现该聚合物偶联物与生物分子的特定结合位点之间的相互作用增强，可应用于亲和分离、药物输送和生物技术。
高亲和蛋白质碳水化合物结合系统的设计可提供另一种用于治疗感染性疾病如流感和轮状病毒感染的策略。该策略的优点是此类药物对于抗生素和药物不会导致病原体产生耐药性。一种治疗流感的新方法是基于抑制病毒感染宿主细胞的原理。现有技术中已经报导了将唾液酸之类的抑制剂固着在聚合物或脂质体载体上。
本发明包括含有多价NAG的BAB三嵌段共聚物。文中所报导的三嵌段共聚物总是产生相互并列的NAG序列，其比含有相同浓度配体的无规共聚物表现出更明显的抑制作用。我们进一步论述到，含有作为低聚物的NAG单元的嵌段共聚物与溶菌酶的结合更强，抑制溶菌酶更有效，如其Kb值和I50值所显示的那样。虽然NAG浓度极低，但是BAB三嵌段共聚物的相互作用能力仍极大增强，这也表明其空间稳定性效应。
不同长度和密度的三嵌段共聚物可用于生物来源的受体配体的相互作用。现有技术中已经报导了用于制备二价和三价配体、树状聚体和高分子量聚合物的各种化学和化学酶方法，但是这些方法被证实其合成过程是复杂的。
因此，需要一种简单的方法来得到具有多价配体的三嵌段共聚物。我们已经表明，NAG基团互相并列形成的NAG低聚物能够更有效地与溶菌酶结合，如其结合常数(Kb)和抑制浓度I50值所反映的那样。而且，我们还论述到在常规的自由基共聚技术中，沿聚合物链的单体分布取决于主要由该单体的固有结构所决定的单体活性比率值。因此，NAG单元在包含具有NAG的单体的共聚物中的分布不能使用常规的共聚技术特制。
为了克服此问题，我们设计了一种新策略，以确保使用常规的缩聚技术制得的三嵌段共聚物总是含有所需的NAG单元序列。
本发明提供用于生物分子靶标的含NAG低聚物的的三嵌段共聚物及其制备方法。
文中所述的制备含有多价NAG配体的三嵌段共聚物的方法是简单的，并且可用于合成其它与流感病毒和轮状病毒结合的多价配体如唾液酸。此类配体也可用作预防和治疗疾病的抗感染剂。而且，可使官能低聚NAG固定在热沉淀聚合物上，用于回收生物分子如溶菌酶和凝结素。
本发明涉及用于回收生物分子的三嵌段共聚物。
包含多价配体的三嵌段共聚物还可使用在治疗细菌感染或病毒感染中，并且预计不会导致耐药性。文中所述的方法是通用的方法，也可扩展使用在如唾液酸的其它系统中。
本发明提供制备含有N-乙酰基葡糖胺(NAG)的三嵌段共聚物的方法。这些三嵌段共聚物对生物分子的结合和抑制作用得到提高。而且，三嵌段共聚物可以是对刺激敏感的聚合物，可用于生物分子的回收。三嵌段共聚物的制备方法可应用于其它配体如唾液酸半乳糖和甘露糖。
本发明涉及应用在医学和生物技术中的含有NAG的三嵌段共聚物。
多糖和聚丙烯酸聚合物是不溶于水的，可作为携带有被动吸附或共价连接的抗体的固相载体使用在生物化学、亲和层析和免疫试验中。
可以通过改变单体的化学组成赋予其不同化学和物理性质，来制备水溶性或水不溶性的聚合物，例如可均聚化水水溶性单体如N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)，来形成水溶性均聚物。
本发明的另一个方面是制备包含多价碳水化合物配体的三嵌段共聚物。
本发明的另一个方面是使用含有NAG的三嵌段共聚物来提高与生物分子的相互作用。
术语“三嵌段共聚物”指任何通过使官能多价聚合物与多价配体如NAG、唾液酸或甘露糖偶联所制备的可含有间隔臂(spacer arm)的任何聚合物，如使用丙烯酸或甲基丙烯酸、丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯、丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸甘油酯或甲基丙烯酸甘油酯、烯丙基氯；丙烯酸羟基低级烷基酯，诸如甲基丙烯酸2-羟乙酯或甲基丙烯酸3-羟丙酯，和丙烯酸氨基低级烷基酯，诸如甲基丙烯2-氨基乙酯所制备的BAB三嵌段聚合物。特别优选使用能溶于水或水/极性溶剂混合物的单体。
“多价配体”指任何含有配体N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖和唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素和直链淀粉的聚合物。优选的是可溶于水或水/极性有机溶剂混合物的多价配体。
NAG衍生自直链两元杂多糖的脱乙酰壳多糖，由2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc；A-单元)和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GIcNAc，D-单元)组成。脱乙酰壳多糖是非常有用的天然配体，其可通过NAG残基与溶菌酶结合。但是，它有三个主要的局限性1)脱乙酰壳多糖在中性pH时是不溶的，这限制了很多用途；2)脱乙酰壳多糖会发生转糖基作用和变旋现象，这会大幅度降低其活性和效率；3)脱乙酰壳多糖会被溶菌酶水解。
因此，本发明提供一种分子量在2000道尔顿至200000道尔顿范围内的通式(1)的三嵌段共聚物，
通式(1)式中，R1是H、CH3、C2H5、C6H5；R2是H、CH3、C2H5、C6H5，这里，在上述两位置上的R2可相同或不同，X是酯键或酰胺键，m为3至500，n为2至50，L是OH、NH2、OCH3和NHCH(CH3)2；Y可以是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素和直链淀粉。
本发明还提供制备上述三嵌段共聚物的简单新颖方法，所述方法包括使两端含有两个官能团的聚合物溶解在溶剂中，向其中加入多价低聚物，将偶联剂溶解在该反应混合物中，使反应在15℃至45℃的室温下进行24小时至48小时，通过过滤除去未反应的偶联剂，在非溶剂中沉淀，在室温下真空中干燥，得到三嵌段共聚物。
在本发明的另一个实施方式中，两端含有两个官能团的聚合物可以是丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰氯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)甲基丙烯酸酯、丙烯酰氯、丙烯酰基吗啉、乙烯基吡咯烷酮和苯乙烯。在本发明的另一个实施方式中，两端含有两个官能团的聚合物可以是聚甲基丙烯酰基NAG或聚丙烯酰基NAG或聚乙烯基NAG。
在本发明的另一个实施方式中，两端含有两个官能团的聚合物可含有COOH或OH。
在本发明的另一个实施方式中，含有活性端基的多价低聚物配体可以是聚甲基丙烯酰基NAG或聚丙酰基NAG或聚乙烯基苄基NAG。
在本发明的另一个实施方式中，含有活性端基的低聚物可含有OH或NH2。
在另一个实施方式中，用于溶解含有活性端基的聚合物和含有活性端基的低聚物的溶剂可以是二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲亚砜。
在另一个实施方式中，使用的偶联剂可选自二环己基碳二亚胺(DCC)、1-环己基3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸酯(CMC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)。
在另一个实施方式中，用于聚合物缩合的偶联剂的摩尔比为1∶1。
在另一个实施方式中，用于沉淀三嵌段共聚物的非溶剂可以是丙酮、二乙醚、热水或己烷。
在本发明的另一个实施方式中，三嵌段共聚反应可在15℃至45℃的室温下进行。
在本发明的一个方面中，含有配体的三嵌段共聚物可应用在医学和生物技术中。
在本发明的另一个方面，提供了比天然聚合物如含有N-乙酰基葡糖胺的壳多糖和脱乙酰壳多糖更稳定地与生物分子相互作用的三嵌段共聚物。在本发明的另一个方面，含有多价NAG的三嵌段共聚物比NAG含量相同的单体形式的共聚物更有效，如其较高的Kb值和较低的I50值所证明的那样。
在本发明的另一个方面，文中所报导的含有配体的三嵌段共聚物可同时与酶/致病病毒的多个位点结合，从而提高了抑制效应。
在本发明的另一个方面，含有多价配体的三嵌段共聚物更易于接近配体偶联物而与受体分子结合。
在另一个方面，用于评价相对抑制性的的方法可用I50mM和ImaxmM值表示。
在本发明的另一个方面，文中所报导的含有配体的三嵌段共聚物在极低的浓度下也是有效的，这在考虑使用昂贵的配体如唾液酸时是有利的。
在本发明的另一个方面，文中所报导的包括含有NAG的配体的三嵌段共聚物是稳定的、可溶于水、能抵抗水解且不会被微生物污染，该三嵌段共聚物比天然聚合物如壳多糖和脱乙酰壳多糖优越。
还预计在聚合物主链中存在多个配体会提高与病毒和生物分子如流感病毒、轮状病毒、麦芽凝集素的结合。含有多个配体的多嵌段共聚物可与多个受体同时相互作用，从而提高了与溶菌酶的结合。
以前用于合成共聚物和嵌段共聚物的方法是复杂的，而且几乎没有报导过在此类嵌段共聚物中结合多价配体的方法。
还报导了聚合岩藻糖苷对流感病毒表面存在的神经氨酸酶具有抗性。病毒可以切下与病毒表面结合的分子中的唾液酸基团，从而破坏其结合能力。
文中所报导的三嵌段共聚物可结合比现有技术中所报导的更少的多价配体。而且，它们在极低浓度时也是有效的，这在考虑使用昂贵的配体如唾液酸时是非常有利的。文中所报导的将多价配体结合到多嵌段共聚物中的方法是相对简单的，涉及的步骤较少。
三嵌段共聚物结合病毒和生物分子的能力提供了一种开发新型治疗剂的手段。这些三嵌段聚合物可用在各种应用中，如用在亲和分离和免疫试验中。
三嵌段共聚物具有合适的分子量，可与靶位点有效结合。
三嵌段共聚物中的配体能同时结合不同底物分子。预计主链中存在多个配体可以提高与病毒和生物分子的结合。
参考实施例对本发明的制备三嵌段共聚物的方法进行说明，这些实施例只是说明性的，不应认为这些实施例以任何方式限制本发明的范围。
实施例1该实施例描述了制备两端含有两个羧基的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPA)。
在一个二颈圆底烧瓶中将2.4克(0.0211M)NIPA溶解在25毫升异丁醇中，搅拌，制得溶液。将所得溶液用氮气吹洗，加入2毫克4，4-偶氮双(4-氰基戊酸)来引发聚合反应，在55℃进行12小时。使聚合物在二乙醚中沉淀，在15℃至45℃的室温下进行真空干燥。
实施例2
该实施例描述了制备由二羧基聚N-异丙基丙烯酰胺与具有端羟基的聚丙烯酰基N-乙酰基葡糖胺(P.Ac.NAG.OH)组成的三嵌段共聚物的方法。
在圆底锥形烧瓶中将3.5克羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺和0.5克羟基封端的聚丙烯酰基N-乙酰基葡糖胺(P.Ac.NAG)溶解在25毫升二甲基甲酰胺(DMF)中。对其持续搅拌，得到透明溶液，加入2克二环己基碳二亚胺(DCC)。反应在室温下进行48小时。过滤除去DCU，使聚合物在二乙醚中沉淀，在室温下进行真空干燥。
表2显示了P.NIPA和P.Ac.NAG嵌段长度不同的三嵌段聚合物。
实施例3该实施例描述了通过荧光分光光度法评价含有NAG的三嵌段共聚物的结合常数(Kb)。
用Perkin Elmer LS-50B发光分光光度计记录溶菌酶的荧光光谱。激发频率为285纳米。在含有0.0154M氯化钠和0.008M叠氮化钠的pH为6.2的0.066M磷酸盐缓冲溶液中制备溶菌酶和含有N-乙酰基葡糖胺的三嵌段共聚物的溶液。在2毫升、10平方毫米的石英器皿中将0.1毫升80微克/毫升溶菌酶与含有不同浓度配体的溶液混合，并保持在18℃。
加入磷酸盐缓冲溶液，使体积达到2毫升。测量该溶液相对于浓度完全相同的含有酶和缓冲混合物的参考溶液的荧光强度。含有不同浓度三嵌段配体的溶液中饱和的溶菌酶的相对荧光强度F∝通过1/(F0-F)对1/[S]作图所得实验值外推得到，其中F是具有给定底物浓度[S]的含酶溶液的荧光测量值，而F0是只含酶的溶液的荧光值((Chipman等人，J.Biol.Chem.，242-19，4388-4394，1967)。当酶的饱和度超过85％时，使用最高浓度的聚合物底物。
表1 三嵌段B-A-B共聚物的结合常数(Kb)
三嵌段BAB三嵌段共聚物的结合常数总结在表1中，其中，分子量为90000-638的三嵌段共聚物的结合常数为4.96×106，比NAG的结合常数(5.24×102)提高了10564倍。
实施例4评价用含有NAG的三嵌段共聚物结合溶菌酶使用Neuberger和Wilson(1967)所报道的步骤评价含有NAG的三嵌段共聚物的相对结合性在含有0.0154m氯化钠和0.008M叠氮化钠的pH为6.2的0.0066M磷酸盐缓冲溶液中制备1.5％w/v三嵌段聚合物配体的储备溶液。在3毫升玻璃试管中将1毫升含有不同浓度配体的储备溶液与1.6毫升78微克/毫升的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)混合。将混合物在20℃培育5分钟。向该混合物中加入0.1毫升溶菌酶(27微克/毫升)，并彻底混合。记录30秒内450纳米处的吸光度(ΔA450)。记录不含有该聚合物配体的空白读数，并计算每秒的吸光度变化。然后计算相对抑制率。
表2 评价含有NAG的三嵌段BAB共聚物对溶菌酶的相对抑制率
根据I50得到的单体NAG对溶菌酶的相对抑制率为74.00mM，而90000-638嵌段共聚物的相应值降低到0.000085mM，比NAG几乎低900000倍。
Imax从55.29mM提高到83.33％。
嵌段共聚物序列沿着聚合物主链一个接着一个排列。本领域中已经知道聚合物链在嵌段共聚物中的各种可能序列。本领域技术人员可以在上述信息的基础上很容易地设计出各种可能序列。
本发明的优点如下1.文中所报导的三嵌段共聚物包含多价配体，用来增强相互作用。
2.三嵌段共聚物具有高分子量，通过空间排斥作用表现出更强的效用。
3.三嵌段共聚物具有较高的水溶解性、稳定性和对酶水解的易感性。
4.三嵌段共聚物的构象灵活性(flexibility)所引起的与生物受体的多价相互作用，使结合作用增强。
5.制备三嵌段共聚物的方法总是能产生并置的NAG配体多价序列，并且可同时结合两个溶菌酶。
6.与单体本身相比，含有多价NAG的三嵌段共聚物即使在低配体浓度下也是有效的。
7.三嵌段共聚物是热沉淀聚合物，使它们适用于回收生物分子。
8.三嵌段共聚物可同时与生物分子的多个结合位点结合，从而加强了相互作用。
9.文中所报导的制备三嵌段共聚物的方法可扩展到其它聚合物和配体如唾液酸的制备，并用来预防流感和/或轮状病毒感染。
权利要求
1.结合强度特别高、分子量在2000道尔顿至200000道尔顿范围内且具有通式(1)结构的三嵌段共聚物， 通式(1)式中，R1是H、CH3、C2H5或C6H5；R2是H、CH3、C2H5或C6H5；这里，在上述两位置上的R2可相同或不同；X是酯键或酰胺键；m为3至500；n为2至50；L是OH、NH2、OCH3或NHCH(CH3)2；Y是N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、半乳糖、唾液酸、果糖、核酮糖、赤醇糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、吡喃葡萄糖、呋喃果糖、脱氧核糖、半乳糖胺、蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维素或直链淀粉。
2.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于，所述共聚物是稳定可用的。
3.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于，所述共聚物与单独配体相比，结合强度提高约11000倍。
4.一种简单而有效的制备如权利要求1中所述通式(1)的三嵌段共聚物的方法，所述方法包括以下步骤a.将两端含有两个官能团的通式3的聚合物溶解在溶剂中，b.以双官能团对多价低聚物约1∶2的比例将通式2的多价低聚物加入到步骤(a)中溶解的聚合物中，得到反应混合物，c.以约1∶1的比例将偶联剂溶解到所述反应混合物中，以引发反应，d.使反应在15℃至45℃的室温下进行24小时至48小时，e.在反应后，通过过滤除去未反应的偶联剂，得到三嵌段聚合物，以及f.在室温下使三嵌段聚合物在非溶剂中沉淀，得到干燥的三嵌段共聚物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述两端含有两个官能团的聚合物选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰氯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)甲基丙烯酸酯、丙烯酰氯、丙烯酰基吗啉、乙烯基吡咯烷酮、苯乙烯、烯丙醇和烯丙胺。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述两端含有两个官能团的聚合物含有COOH基。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含有活性端基的多价低聚物配体选自聚甲基丙烯酰基NAG、聚丙烯酰基NAG和聚乙烯基苄基NAG。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含有活性端基的低聚物含有OH或NH2基。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲亚砜。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所使用的偶联剂选自二环己基碳二亚胺(DCC)、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸酯(CMC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，偶联剂与聚合物的摩尔比约为1∶1。
12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非溶剂选自丙酮、二乙醚、热水和己烷。
13.通式1的三嵌段共聚物在预防和/或治疗微生物感染中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤使微生物接触药学有效量的通式1的三嵌段共聚物，其后所述聚合物与微生物结合，抑制微生物感染。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述应用不会发生耐药性。
15.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述方法有助于防止和/或治疗由流感病毒、麦芽凝集素和轮状病毒引起的感染。
16.如权利要求13所述的应用，其特征在于，微生物的相对抑制(Imax)百分率提高了约60％。
17.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述共聚物的结合强度与单独的配体相比提高约11000倍。
全文摘要
本发明涉及结合强度特别高、分子量在2000道尔顿至200000道尔顿的范围内且符合通式(I)的三嵌段共聚物，通式(I)式中，R
文档编号A61P31/00GK1878824SQ200380110770
公开日2006年12月13日 申请日期2003年12月21日 优先权日2003年10月29日
发明者M·G·库卡尼, J·J·坎达尔 申请人:科学工业研究委员会