癌症化疗药物所引起的毒性的抑制剂以及含有该抑制剂的癌症化疗药物组合物的制作方法

专利名称：癌症化疗药物所引起的毒性的抑制剂以及含有该抑制剂的癌症化疗药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明有关于一种用于癌症化疗药物所引起的毒性的抑制剂，以及有关于一种含有该抑制剂的抗癌组合物。
背景技术：
癌症是一种造成全世界每年七百万人死亡的严重疾病，且有资料报导在1997年，仅在美国便新增150万名癌症患者。依照此种情况发展，癌症很快地将成为死亡原因的榜首。因此，目前发展出多种治疗癌症的方法，例如放射线治疗、手术治疗以及基因疗法等。但最常用的其中一种方法是施用癌症化学治疗药物。
虽然抗癌药物是一种借着正常细胞与癌细胞对药物敏感性的差异而选择性地作用于癌细胞上的化疗药物，但仍会对正常细胞产生毒性。
顺铂(cisplatin)(顺-二氨二氯铂[II]，cis-diamminedichloroplatinum[II])，是一种代表性的铂系化疗药物。此药剂已被广泛地应用在许多癌症病例上，例如卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌与睪丸癌(Rosenberg B.，Cancer 552303-2315，1985)。已知顺铂会借着造成DNA股链内或股链间交联并在癌细胞中产生DNA加成物(DNA additives)而具有抗癌效果。然而，当使用量超过限制剂量时，顺铂会造成诸如听觉丧失、神经毒性与肾毒性等不良副作用(Mollman et al.，1998；Screnci and McKeage，1999)，而当使用较高剂量的顺铂则会造成肝毒性(Cerosimo R.J.，Ann.Pharm.，27438-441，1993；Cavalli F.et al.，Cancer Treat.Rep.，622125-2126，1978；Pollera C.F.et al.，J.Clin.Oncol.，5318-319，1987)。
因此，需要研发出一种抗癌药物，其含有最低毒性的药剂或含有能抑癌症化疗药物所引起的毒性的抑制剂，以帮助化疗药物能安全使用并发挥适当效果。顺铂与谷胱甘肽酯(glutathione ester)合并使用时可能有效抑制顺铂所引起的肾毒性(Babu E.et al.，Mol.Cell Biochem.，1447-11，1995)。且借着服用食品性的抗氧化剂来抑制顺铂毒性的方法目前颇受大众关注(Appenroth D.et al.，Arch.Toxicol.，71677-683，1997；Bogin E.et al.，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，32843-851，1994；and Rao M.et al.，J.Biochem.，125383-390，1999)。

发明内容
因此，本发明的技术在于解决上述问题，也就是提供一种能抑制癌症化疗药物引起诸如肾、肝毒性等毒性的抑制剂，以及含有该毒性抑制剂的抗癌药物。
在本发明中，会造成毒性的化疗药物范例包括但不局限于顺铂(顺-二氨二氯铂[II])、碳铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、奈达铂(nedaplatin)及上述这些药物的混合物。
此外，本发明提供一种包含一癌症化疗药物与束骨姜黄醇(xanthorrhizol)的抗癌组合物，其中束骨姜黄醇能抑制该癌症化疗药物所引起的毒性。


本发明较佳实施例的上述及其它的特征、态样与优点将藉由本文详细叙述内容及所附图示作更完整的描述。所附图示如下第1图显示NF-κB(A图)及AP-1(B图)对DNA的结合活性，以评估束骨姜黄醇对于顺铂诱发性肝毒性的作用效果。NF-κB及AP-1对DNA的结合活性是使用肝组织与电泳移动偏向分析法(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)来加以评估。该实心箭头所指位置分别为NF-κB及AP-1与DNA所形成的复合体位置，且该空心箭头所指位置为未结合寡聚核苷酸探针。该电泳条带(band)的密度是利用RFLP扫描软体来进行测量。
第2图显示COX-2与iNOS基因的mRNA表达量。NF-κB依赖性基因COX-2以及iNOS的mRNA表达量是使用特定的引物对并藉由半定量式反转录聚合酶链式反应所测得。β-肌动蛋白与GAPDH则作为对照组之用。
第3图显示DDRT-PCR与半定量式RT-PCR的结果。(A)图显示因顺铂而提高基因表达量的两个基因S100A9与Kin，而(B)图显示因顺铂而减少基因表达量的两个基因Clpx与CP。各个基因的mRNA表达量是利用半定量式RT-PCR及对各基因具有特异性的引物对来加以确认，且GAPDH基因则作为对照组。
具体实施例方式
以下将对癌症化疗药物诱导性毒性抑制剂以及含有该抑制剂的抗癌组合物做更详细的叙述。
本发明的束骨姜黄醇是作为癌症化疗药物引起毒性的抑制剂的活性成分，其最早是由German Rimpler于1970年自束骨姜黄(Curcuma xanthorrhiza)中所分离出来的一种倍半萜类化合物(sesquiterpene compound)。
束骨姜黄醇会随着施用剂量而限制大鼠子宫的张力性收缩(Ponce-Monter H.，et al.，Phytother.Res.，13202-205，1999)，并且对诸如突变种链球菌等口腔细菌具有杀菌效果(Hwang J.K.，Fitoterapia，71321-323，2000；Hwang J.K.，Planta Med.，66196-197，2000)。除此之外，已知束骨姜黄醇能有效治疗或预防癌症。
本案发明人发现到束骨姜黄醇具有显著抑制诸如肾毒性与肝毒性等由癌症化疗药物所引起的毒性的能力，并进行反复的研究以研发该类药物。
可从束骨姜黄(Curcuma xanthorrhiza Roxb)中萃取出具有下列式1结构的束骨姜黄醇。在印尼地区，姜科植物(Zingiberaceae)曾是药用植物。诸如有机溶剂萃取、超临界流体萃取(supercritical fluid extraxtion)、微波式萃取与超声波萃取等数种萃取方法均可用来萃取束骨姜黄醇，例如参阅韩国专利公开案2000-73295号与PCT专利案WO88/05304号中所叙述的方法。
式1 (+)-束骨姜黄醇(Xanthorrhizol)如上所述，束骨姜黄醇对于施用癌症化疗药物后所产生如肝毒性及肾毒性等副作用具有出色的抑制能力。而这些引起的副作用能被束骨姜黄醇所抑制的化疗药物范例包括但不局限于铂系抗癌药物(platinum-based anticancer drug)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、博莱霉素(bleomycin)与阿霉素(doxorubicin)，特别是对于由诸如顺铂(顺-二氨二氯铂[II])、碳铂、奥沙利铂、奈达铂等铂系抗癌药物所引起的肝毒性及肾毒性的抑制作用更具效果。束骨姜黄醇是透过抑制这些化疗药物所产生的活性氧物质的作用来影响癌症化疗药物。
评估束骨姜黄醇对代表性的铂系化疗药物顺铂所引起肝毒性与肾毒性的抑制效果的方法如下所示。
将顺铂注射至小鼠腹腔内。经过一段时间后，测量该小鼠的体重，并确认毒性的诱发情形。将该小鼠以乙醚麻醉后收集心脏中的血液，并评估该血液中与肝毒性及肾毒性诱发相关的生化标记(biochemical marker)。将小属的肾脏与脾脏取出秤重以进行比较。
测量血清中某些酶的活性能够显示出用来诊断多种疾病的资讯。肝脏中存在着相当高量的转氨酶(aminotransferase)，但血液中仅有少许的转氨酶。然而，肝毒性会提高血液中的转氨酶浓度。施用过顺铂后的不正常肝脏会从受伤的肝细胞中将谷氨酸丙酮酸转胺酶(GPT，glutamate-pyruvate transaminase)与谷氨酸草酰乙酸转胺酶(GOT，glutamate-oxaloacetate transaminase)释放到血液中。在腹腔注射顺铂之前先行口服束骨姜黄醇的小鼠组别的GPT与GOT血中浓度，明显低于仅施用顺铂的小鼠组别的GPT与GOT血中浓度。
也测量肾脏比重(specific gravity)的变化，以评估束骨姜黄醇对于顺铂诱发性肾毒性的的抑制效果。相较于未施打顺铂的对照组小鼠而言，施打高剂量顺铂的小鼠组别的肾脏比重会提高。然而，这些在施打顺铂前数天先行口服束骨姜黄醇的小鼠的肾脏比重则几乎没有变化。
此外，顺铂诱发性肾毒性会增加活性氧物质，降低肾脏的排泄与过滤效率，并发生体重变化。由于过滤功能降低，使得血液中的尿素氮(urea nitrogen)与肌酸酐(creatinine)浓度升高。而这些在注射顺铂前先行口服束骨姜黄醇的小鼠组别的尿素氮血中浓度，明显低于仅施用顺铂的小鼠组别的尿素氮血中浓度。
已知施用诸如顺铂等铂系化疗药物会活化或抑制诸如核转录因子κB(NF-κB，nuclear factor-κB)与活化子蛋白1(AP-1，activator protein-1)等转录因子，且这些转录因子的活化作用，特别是NF-κB，会造成诸如环氧化酶(COX-2，cyclooxygenase-2)与诱导性氧化氮合成酶(iNOS，inducible nitric oxidesynthase)等NF-κB依赖性基因的活化作用。这些基因均为已知与发炎反应及毒性有关的致发炎基因(pro-inflammatory genes)(Nanji，A.A.，et al.，2003.Am.J.Physiol.Gastronintest.Liver Physiol.284，G321-27；Reilly，T.P.，et al.，Chem.Res.Toxicol.14，1620-1628；以及，Gardner，C.R.，et al.，Hepatology27，748-754)。
姜黄素(curcumin)的生理作用已知与其能抑制这些已活化的转录因子有密切关联，特别是能抑制以活化的NF-κB，因此在本文使用姜黄素作为本发明的比较实施例(Han，S.S.，et al.，2002.J.Biochem.Mol.Biol.35，337-342与Nanji，A.A.，et al.，2003.Am.J.Physiol.Gastronintest.Liver Physiol.284，G321-27)。
我们于本发明中确认顺铂对NF-κB的活化作用。并于本发明中也确认COX-2与iNOS基因会受到顺铂的影响而提高mRNA的表达。在施用顺铂之前，不论是使用束骨姜黄醇或姜黄素做先行治疗会抑制上述这些基因的mRNA表达。束骨姜黄醇能同时抑制顺铂所诱导的COX-2与iNOS基因的mRNA表达，但姜黄素仅能抑制COX-2基因的表达。此结果意味着束骨姜黄醇能有效治疗顺铂所引起的肝毒性。
除此之外，为了证明这些表达有所差异的基因与束骨姜黄醇对于顺铂诱发性肝毒性的预防有所关联，故进行差异显示性反转录聚合酶链式反应技术(DDRT-PCR，Differential-display reverse transcription-PCR)，来分析这些基因并鉴定出有7个基因的表达受到顺铂的影响而增加，且有五个基因的表达则受顺铂影响而降低。
这些基因中，因顺铂而使S100钙结合蛋白A9(S100A9)的mRNA表达量提高的原因可解释为顺铂会降低AP-1的DNA结合活性，因而降低S100A9 mRNA的表达(Gebhardt，C.，et al.，2002，Oncigene 214366-4276)。曾有文献暗示过此S100A9基因会影响细胞骨架与细胞形状的改变、信息传递作用以及细胞内钙离子的调节作用(Kerkhoff，C.，et al.，J.Biol.Chem.27432672-32679；与SchaferB.W.，et al.，Trends Biochem.Sci.21134-140)。顺铂所引起的S100A9 mRNA的异常表达最后会涉及钙离子(Ca2+)调节作用的损害，且顺铂诱导性肝毒性可能与钙离子恒定作用受到干扰有高度关联。与姜黄素对照下，施用束骨姜黄醇被认为能解除顺铂对于AP-1基因的抑制作用，因而降低A100A9的mRNA表达量，且最终在对顺铂诱导性肝炎上得到想要的作用效果。
Rec-A蛋白(Kin)的抗原决定簇是一种核蛋白，其会与细菌的RecA蛋白产生交叉免疫反应(cross-immunoreactivity)并能有效地结合至弯曲的DNA上(Tissier，A.et al.，Biochimie 77，854-860)。此种基因交互作用可能涉及真核细胞中的DNA修复及错误重组作用。顺铂诱导Kin基因的mRNA表达增加会提高Kin蛋白的量(Angulo J.F.，et al.，Mutat.Res.，217123-134)。曾有文献报导过，由于暴露在顺铂下的大鼠肝脏细胞中的DNA修复活性增强，因此接受顺铂治疗的老鼠体内有较多Kin mRNA可能是为了修复顺铂在肝脏中造成DNA受损的缘故。而与束骨姜黄醇会影响iNOS表达的结果一致的是，预先接受束骨姜黄醇治疗可大幅地降低因顺铂所造成Kin基因的mRNA表达量提高的情形。此结果表示束骨姜黄醇具有抑制顺铂所诱发的毒性的能力。
施用顺铂也会在线粒体中产生显著的改变。顺铂会抑制老鼠肝脏中呼吸链的复合体I与复合体II的活性(Rosen M.，et al.，Int.J.Exp.Pathol.7361-74)，并会造成线粒体丧失膜电位，因而影响整个线粒体的功能(Kruidering M.et al.，Exp.Nephrol.2334-344)。
肝毒性问题中的线粒体功能障碍也可用另一个基因小鼠细菌酪蛋白水解蛋白酶(ClpX，caseinolytic protease X)异常表达来解释。ClpX蛋白除了表现自身的ATP水解酶活性(ATPase activity)之外，还能作为具组织特异性的哺乳动物线粒体伴护蛋白(chaperone)参与在线粒体蛋白的恒定作用中(Santagata S.et al.，J.Biol.Chem.27416311-16319)。ClpX基因表达量的降低会导致线粒体不稳定，但预先施以束骨姜黄醇治疗则能把ClpX mRNA的表达量维持在如同未施用顺铂时的程度。此结果也暗示着使用束骨姜黄醇能降低因施用顺铂所造成的毒性。
铜蓝蛋白(CP，ceruloplasmin)是一种血清α2-醣蛋白，其所含有的铜量超过脊椎动物血浆中总铜含量的95％(Takahashi N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81390-394)。铜蓝蛋白在血浆中借着与血浆中的铜紧密结合而作为一种保护性的抗氧化物质，并会抑制离子依赖性的脂质过氧化反应(ion-dependent lipidperoxidation)与抑制羟基自由基的形成。有趣的是，施用顺铂会导致血浆中包括铜蓝蛋白在内等抗氧化蛋白浓度下降。此结果可能显示出用来抵抗因常用抗癌药物所造成的氧化损伤的抗氧化防护机制运作失常(Weijl N.I.et al.，Ann.Oncol.91331-1337)。我们证实了以束骨姜黄醇进行预先治疗能轻微恢复铜蓝蛋白的mRNA表达，因此暗示着束骨姜黄醇可作为化疗药物引起的毒性的抑制剂。我们使用姜黄素作为比较范例，但姜黄素并未展现出如上述般的效果。
根据上述实验结果与事实证明，能认为束骨姜黄醇在抑制癌症化疗药物所引起诸如肝毒性及肾毒性等不良副作用上有良好效果，且束骨姜黄醇的抑制毒性效果优于也可作为毒性抑制剂的姜黄素。
可透过各种不同途径来施用束骨姜黄醇。施用途径包括但不局限于口服、局部用药、皮下注射、皮肤吸收、皮内、肌肉内、腹膜内、关节内、动脉内、静脉内、皮肤内、病灶内、眼球内、肺内与脊椎内等用药途径。也可将束骨姜黄醇配制成溶液、悬浮液、乳化物、锭剂、胶囊与持续释放系统剂型。
束骨姜黄醇的剂量可根据所使用的癌症化疗药物的剂量与种类、患者的年龄与性别等因素进行调整。束骨姜黄醇可在施用癌症化疗药物之前或其后单独使用，也可与癌症化疗药物共同组合成一抗癌组合物而一起施用。
每剂量所施用的束骨姜黄醇量可根据患者的病情、铂系化疗药物剂量、用药周期与某些情况而做调整。较佳者，束骨姜黄醇的施用剂量约为顺铂总用药重量的0.01至10倍重，并以顺铂总用药重量的0.1至5倍重为较佳。
本发明提供一种含有一癌症化疗药物与束骨姜黄醇的抗癌组合物，其中该束骨姜黄醇会抑制因该癌症化疗药物所引起的毒性。该束骨姜黄醇在该组合物中的量较佳约为该癌症化疗药物量的0.01至10倍，更佳者为该癌症化疗药物量的0.1至5倍。
含束骨姜黄醇的癌症化疗药物毒性抑制剂以及内含该束骨姜黄醇的抗癌组合物更可包含多种药学可接受添加剂与稀释剂。添加剂与稀释剂包括但不局限于常用的填充剂、结合剂、润滑剂、湿润剂、悬浮剂、溶剂、分散剂、控制释放剂、香料、色素或膜衣等。
为帮助本领域技术人员了解本发明，在下述内容中对本发明做详细描述。然而，下述实施例仅作为示范，非意欲于限制本发明范围。本领域技术人员可在不偏离本发明精神与范围或不损及必要优点下做出各种变化。
以下实施例结果是以平均值±标准偏差值(SE)的方式来显示。并利用斯氏t-测验法(Student t-test)来进行统计分析，且实验的意义程度均设定在P值小于0.05。
实施例1设计动物模型比较束骨姜黄醇及姜黄素对顺铂所诱发的肝毒性与肾毒性的抑制效果。每一实验组别均含10只鼠龄5周的雄性IRC小鼠。使这些小鼠连续四天口服束骨姜黄醇与姜黄素，其中束骨姜黄醇的剂量为每日口服100或200微克/千克且溶于玉米油中；姜黄素的剂量则为每日口服200毫克/千克且溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。而这些喂食不含任何药物的玉米油的小鼠则作为负对照组(negtive control)。在最后一次施用束骨姜黄醇与姜黄素经三个小时后，以45毫克/千克剂量的顺铂(溶于PBS中)注射至小鼠腹腔内，且仅注射PBS缓冲溶液的小鼠则作为负对照组。注射16小时后，秤取小鼠体重，并使用乙醚麻醉这些小鼠以取得血液及肝脏样本，并分别切取小鼠的肾脏与脾脏进行秤量。此实验中的实施例与比较实施例的用药途径与剂量显示于表一。
表一 实施例2血清生化参数测量将取自心脏的血液样本于室温下放置2小时，然以3000rpm的转速离心10分钟以取得血清，并将这些血清保存于低温下以进行蛋白质分析。测量这些血清中的谷氨酸丙酮酸转胺酶(GPT)、谷氨酸草酰乙酸转胺酶(GOT)、血中尿素氮(BUN)与肌酸酐，所得结果显示于表二。
GPT(谷氨酸丙酮酸转胺酶)与GOT(谷氨酸草酰乙酸转胺酶)定量法利用Reitman与Frankel于1957年所叙述的方法来测量GPT与GOT的活性。其测量原理是根据下列反应式α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)+丙胺酸(alanine)→谷氨酸(glutamate)+丙酮酸(pyruvate)。GPT酶借着上述反应所产生的丙酮酸与2，4-二硝基苯胼(2，4-dinitrophenyl hydrazine)反应，反应后所形成的颜色的浓度与酶活性有关。以505纳米的波长来测量产物的吸光值(absorbance)。用来测量GPT与GOT活性的试剂可购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，U.S.A.)。由于溶血(hemolyzed)后血清中所含的GOT与GPT量高于正常血清中的含量，因此这些未溶血的血清用量必须尽可能使用至所允许的最大量。由于超过五天后，GPT与GOT的活性即使在低温下也可能会减低，因此这些分离出来的血清样本储存在4℃并须在五天内使用。
将1毫升(ml)的丙胺酸-α-酮戊二酸物质加入试管中并在37℃预热2-3分钟。在每个含有物质的试管中加入0.2毫升的血清样本后，于37℃水浴中反应30分钟。随后，于试管中添加1毫升的2，4-二硝基苯胼在室温下反应20分钟。于每管试管中添加10毫升的0.4N氢氧化钠水溶液混合均匀。之后，以蒸馏水的吸光值做为比较来读取各试管中溶液的GPT吸光值。测定GOT时，则先将天门冬胺酸-α-酮戊二酸物质于37℃预热2-3分钟，并于各试管中加入0.2毫升的血清样本于37℃下反应60分钟后，读取其吸光值。
血中尿素氮的定量法尿素氨的含量则利用Faweett等人于1957年所叙述的方法来加以测量。其是使用分析血中尿素氨浓度的试剂组来进行测量，并利用其在570纳米波长下的吸光值来测定尿素水解后所形成的氨量(NH3)。
将0.5毫升的尿素水解酶(urease)溶液加入试管中并混入10微升(μl)的血清样本后，置于37℃水浴中反应5-10分钟。将1毫升的酚-硝普盐溶液(phenolnitroprusside solution)与1毫升的碱性次氯酸盐溶液(alkaline hypochloridesolution)加入试管中温和地混合后，加入5毫升的蒸馏水。之后，以蒸馏水做为对照组来读取各反应的吸光值。用来测定尿素氮的试剂可购自Sigma ChemicalCo.(St.Louis，U.S.A.)，并使用标准校正曲线(standard calibration curve)。
肌酸酐(creatinine)定量法肌酸酐的含量是利用Jaffe等人于1886年所叙述的方法来测定，其是使肌酸酐代谢物与碱性苦味酸盐(alkaline picrate)反应后会产生黄色物质，并利用500纳米的波长来测量其吸光值，且使用标准校正曲线。
将3毫升的碱性苦味酸盐溶液与0.3毫升的血清样本于37℃下混合反应20分钟后测量其吸光值(A1)。此处以蒸馏水作为负对照组。在每个试管中加入0.1毫升的酸性溶液(硫酸与醋酸混合物)后于37℃水浴中反应5分钟。之后以蒸馏水作为负对照组来读取吸光值(A2)。并将吸光值(A1)减去吸光值(A2)后所得的吸光值根据标准校正曲线来判断该样本的肌酸酐含量。用来测量肌酸酐的试剂可购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，U.S.A)。
表二

*P＜0.0b；**P＜0.01；***P＜0.0001在表二中，K.W/B.W是指肾脏重量/体重的比值，S.W/B.W则是脾脏重量/体重，而BUN则代表血中尿素氮。
如表二所显示的，相较于仅接受顺铂注射的组别而言，该接受腹腔顺铂注射前四天先行口服束骨姜黄醇(200毫克/千克)治疗的组别显示出明显降低的GPT浓度，且接受口服束骨姜黄醇治疗的效果更优于预先接受姜黄素的效果。该施用高剂量顺铂的组别的肾脏比重也高于未施用顺铂的组别。但在注射顺铂前，先行口服四天姜黄素与束骨姜黄醇的组别的肾脏比重则会与对照组小鼠肾脏比重相当，且束骨姜黄醇降低肾脏比重的效果优于姜黄素的效果。
相较于仅施打顺铂的组别，这些在施用顺铂前先行服用四天束骨姜黄醇(200毫克/千克)的小鼠组别的血中尿素氮含量也显著降低。而当该施打顺铂的组别因引发肾毒性而使血中肌酸酐浓度升高的同时，这些在施用顺铂前先行服用束骨姜黄醇(200毫克/千克)的小鼠组别的血中肌酸酐含量却明显下降。
实施例3评估束骨姜黄醇对NF-κB与AP-1的影响执行电泳移动偏向分析法(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)以评估束骨姜黄醇对NF-κB与AP-1的作用效果。将上述实施例1中所制备的实施例1、实施例2、比较实施例1与比较实施例2的肝脏组织于液态氮下磨成粉末。随后，将粉末状的肝脏组织与500微升冷的低张压缓冲液均质混合，其中该低张压缓冲液内含10mM HEPES(pH 7.8)、10mM氯化钾、1.5mM氯化镁(MgCl2)、0.5mM DTT、0.2mM PMSF。于该均质物中加入125微升的10％NP-40溶液，随后以12,000×g的转速离心该混合物一分钟。将离心下来的沉淀物以100微升的上述缓冲液与12.5微升的10％NP-40清洗一次，再次离心后，将沉淀物重新分散在50微升的冷的20mMHEPES缓冲液(pH7.8)中，且该20mM HEPES缓冲液中含有420mM氯化钠、1.5mM氯化镁、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.2mM PMSF与20％甘油。将重新分散后的溶液以12000×g的转速于4℃下离心5分钟。收集含有诸多核蛋白的上清液，并分析其蛋白浓度后保存于-70℃。不论是NF-κB寡聚核苷酸探针(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’；Promega，Wisconsin)或AP-1(c-Jun)寡聚核苷酸探针(5’CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3’；Promega，Wisconsin)均使用T4聚核苷酸激酶来标记上[γ-32P]ATP，并以Nich管柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)来纯化经标记后的探针。于含有5微升的反应缓冲液(incubation buffer)、10微克的细胞核萃出物以及100,000cpm的标记探针的25微升混合物中进行结合反应，其中该反应缓冲液中含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM氯化钠、1mM DTT、1mM EDTA、4％(v/v)甘油与0.1微克/毫升的超声波震荡后的鲑鱼精子DNA。将混合物置于室温下反应50分钟，分别在样本与比较样本中混入3微升的载入缓冲液(loadingbuffer；含250mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2％溴酚蓝与40％甘油)后，以6％的非变性聚丙酰胺胶片于150伏特(V)电压进行电泳分析2小时。最后，将电泳胶片干燥后以X光底片曝光。此结果显示于第1图。
如第1图所示，使用顺铂进行治疗，NF-κB蛋白的DNA结合活性会提高，但相反地，AP-1蛋白的DNA结合活性则下降。然而，若预先施用束骨姜黄醇与姜黄素进行治疗则会抑制因顺铂诱导的NF-κB结合活性。若在相同的用药剂量下，束骨姜黄醇对于抑制顺铂诱导的NF-κB结合活性的效果远强于姜黄素的抑制效果。而预先施用束骨姜黄醇可使被顺铂所抑制的AP-1蛋白的DNA结合活性恢复50％。但预先施用姜黄素却不会使受到顺铂抑制的AP-1蛋白的DNA结合活性有所改变。
实施例4评估束骨姜黄醇在基因表达上的影响总RNA的分离与Dnase I剪切将实施例1中所制备的实施例1、2与比较实施例1、2的肝脏组织于液态氮下磨成粉末。随后，使用TRIzolTM试剂(Life technologies，Austria)将粉末状的肝脏组织进行均质混合。将均质混合后的样本置于室温下反应5分钟，以使样本中的核蛋白复合体彻底分离。于这些样本中加入0.2倍样本体积的氯仿(chloroform)，并激烈摇晃这些样本15秒，再令其反应2-3分钟后，以12000×g的转速于4℃下离心15分钟。取出上层水相并加入等体积的异丙醇以沉淀出该水相中的总RNA，并将含有异丙醇的混合物置于4℃下10分钟后，以12000×g的转速于4℃下离心10分钟。离心所得的RNA沉淀物以75％的乙醇清洗、干燥后溶于不含RNase(RNA水解酶)的水中。为了避免所获得的RNA被染色体DNA所污染，分别于各个总RNA样本中加入10单位的DNase I(DNA水解酶I，GenHunter Corp.，Nashville，USA)置于37℃下反应30分钟后，使用TRIzol试剂分离出不含DNA的RNA样本。利用260与280纳米的波长来计算总RNA及经过DnaseI处理过后总RNA的浓度与纯度。
DDRT-PCR使用RNAimage试剂组(GenHunter Corp.，Nashville，USA)来进行差异显示性反转录聚合酶链式反应技术(DDRT-PCR，Differential-display reversetranscription-PCR)。从每个组别的DNaseI处理过的总RNA库中分别取出200纳克(ng)置于含有5单位/微升的MMLV-反转录酶、20μM dNTP混合物与0.2μM接有鸟嘌呤核苷酸的寡聚dT引物(guanosine-anchored oligo(dT)primer(HT11-G)的反转录酶缓冲液中进行反转录反应，其中该反转录酶缓冲液含有25mMTris-HCl(pH8.3)、37.6mM氯化钾、1.5毫克的氯化镁以及5mM DTT。将反转录反应混合物以1∶10的倍率稀释后用来进行PCR反应。之后，在含有2μM dNTP、0.2μM HT11-G、0.2μM引物(从H-AP1至H-AP10)、0.2μl的α-[32P]dATP(2000Ci/mmol)以及0.05单位/微升的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)的PCR缓冲液中进行聚合酶链式反应(总体积为20微升)，其中该PCR缓冲液成分为10mMTris-HCl(pH8.4)、50mM氯化钾、1.5mM氯化镁与0.001％明胶。PCR仪器(GeneAmp PCRSystem9700，Perkin-Elmer)的温度循环仪的设定如下94℃持续30秒、40℃持续2分钟、72℃持续30秒，循环40次，且最终于72℃下持续5分钟以进行延长反应后结束循环。在60瓦的固定功率下，以6％的变性聚丙酰胺胶片电泳3.5小时来分离标记有33P的PCR产物。将电泳后的胶体贴在3M纸上于80℃下真空干燥1小时。将干燥的胶片置于自动放射显影板(autoradiogram)以进行曝光与显像。
克隆与DNA测序从干燥后的胶体切下感兴趣的cDNA片段，并使用煮沸的水将这些cDNA片段从胶体上冲出，并再次利用与PCR反应相同的引物对及PCR条件来进行DDRT-PCR。并根据制造商所提供的操作方法利用PCR-TRAP克隆系统(GenHunter)将再次扩增出来的PCR产物克隆至PCR-TRAP载体中。并委托Takara Korea Biomedical公司(Suwon，Korea)测序含有这些DNA插入片段的质粒，并将测序所得到的序列于国家生物资讯中心(NCBI)所提供的GenBank网站中利用标准核苷酸-核苷酸比对程序(BLAST program，blastn)进行序列比对，以及利用Fasta3程序对所有的EMBL基因库进行比对。
设计引物与反转录聚合酶链式反应进行半定量式反转录聚合酶链式反应(semiquantitive RT-PCR)来确认DDRT-PCR的实验结果。为了设定最适当的PCR扩增条件，利用引物线上(on-line)设计程序来设计针对感兴趣基因的引物(Rozen与Skaletsky，2000)。本发明中所使用的引物对显示于表三中。
表三


使用1微克的总RNAs、1μM寡聚dT15引物以及Ominiscript ReverseTranscriptase试剂组(Qiagen，California)合成出第一链cDNA。随后，使用TaqPCR Master Mix试剂组(Qiagen)，以0.5微升的第一链cDNA及20pmol的引物(参阅表一)来进行PCR反应。该PCR反应条件为于94℃下反应3分钟以进行最初的变性作用，之后进行三步骤的循环分别为在94℃下变性40秒、53℃下退火40秒与72℃下进行延伸1分钟，共循环30次，最后于72℃下进行延伸10分钟。将扩增出来的PCR产物以1.2％琼酯胶进行电泳。将胶体以溴化乙锭(ethidium bromide)染色后，置于UV transilliminator下照射UV光并以Polaroid DS-34快速照相系统(Kodak，USA)拍摄照片。所得结果分别显示于第2与3图中。
第2图所示是利用半定量式RT-PCR来评估这些NF-κB依赖性基因COX-2与iNOS的mRNA表达量。且两种管家基因β-肌动蛋白(β-actin)与GAPDH是用来将各种mRNA的表达标准化(normalized)。如第2图所示，该两基因COX-2与iNOS会因为施用顺铂而高度表达，但若施用同样剂量的束骨姜黄醇与姜黄素进行预先治疗，则可将因顺铂诱发的高COX-2mRNA的表达量降回最初的表达程度。预先施以束骨姜黄醇进行治疗会抑制顺铂所诱发的iNOX mRNA表达，但预先施用姜黄素则无法抑制顺铂所诱发的iNOX mRNA表达。
如第3图所示，进行DDRT-PCR以鉴定这些与束骨姜黄醇在顺铂诱发肝毒性的保护效果上有关联而表达程度有所差异的基因。借着使用10组引物组合鉴定出7种会受顺铂影响而增加基因表达量的基因(见表四)，以及5种受顺铂影响而降低基因表达量的基因(见表五)。借着半定量RT-PCR，确认出施行束骨姜黄醇预先治疗会分别使因顺铂而提高表达的两基因S100A9与kin，以及因顺铂而减少表达的两基因ClpX与CP的mRNA表达量复原。且此结果显示出束骨姜黄醇的作用效果优于姜黄素的效果。
表四


表五

工业上的应用如前所述，由于束骨姜黄醇展现出对化疗药物所引起诸如肝毒性与肾毒性等不良副作用的绝佳抑制效果，因此束骨姜黄醇能有效作为癌症化疗药物引起的毒性的抑制剂。而内含一癌症化疗药物与束骨姜黄醇的抗癌组合物可在该癌症化疗药物有效作用的同时，也将副作用降至最小。
序列表<110>朴光均(PARK，Kwang-Kyun)生物关怀有限公司(BIOCARE CO.，LTD.)<120>癌症化疗药物所引起的毒性的抑制剂以及含有该抑制剂的癌症化疗药物组合物<150>KR10-2003-0040937<151>2003-06-24<160>16<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析COX-2基因表达的前置引物<400>1ggagagacta tcaagatagt gatc24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析COX-2基因表达的后置引物<400>2atggtcagta gacttttaca gctc24<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>3aagttcagca acaaccccac 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析iNOS基因表达的后置引物<400>4tcctgaacgt agacct tggg20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析S100A9基因表达的前置引物<400>5aggacctgga cacaaaccag 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析S100A9基因表达的后置引物<400>6tcatttccca gaacaaaggc 20<210>7<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Kin基因表达的前置引物<400>7gacaactgtt gctggcttca20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Kin基因表达的后置引物<400>8tggtcccaaa gagcttgact20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析ClpX基因表达的前置引物<400>9gcgcagagct cctcttagaa20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析ClpX基因表达的后置引物
<400>10cttctcagcc tctgcttgct 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Cp基因表达的前置引物<400>11tgctctgaac ccgagaaagt 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析Cp基因表达的后置引物<400>12ccagagggag cataat tcca20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析β-肌动蛋白基因表达的前置引物<400>13tacaatgagc tgcgtgtggc 20<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于分析β-肌动蛋白基因表达的后置引物<400>14atgtcacgca cgatttccc 19<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析GAPDH基因表达的前置引物<400>15ctgcaccacc aactgcttag20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析GAPDH基因表达的后置引物<400>16gcctctcttg ctcagtgtcc20
权利要求
1.一种抑制癌症化疗药物所诱发的毒性的抑制剂，其含有束骨姜黄醇作为活性成分。
2.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，该毒性为肝毒性或肾毒性。
3.如权利要求1或2所述的抑制剂，其特征在于，该癌症化疗药物是铂系抗癌药物，其选自于由顺铂(顺-二氨二氯铂[II])、碳铂、奥沙利铂、奈达铂及上述这些药物的混合物所构成的组中。
4.一种包含癌症化疗药物与束骨姜黄醇的抗癌组合物，其特征在于，该束骨姜黄醇抑制该癌症化疗药物所诱发的毒性。
5.如权利要求4所述的抗癌组合物，其特征在于，该癌症化疗药物是铂系抗癌药物，其选自于由顺铂(顺-二氨二氯铂[II])、碳铂、奥沙利铂、奈达铂及上述这些药物的混合物所构成的组中。
6.如权利要求4或5所述的抗癌组合物，其特征在于，该束骨姜黄醇的重量为该癌症化疗药物重量的0.01倍至10倍。
全文摘要
本发明公开内容是有关一种用于癌症化疗药物所引起诸如肝、肾等毒性的抑制剂，以及含有该抑制剂的癌症化疗组合物。该化疗药物毒性抑制剂中含有一种活性成分束骨姜黄醇(Xanthorrhizol)。束骨姜黄醇展现出抑制癌症化疗药物因剂量问题所产生诸如肝毒性或肾毒性等有害作用的绝佳能力。
文档编号A61K33/24GK1842326SQ200480024279
公开日2006年10月4日 申请日期2004年6月24日 优先权日2003年6月24日
发明者朴光均, 郑媛允, 弘倾玉, 黄在宽 申请人:生物关怀有限公司, 朴光均