专利名称：一种治疗冠心病冻干粉针制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药制剂，特别是用于治疗冠心病的冻干粉针制剂及其制备方法。
背景技术：
冠心宁注射液是由丹参和川芎二味中药组成的复方，具有活血化瘀，通脉养心之功效，用于冠心病心绞痛。现代药理研究证实具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，改善心肌缺血状态及抑制血液凝固，促进纤溶，改善血液流变性等功能，用于心、脑血管缺血性病变效果较好，近年来在临床上使用较多。
目前临床上使用的冠心宁注射液药物浓度低，而临床用量大(50～100ml)，而且冠心宁注射液的稳定性较差，长期储存后，颜色会变深，并产生沉淀，给临床用药安全性和有效性造成一定的影响。
专利申请号“200310122469”公开了注射用冠心宁及其制备方法，该专利将丹参用乙醇提取得到提取液，再将残渣进行水提，醇沉，浓缩后过滤得到的上清液与用乙醇提取得到的提取液混合得到丹参的有效部位提取液。川芎先采用乙醇超声提取，滤液浓缩后加水沉淀，过滤得上清液；再将乙醇超声提取过的川芎水提、醇沉，滤液浓缩至稠膏状，加水沉淀，滤液加活性炭处理后与先用乙醇超声提取得到的上清液合并得到川芎的有效部位提取液。将丹参和川芎的有效部位提取液合并后，加入赋形剂，冷冻干燥制成冠心宁冻干粉针制剂。该方法工艺复杂，增加生产过程成本的投入，企业在工业化生产中有一定的难度。
专利申请号“200410101281”公开了冠心宁冻干粉针制剂的制备方法，该专利对丹参和川芎采用超临界提取的方法进行提取后进行包合得到包合物，再将经超临界提取后的残渣水提、醇沉，超频震荡超滤的方法得到提取液，然后将包合物与提取液混合，加入冻干赋形剂制备成冻干粉针剂。但该方法在生产的过程中增加了成本的投入，不利于大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种大孔树脂吸附分离技术，由中草药有效成分提取分离中的一种分离纯化技术，采用特殊的吸附剂从中药复方煎液中有选择地吸附其中的有效成分，祛除无效成分的一种提取精制的新工艺，具有周期短，省时省力，工艺简单，降低生产成本，并且稳定性好，质量高，疗效显著，运输贮存方便的一种治疗冠心病冻干粉针制剂及其制备方法。
本发明是丹参与川芎经水提醇沉后，再经过大孔树脂柱得到精制提取物，制备成冻干粉针制剂。
本发明制备方法是以丹参和川芎为主要原料，采用丹参和川芎混合提取或丹参与川芎单独提取制备，均采用水提法提取，沉淀剂除杂，大孔树脂精制，再经过滤、精制；将精制提取物和冻干赋形剂用注射用水配制溶液，精制、分装、低温冷冻干燥，制得注射用冠心宁冻干粉。
本发明制备方法，包括以下步骤(1)将丹参与川芎，加水浸泡1～3小时，提取1～3次，每次1.5～2时，合并煎液滤过得滤液。
(2)滤液浓缩至30℃～80℃时相对密度为1.1～1.3，得浓缩液。
(3)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到40％～80％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1～1.3，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到75％～90％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0～1.1，得浓缩液；(4)将处理过的大孔树脂湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用0％～40％醇洗脱除杂，再用50～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液。
(5)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.15％～2.5％的药用活性炭，加热回流30分钟至2小时，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量赋形剂，使溶解，用5～20％葡甲胺调节PH至5.0～7.0，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。
上述步骤(1)中丹参、川芎分别粉碎为粗粉，按照1∶1混合用水提取1～3次或分别提取1～3次。
上述步骤(3)中浓缩进行两次乙醇沉淀，沉淀乙醇浓度分别为40％～80％；75％～90％。其中第一次醇沉时乙醇浓度首选75％，第二次醇沉时乙醇浓度首选85％。
上述步骤(4)中所述大孔树包括D101，AB-8，D21、HP-20，其中首选HP-20，乙醇洗脱浓度为50～100％，首选65％乙醇洗脱。
上述步骤(5)中所述赋形剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖中的一种或几种混合物。
上述成品总可测成分(原茶儿醛含量10～15mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量300～350mg/支，川芎嗪含量10～15mg/支)超过65％。
本发明对丹参、川芎采用水提取，通过沉淀除杂，大孔树脂纯化，得精制提取物总酚酸含量超过60％，成品总可测成分(原茶儿醛、总酚酸、川芎嗪)超过65％。将精制提取物加入冻干赋形剂，制备成冻干粉针剂。药理实验结果表明，本发明冻干粉针具有较好的药理作用。
一、工艺制法本发明原料药材配比重量份为(1)丹参∶川芎为1∶1。
(2)将丹参与川芎，加水浸泡1～3小时，提取1～3次，每次1.5～2时，合并煎液滤过得滤液。
(3)滤液浓缩至30℃～80℃时相对密度为1.1～1.3，得浓缩液。
(4)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到40％～80％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1～1.3，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到75％～90％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0～1.1，得浓缩液；(5)将处理过的大孔树脂湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用0％～40％醇洗脱除杂，再用50％～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液(6)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.15％～2.5％的药用活性炭，加热回流30分钟至2小时，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量赋形剂，使溶解用5～20％葡甲胺调节PH至5.0～7.0，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。
二、检测方法原茶儿醛检测分析按照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》一部2000附录VID)测定。
实验仪器 日本岛津LC-AT型HPLC色谱仪色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-冰醋酸-水(25∶1∶224)为流动相；检测波长为280nm。理论板数按原茶儿醛峰计算，应不低于1500。
对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒温的原茶儿醛对照品10mg，置100ml量瓶中，加入流动相至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。
样品溶液的制备将本发明冻干粉针0.25g，精密称定，置250ml量瓶中，加入流动相至刻度，摇匀即得测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
总酚酸检测分析照分光光度法(《中华人民共和国药典》一部2000附录V)测定。
实验仪器紫外分光光度仪752上海光谱仪器有限公司对照品溶液的配制 精密称取在105℃干燥至恒重的原儿茶醛对照品11.12mg，用70％的乙醇溶解，并转移至100量瓶中，摇匀，得对照品溶液(每ml含原儿茶醛11.12ug)。
标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml置于10ml量瓶中，分别加70％的乙醇至2ml，再各加0.0lmol/L十二烷基硫酸钠溶液0.8ml，铁氰化钾—三氯化铁显色剂0.4ml，摇匀暗处静置5min用lmol/L的冰醋酸稀释至10ml，在暗处静置30min。以空白溶液作参比，置1cm的吸收池中，在730nm处测定吸收度，以浓度对吸收值建立回归方程(r＞0.99)。
样品的含量测定将本发明冻干粉针0.2g，精密称定，置于100ml量瓶，用70％乙醇稀释至100ml，摇匀，精密取1ml，置于100ml量瓶，用70％乙醇稀释至100ml，得样品液。取样品液1.4ml，用70％乙醇稀释至2ml，按标准曲线项下同法操作。按线性回归方程计算含量。
川芎嗪检测分析照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》一部2000附录VID)测定。
实验仪器 日本岛津LC-AT型HPLC色谱仪。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相甲醇∶水(1％醋酸)＝35∶65，流速1ml/min，检测波长300nm，柱温25℃。理论板数按川芎嗪峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取川芎嗪对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含125.5ug的对照品溶液。
样品溶液的制备 将本发明冻干粉针0.5g，精密称定，置100ml量瓶中，加入流动相至刻度，摇匀即得测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
丹参和川芎二味中药组成的复方，具有活血化瘀，通脉养心之功效，用于冠心病心绞痛。药理研究证实具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，改善心肌缺血状态及抑制血液凝固，促进纤溶，改善血液流变性等功能，用于心、脑血管缺血性病变效果较好。应用该方法制备的冠心宁冻干粉工艺简单，降低了生产成本，并且稳定性好，质量高，疗效显著，运输贮存方便等优点。
具体实施例方式
实施例11、对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用实验动物及模型雄性wistar大鼠，体重200-250g。
实验药物冠心宁注射液本发明冠心宁冻干粉针剂实验仪器及试剂MDA试剂盒、SOD试剂盒、GSH·PX试剂盒及从P酶试剂盒，其他试剂为国产分折纯或生化试剂。高速台式离心机，XHF-1型高速分散器，高速冷冻离心机，U-754型分光光度计。
实验方法缺血再灌组用戊巴比妥(50ml/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定。开胸，结扎冠状动脉左前降支30min后，剪开结扎线再灌流20min造成缺血再灌注损伤模型。心肌缺血组仅结扎冠状动脉左前降支30min。
药物保护组于结扎冠状动脉前60min腹腔注射市售冠心宁注射液和本发明冻干粉针剂(1g生药/kg)，余操作同缺血再灌组。
对照组只穿线不结扎冠状动脉，余操作同缺血再灌注组。心肌细脑膜和线粒体的分离心脱细胞膜的分离按wollf[万福生，赵小曼，雷厉牛磺酸对大鼠心肌缺血损伤的保护中国药理学通报，1996；12(1)42]的方法进行，线粒体的制备按文献方法进行。蛋白定量采用Lowrry法，以牛血清白蛋白为标准品。AIP酶、SOD和GSD·PX活力分析心肌细胞膜Ca+2-ATP酶、K+-ATP酶、SOD及GSH·PX活力及线粒体中SOD和GSH·PX活力分析均严格按试剂盒说明进行。
MDA和心肌组织钙含量测定MDA含量测定按所购试剂盒说明进行。钙的测定采用原子吸收分光光度法。
实验结果(1)心肌细胞膜ATP酶活性变化 见表1(2)心肌中反映OFR指标的变化见 表2(3)心肌组织钙含量及MDA含量变化见 表3表1 心肌细胞膜ATP酶活性变化
注与缺血再灌组比较##0P＜0.01；与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01表2 心肌中反映OFR指标的变化
注与缺血再灌组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表3 心肌组织钙含量及MDA含量
注与缺血再灌组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01实施例2(1)原料药配比重量为丹参2000克，川芎2000克(2)将丹参与川芎混合，加水10量药材的水浸泡1小时，提取3次，第一次2小时，第二、三次加入8倍量的水，各提取1.5小时，合并煎液滤过得滤液。
(3)滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.1，得浓缩液2000ml。
(4)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到75％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到85％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0，得浓缩液750ml。
(5)将处理过的大孔树脂D101湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用洗脱除杂，至到molish反应显阴性，再用75％乙醇洗脱，洗脱至三氯化铁试液呈阴性反应，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液100ml。
(6)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.2％％的药用活性炭，加热回流30分钟，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量甘露醇20g，使溶解，用10％葡甲胺调节PH至6.5，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。制成粉针制剂100瓶(600mg/支)。[进行检测，制剂中原茶儿醛含量10.1mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量310mg/支，川芎嗪含量12.1mg/支]。
实施例3(1)原料药配比重量为丹参4000克，川芎4000克。
(2)将丹参与川芎混合，加水10量药材的水浸泡1小时，提取3次，第一次2小时，第二、三次加入8倍量的水，各提取1.5小时，合并煎液滤过得滤液。
(3)滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.1，得丹参和川芎浓缩液各2000ml。
(4)将浓缩液分别加入乙醇使含醇量达到75％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到85％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0，得各浓缩液750ml。
(5)将处理过的大孔树脂D101湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用洗脱除杂，至到molish反应显阴性，再用75％乙醇洗脱，洗脱至三氯化铁试液呈阴性反应，收集洗脱液，减压浓缩，得精制丹参和川芎浓缩液100ml。
(6)将上述所得精制浓缩液合并，溶于注射用水中，加0.25％％的药用活性炭，加热回流30分钟，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量甘露醇20g，使溶解，用10％葡甲胺调节PH至6.5，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。制成粉针制剂200瓶(600mg/支)。[进行检测，制剂中原茶儿醛含量10.5mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量312mg/支，川芎嗪含量12.5mg/支]。
实施例4(1)原料药配比重量为丹参2000克，川芎2000克(2)将丹参与川芎混合，加水10量药材的水浸泡1.5小时，提取3次，第一次2小时，第二、三次加入8倍量的水，各提取1.5小时，合并煎液滤过得滤液。
(3)滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.1，得浓缩液2000ml(4)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到75％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到85％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0，得浓缩液750ml。
(5)将处理过的大孔树脂HP-20湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用洗脱除杂，至到molish反应显阴性，再用75％乙醇洗脱，洗脱至三氯化铁试液呈阴性反应，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液100ml。
(6)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.25％的药用活性炭，加热回流30分钟，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量蔗糖20g，使溶解，用10％葡甲胺调节PH至6.5，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。制成粉针制剂100瓶(600mg/支)。[进行检测，制剂中原茶儿醛含量10.6mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量310mg/支，川芎嗪含量12.9mg/支]。
实施例5(1)原料药配比重量为丹参2000克，川芎2000克(2)将丹参与川芎混合，加水10量药材的水浸泡2小时，提取3次，第一次2小时，第二、三次加入8倍量的水，各提取1.5小时，合并煎液滤过得滤液。
(3)滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.1，得浓缩液2000ml。
(4)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到60％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到80％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0，得浓缩液750ml。
(5)将处理过的大孔树脂HP-20湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用洗脱除杂，至到molish反应显阴性，再用75％乙醇洗脱，洗脱至三氯化铁试液呈阴性反应，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液100ml。
(6)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.20％的药用活性炭，加热回流30分钟，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量乳糖20g，使溶解，用10％葡甲胺调节PH至6.0，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。制成粉针制剂100瓶(600mg/支)。[进行检测，制剂中原茶儿醛含量10.9mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量314mg/支，川芎嗪含量12.7mg/支]。
实施例6(1)原料药配比重量为丹参4000克，川芎4000克。
(2)将丹参与川芎混合，加水10量药材的水浸泡1.5小时，提取3次，第一次2小时，第二、三次加入8倍量的水，各提取1.5小时，合并煎液滤过得滤液。
(3)滤液减压浓缩至60℃时相对密度为1.15，得浓缩液3000ml。
(4)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到75％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到85％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.05，得浓缩液1200ml。
(5)将处理过的大孔树脂HP-20湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用洗脱除杂，至到molish反应显阴性，再用75％乙醇洗脱，洗脱至三氯化铁试液呈阴性反应，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液100ml。
(6)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.20％的药用活性炭，加热回流30分钟，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量甘露醇30g，使溶解，用10％葡甲胺调节PH至6.5，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针，制成粉针制剂200瓶(600mg/支)。[进行检测，制剂中原茶儿醛含量10.8mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量315mg/支，川芎嗪含量12.8mg/支]。
权利要求
1.一种治疗冠心病冻干粉针剂制剂，其特征是丹参与川芎经水提醇沉后，再过大孔树脂柱得到精制提取物，制备成冻干粉针制剂。
2.一种治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于以丹参和川芎为主要原料，采用丹参和川芎混合提取或丹参与川芎单独提取制备，均采用水提法提取，沉淀剂除杂，大孔树脂精制，再经过滤、精制；将精制提取物和冻干赋形剂用注射用水配制溶液，精制、分装、低温冷冻干燥，制得注射用冠心宁冻干粉。
3.根据权利要求1所述的治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将丹参与川芎，加水浸泡1～3小时，提取1～3次，每次1.5～2时，合并煎液滤过得滤液。(2)滤液浓缩至30℃～80℃时相对密度为1.1～1.3，得浓缩液。(3)将浓缩液加入乙醇使含醇量达到40％～80％，放置，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.1～1.3，进行第二次乙醇沉淀，加入乙醇使含醇量达到75％～90％滤过，放置，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0～1.1，得浓缩液；(4)将处理过的大孔树脂湿法装柱，加入上述浓缩液上柱，先用0％～40％醇洗脱除杂，再用50～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得精制浓缩液。(5)将上述所得精制浓缩液，溶于注射用水中，加0.15％～2.5％的药用活性炭，加热回流30分钟至2小时，冷却至室温，过滤至澄明，加入一定量赋形剂，使溶解，用5～20％葡甲胺调节PH至5.0～7.0，粗滤，精滤，分装于西林瓶，经低温冷冻干燥制得的注射用冻干粉针。
4.根据权利要求3所述的治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中丹参、川芎分别粉碎为粗粉，按照1∶1混合用水提取1～3次或分别提取1～3次。
5.根据权利要求3所述的治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中浓缩进行两次乙醇沉淀，沉淀乙醇浓度分别为40％～80％；75％～90％。其中第一次醇沉时乙醇浓度首选75％，第二次醇沉时乙醇浓度首选85％。
6.根据权利要求3所述的治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述大孔树包括D101，AB-8，D21、HP-20，其中首选HP-20，乙醇洗脱浓度为50～100％，首选65％乙醇洗脱。
7.根据权利要求3所述的治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述赋形剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖中的一种或几种混合物。
8.根据权利要求2所述的治疗冠心病冻干粉针剂制剂的制备方法，其特征在于成品总可测成分(原茶儿醛含量10～15mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量300～350mg/支，川芎嗪含量10～15mg/支)超过65％。
全文摘要
本发明是一种中药制剂，特别是用于治疗冠心病的冻干粉针制剂及其制备方法。以丹参和川芎为主要原料，采取以下任一方制备丹参和川芎混合提取；丹参与川芎单独提取。两种方法均采用水提法提取，沉淀剂除杂，大孔树脂精制，再经过滤、精制；将精制提取物和冻干赋形剂用注射用水配制溶液，精制、分装、低温冷冻干燥的注射用冠心宁冻干粉。成品总可测成分(原茶儿醛含量10～15mg/支，总酚酸(以原茶儿醛)含量300～350mg/支，川芎嗪含量10～15mg/支)超过65％。应用该方法制备的冠心宁冻干粉工艺简单，降低了生产成本，并且稳定性好，质量高，疗效显著，运输贮存方便等优点。
文档编号A61P9/10GK1857396SQ20061004989
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月17日 优先权日2006年3月17日
发明者耿海波 申请人:耿海波