专利名称：：一种制备难溶性药物脂质体制剂的新方法一种制备难溶性药物脂质体制剂的新方法发明领域本发明涉及制备脂质体制剂的新方法和通过这种方法生产的脂质体制剂。技术背景如何增加难溶性药物溶解度是目前药剂研究的一个热点，当前临床上使用的难溶性药物注射剂是由传统方法制成，如采用复合溶媒、增溶剂等，但这会增加处方的剌激性或毒性，临床应用时会引起过敏反应甚至引起抗药性。如紫杉垸类药物紫杉醇和多西他赛，对多种肿瘤都有很好的疗效，但由于其几乎不溶于水，故临床上应用的紫杉垸制剂采用CremopherEL或Tween80增溶制成的注射液，给药后，部分病人会出现药物性皮疹、呼吸急促、支气管痉挛、低血压等过敏反应，这是因为处方中CremopherEL或Tween80引起体内组胺释放所致，目前多采取给药前口服地塞米松等以防过敏反应，而且临床上使用时一旦稀释必须立即使用，并在规定时间内使用完，否则放置数小时即有药物析出，被在线滤器过滤，导致药效降低，因此需要寻找其他增溶方式来增加难溶性药物的溶解度。脂质体是由脂质双分子层形成的闭合囊泡状结构。脂质体根据其结构和粒径的不同可以分为①单室(层)脂质体，其中小单室(层)脂质体(SUV)粒径《100nm，大单室(层)脂质体(LUV)粒径在100-1000nm之间；②多室(层)脂质体(MLV)粒径《5pm;③含有表面活性剂的脂质体的多相脂质体。其中双分子层由具有疏水性"尾基"区域和亲水性"头基"区域的类脂单层所构成，在这样的双层膜结构中，类脂单层的疏水性(非极性)"尾基"朝向双层中心，而其亲水性"头基"朝向水相。脂质体己广泛用作药物载体，因为脂质体组成是人体细胞膜成分，结构也相近，已被认为生物相容性优良且最能够降低静脉注射的全身毒性，并同时达到与原剂型相同的疗效的一种给药系统。目前制备脂质体和用脂质体载药的方法很多，如薄膜分散法、逆相蒸发法、去污剂透析法、注入法、复乳法、熔融法、pH梯度法等，可以根据药物的性质选用。空白脂质体的工业化制备技术己经相对成熟，如乙醇注入法、喷雾干燥法等。对于两亲性药物可以通过跨膜梯度主动载药法制备脂质体，主要有pH梯度法和硫酸铵梯度法，两亲性药物如阿霉素、米托蒽醌、环丙沙星等可通过主动载药法制备，包封率可达90%以上。但是对于难溶性药物的脂质体，主要还是采用以薄膜分散法为基础的"被动载药法"，即将用于形成脂质体的脂质和药物溶于有机溶媒中，通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之后在减压的条件下除去有机溶媒形成干燥的脂质膜，在脂质膜水化时使用适当的机械力即可形成多层脂质体，然后使用恰当的方法如高压均质、超声、挤出控制粒径。此方法虽是最经典的方法，但是却存在许多缺点。如使用毒性有机溶媒；工业化生产有一定的难度。VanHoogerestP等报道了一种原位制备难溶性药物脂质体的方法(SupraVailTMInstantSolubilizationSystem),最终产品由两瓶液体组成，一瓶为采用磷脂水化-均质方法制备的平均粒径为50nm的空白脂质体，磷脂浓度为100mg/mL，缓冲液组成为2.5%甘油，10mM组氨酸(pH6.8)，另一瓶为药物和负电荷磷脂溶于有机溶剂中，如乙醇、PEG300、丙二醇、DMSO、N-甲基吡咯烷酮。临用前将药物溶液注入空白脂质体中，边注入边缓慢涡旋，形成平均粒径为50nm左右的含药脂质体(VanHoogevestP，etal.Instantsolubilizationofpoorlywater-solubledrugsbyin-situloadingofaqueousphospholipiddispersionssuitableforparenteraladministration,PDAJPharmSciTechnol.2006Nov-Dec;60(6):366-377.)。但是该法存在以下缺点一是使用2.5%-10%(v/v)的有机溶剂，可能会破坏脂质体的稳定性；二是使用高达10。/。的DMSO、N-甲基吡咯烷酮等有机溶剂易对人体产生不良反应；三是液体状态的空白脂质体和药物脂质溶液，制剂的稳定性无法保证，特别是对于50nm左右的小单层脂质体，易出现聚集、融合等现象，导致粒径变大；四是两瓶装，使用前需要混合、载药，临床操作不便。因此，需要方法更为简单可靠，工业化生产难度小的制备脂质体方法，来提高难溶性药物的溶解度，更加方便临床使用。
发明内容本发明的目的是提供一种制备难溶性药物脂质体制剂的新方法，仅需要将药物均匀分散在空白脂质水化液或空白脂质体混悬液中，通过常规的减少粒径步骤将脂质体粒径减少，工艺过程简单，易于工业化生产的载药脂质体。本发明的目的可以通过以下措施来实现一种制备在水中溶解度不高于100pg/mL的药物脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将处方量的脂质体材料加入有机溶剂中，加热使之充分溶解后除去有机溶剂，得空白脂质混合物，再加入水化介质后制得空白脂质水化液或空白脂质体混悬液；(2)将药物加入上述制备的空白脂质水化液中或空白脂质体混悬液中分散，得分散液；(3)将分散液通过均质或薄膜挤压或微射流方法循环重复操作，直至达到所需粒径范围的脂质体溶液；(4)除去脂质体溶液中未包裹的药物。本发明药物的可以选择为紫杉醇、多西他赛、喜树碱、多种喜树碱衍生物(SN38、HCPT等)，维甲酸、维替泊芬、环孢菌素、两性霉素B、地西泮、替尼泊苷、依托泊苷、鬼臼乙叉武、咪康唑、伊曲康唑、益康唑、酮康唑、芬替康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、氯康唑、异康唑、氟曲康唑、尼莫地平、卡马西平等。本发明的空白脂质体的制备可选用目前制备技术相对成熟的乙醇注入法、喷雾干燥法等方法，选用的脂质体材料是磷脂酰胆碱含量在80%~99%之间的磷脂。所述磷脂选自天然磷脂、合成磷脂、天然磷脂与合成磷脂的混合物；为了提高载药量，可加入适量带电荷的天然磷脂或合成磷脂。本发明的天然磷脂选自蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化蛋黄磷脂(HEPC)、蛋黄磷脂酰甘油(EPG)、蛋黄磷脂酰丝氨酸(EPS)、氢化蛋黄脑磷脂-PEG2000(HEPC-PEG2000)、大豆磷脂(SPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)或氢化大豆脑磷脂-PEG2000(HSPE-PEG2000)中的一种或多种。合成磷脂选自二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DSPE-PEG2000)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DPPE-PEG2000)或二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DMPE-PEG2000)中的一种或多种。由于注射用天然磷脂的价格大大低于合成磷脂，所以我们优选天然磷脂，但这并不意味着合成磷脂不适用于本发明。本发明的水化介质是指为pH5.07.8的缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，柠檬酸缓冲液，丁二酸缓冲液；pH进一步优选5.56.5。水化介质中可以含有冻干保护剂，合适的冻干保护剂选自海藻糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖或乳糖。本发明的制备方法中，将药物粉末和空白脂质体混悬液或空白脂质水化液混合，分散均匀。在本发明中的难溶性药物可以是粉末或者经过微粉化。药物用量和总脂质的重量比为1:101:80。本发明脂质体材料中还可以包含胆固醇，用于调节磷脂膜性质；胆固醇与脂质的重量比为0:10.5:1。本发明还可以加入抗氧化剂，合适的抗氧化剂选自a-生育酚、a-生育酸琥珀酸酯抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二丁基苯酚(BHT)或没食子酸丙酯中的一种或多种；抗氧化剂与磷脂的重量比为0丄5-l:5。空白脂质体可以是多层脂质体或者大单层脂质体，甚至可以是脂质水化液，混悬液用超声或高压均质机制备脂质体至所需的粒径和均匀度，也可通过挤压设备把多层脂质体在一定压力下通过相应孔径的微孔膜来达到，脂质体的平均粒径为40-500nm。经0.22Mm微孔膜过滤除菌，分装，2'C-8'C下保存或冻干保存至使用。本方法制备的脂质体冻干粉针复溶后，脂质体的包封率不低于90%,其中不包含药物晶体沉淀。本发明的有益效果表现在本发明可以极大地提高难溶性药物在水性介质中的溶解度，避免了注射给药时由于其中表面活性剂增溶而引起的毒副作用。本发明的制备方法非常适合工业化大生产，可以不使用氯仿、甲醇等有机溶剂，生产的安全性大大提高；药脂比高，接近于常规的制备方法，可以代替常规的制备方法；空白脂质体的生产工艺较为成熟，如乙醇注入法制备空白脂质体等，解决了目前难溶性药物脂质体工业化生产困难的问题。在支持本发明的研究中，选用多西他赛作为模型化合物，室温时，多西他赛在水中的溶解度为3pg/mL左右，应当理解的是，本发明的组合物和方法还期望用于本发明的其他难溶性化合物，包括紫杉醇、多西他赛、喜树碱及其衍生物、维甲酸、维替泊芬、环孢菌素、两性霉素B、地西泮、替尼泊苷、依托泊苷、鬼臼乙叉甙、咪康哇、伊曲康唑、益康唑、酮康唑、芬替康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、氯康唑、异康唑、氟曲康唑、尼莫地平、卡马西平等。本发明多西他赛脂质体冻干粉针稀释稳定性良好，室温放置12h未见有药物晶体析出。本发明制备的脂质体与常规方法制备的脂质体相比，释放度无显著性差异，药代动力学曲线及所计算的药代动力学参数均无显著性差异。图l、多西他赛脂质体冻干前的粒径分布2、多西他赛脂质体冻干复溶后的粒径分布3、本发明制得的脂质体与常规方法制得的脂质体体外释放曲线图4、大鼠静脉本发明制得的脂质体与常规方法制得的脂质体平均血浓经时曲线具体实施方式以下实施例将对在此所述的本发明作进一步说明，但并不对本发明的范畴作任何限制。实施例1称取大豆磷脂(SPC)25g，DSPE-PEG20001.5g，胆固醇2.4g和a-生育酚O.lg溶解于20mL40-45。C无水乙醇溶液中，将溶解的类脂溶液快速加入到恒温(40-45'C)的lOmM磷酸盐缓冲液500mL(pH6.5)中，并继续搅拌lh形成的脂质体混悬液，加入多西他赛lg，在室温下搅拌2h，通过高压均质机均质至80土10nm。用聚砜真空纤维超过滤器进行膜渗滤，交换8体积的蔗糖溶液来除去残留乙醇，保持工作流的温度为20-30°C，用10。/。蔗糖-10mM磷酸盐溶液定容并调节多西他赛浓度为2mg/mL，0.22pm的微孔滤膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2'C-8'C下保存或者冻干保存至使用。实施例2称取蛋黄磷脂(EPC)30g，蛋黄磷脂酰甘油(EPG)1.5g和a-生育酚0.12g，加到500mL无水乙醇中，超声混合至溶解，喷雾干燥法除去有机溶剂，并将得到的脂质粉末于35r的真空干燥箱中放置过夜；配制20mM的丁二酸钠溶液，将蔗糖溶解于丁二酸钠溶液作为水化液，并用适量丁二酸将pH值调节至5.5，水化温度为4(TC，得多室脂质体混悬液；加入微粉化的多西他赛1.5g，继续搅拌2h，高压均质机均质至平均粒径为120土10nm，用水化液定容并调节多西他赛的浓度为3mg/mL，0.22pm的微孔滤膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2"-8'C下保存或者冻干保存至使用。比较实施例2常用制备方法选用蛋黄磷脂(EPC)30g，蛋黄磷脂酰甘油(EPG)1.5g和a-生育酚0.12g，溶于氯仿-甲醇(2:1)溶液并混合均匀；用减压蒸发法将有机溶剂除去，形成脂质混合物;配制20mM丁二酸钠液，将蔗糖溶解在丁二酸钠溶液作为水化液，适量丁二酸调节pH至5.5，水化温度为4(TC，得多室脂质体混悬液；水化完全后用高压均质机均质至平均粒径为120土10nm，用水化液定容并调节至多西他赛的浓度为3mg/mL，0.22pm的微孔滤膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2。C-8。C下保存或者冻干保存至使用。实施例3称取二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)24g，大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)4.8g和a-生育酚0.2g，加到200mL乙醇溶液中，搅拌使脂质溶解并混合均匀，用减压蒸发法将乙醇除去，形成脂质混合物；配制10mM柠檬酸钠溶液，将海藻糖溶解在柠檬酸钠溶液作为水化液，水化温度一般在55'C士5。C之间，得多室脂质体混悬液；水化完全后加入多西他赛4g，继续搅拌4h，用高压均质机均质至平均粒径为100±10nm，水化液定容并调节多西他赛的浓度为4.0mg/mL，经0.22pm的微孔滤膜过滤除菌，分装即得成品，成品可在2。C-8'C下保存或者冻干保存至使用。实施例4稀释稳定性取实施例l所制备的样品，用5%葡萄糖注射液稀释至0.74mg/mL，所得脂质体混悬液室温放置，定时取样，对药物含量、有关物质、脂质体的粒径、包封率进行检测，同时用显微镜对脂质体中药物的析出情况进行考察，结果见表1。表1多西他赛脂质体稀释稳定性考察Oh2h4h8h12h含量(％)有关物质(％)平均粒径(nm)包封率(％)显微镜观察100.20.59099.15无结晶析出100.30.79299.23无结晶析出100.10.69599.17无结晶析出99.71.29499.02无结晶析出98.12.010098.58无结晶析出实施例5体外释放实验取实施例2所制备的两种样品(常规法制备的记为脂质体l,本法制备的记为脂质体2)，进行体外释放比较。试验方法将预处理过的透析袋在释放介质中浸泡过夜，精密称取按实施例2制备的多西他赛脂质体冻干粉针，蒸馏水复溶后用5%葡萄糖稀释至多西他赛浓度约为0.5mg/mL，取1mL置于透析袋内，两端扎紧后，绑于溶出仪的小浆上，放入盛有100mL1M水杨酸钠-pH7.4PBS缓冲液的溶出小杯中，在100r.min-'和(37±0.5)'C介质温度下进行体外释放实验。按设定时间间隔(0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，7，8，24h)取5mL释放介质测定浓度，并补充5mL释放介质，HPLC测定释放介质中的多西他赛浓度，计算药物累积释放百分率。释放结果表明两种不同工艺制备的脂质体体外释放无明显差异。实施例6大鼠药动学实验多西他赛脂质体按实施例3制备，浓度为4.0mg/mL(常规法制备的记为脂质体1，本法制备的记为脂质体2)，临用前用5%的葡萄糖配制成lmg/mL。选取SD大鼠12只，雌雄各半，随机分成两组，一组大鼠尾静脉推注常规法制得的脂质体，另一组推注本法制得的脂质体，均以10mg'kg"的剂量给药。给药后2min，5min，10min，30min及lh，1.5h，2h,4h，6h眼眶静脉取血250pL，离心，取血浆lOO^iL,血样经预处理后，进行液质联用(LC-MS)测定血浆中多西他赛含量。将体内药物浓度数据用统计距法进行处理，得非房室模型参数见表2，统计距结果表明，脂质体l与脂质体2的平均滞留时间(MRT)分别为24.96和17.89min，AUQ-t分别为606.36和649.79吗min/mL，AUC0.~分别为611.41和653.57pg'min/mL。实验动物各时间点血浓的平均值与时间的关系见附图4，可见，本发明制得的脂质体与常规方法制得的脂质体之间的药代动力学曲线及所计算的药代动力学参数均无显著性差异。表2统计距估算的药代动力学参数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种制备在水中溶解度不高于100μg/mL的药物脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将处方量的脂质体材料加入有机溶剂中，加热使之充分溶解后除去有机溶剂，得空白脂质混合物，再加入水化介质后制得空白脂质水化液或空白脂质体混悬液；(2)将药物加入上述制备的空白脂质水化液中或空白脂质体混悬液中分散，得分散液；(3)将分散液通过均质或薄膜挤压或微射流方法循环重复操作，直至达到所需粒径范围的脂质体溶液；(4)除去脂质体溶液中未包裹的药物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于药物可以选自紫杉醇、多西他赛、喜树碱、SN38、HCPT、维甲酸、维替泊芬、环孢菌素、两性霉素B、地西泮、替尼泊苷、依托泊苷、鬼臼乙叉武、咪康唑、伊曲康唑、益康唑、酮康唑、芬替康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、氯康唑、异康唑、氟曲康唑、尼莫地平或卡马西平。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脂质体材料是磷脂酰胆碱含量在80%~99%之间的中性或带电荷磷脂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的中性或带电荷磷脂选自天然磷脂、合成磷脂、天然磷脂与合成磷脂的混合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于天然磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、蛋黄磷脂磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、氢化蛋黄脑磷脂-PEG2000、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、大豆磷脂酰甘油、大豆磷脂酰丝氨酸或氢化大豆脑磷脂-PEG2000中的一种或多种；合成磷脂为二油酰磷脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000或二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于药物可以是粉末或经过微粉化的。7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于所述药物与磷脂的重量比为1:1(M龍8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于脂质体材料中还可以包含胆固醇；胆固醇与磷脂的重量比为0:10.5:1。9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于脂质体材料中还可以包含抗氧化剂，所述抗氧化剂选自a-生育酚、ci-生育酸琥珀酸酯抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二丁基苯酚(BHT)或没食子酸丙酯中的一种或多种；抗氧化剂与磷脂的重量比为0.1:5-1:5。10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于载药脂质体的平均粒径是40nm500nm。全文摘要本发明提供了制备难溶性药物脂质体制剂的一种新方法，仅通过分散及减小粒径步骤即可将药物载入空白脂质体的双分子层膜上，制备方法简单。由于目前空白脂质体工业化生产已经非常成熟，故易于实现脂溶性药物脂质体的工业化生产。文档编号A61K31/337GK101244039SQ20081001987公开日2008年8月20日申请日期2008年3月20日优先权日2008年3月20日发明者刘春晖,林巧平,王青松,许向阳申请人:江苏先声药物研究有限公司