口蹄疫的抗原化抗体疫苗的制作方法

专利名称：口蹄疫的抗原化抗体疫苗的制作方法
口蹄疫的抗原化抗体疫苗
本发明涉及能引发抗口蹄疫之免疫力的疫苗。
抗体是身体免疫系统对侵入体内的已知为抗原的外源物质作出反 应而产生的蛋白质。疫苗可引发免疫应答，随即可保护宿主免受致病 剂(抗原)的感染。
通常，疫苗由致病生物体或其部分组成。组成疫苗的生物体或其 某些部分经常是灭活的或减毒的以使宿主体内的致病生物体失去部分 或全部的致病能力。在大多数情况下，当在体外培养细菌，和某种程 度上为病毒时，它们会慢慢失去在生物体内生存并繁殖的能力。
有多种方法可产生疫苗，大多数类型的疫苗包括病毒疫苗，生物 药物疫苗，多抗原-肽疫苗和多蛋白疫苗。
口蹄疫(下文也称之为FMD)是感染所有偶蹄动物的高传染性，严 重导致衰弱的疾病。该病在世界上很多发展中国家流行，尤其是，亚 洲的猪经常被FMD感染。FMD降低家畜的生产率，带来很高的免疫 接种花费，限制了家畜和家畜产品的国际贸易。FMD是病毒传染性疾 病，口蹄疫病毒(下文也称之为FMDV)是具有约8000个核苷酸长的单 链有义RNA基因组的小的动物病毒。
针对FMD已产生了两种主要类型的疫苗，它们是常规疫苗和合成 的肽疫苗。抗FMDV的常规疫苗可使用灭活的FMD病毒或活的减毒 FMD病毒。尽管常规疫苗方法一般是有效的，但还有几个相伴随的不 符合要求的缺点。
首先，它在花费上不合算。这一类型的疫苗由大量活的传染性病 毒制成，维持和加工大量传染性病毒是昂贵的，费力的，还需占用大 量空间。
第二，也是最重要的缺点是.，这些疫苗具有潜在的危险性。最近 几年大多数FMD的突然蔓延是由疫苗生产单位泄漏病毒引起的，或者
是由使用未完全灭活或未充分减毒的病毒引起的。例如，本世纪80年
代，包括意大利，英国，法国的欧洲国家发生了多次口蹄疫大流行，
台湾于1996年也发生了口蹄疫大流行。由于经常发现导致口蹄疫流行 的病毒与欧洲生产厂家所用的毒株密切相关或甚至相同，最初的口蹄
疫大流行可能是由未充分灭活的疫苗或由疫苗生产厂泄漏的病毒引起 的。
另一个与生产常规疫苗相关的问题是它们是热不稳定的。当暴露 于升高的温度中时，常规的FMD疫苗相对不稳定，不得不将它们置于 低温中保存。持久地维持所需的低温经常是难以做到的，特别是在热 带国家更是如此。
常规疫苗生产方法之病毒培养方案中的另外一个潜在问题是使 用胎牛血清病毒培养。疾病可能由胎牛血清传入并影响经免疫的动物。
使用常规FMD疫苗的另一个主要缺点是使用常规方法产生的大 多数疫苗是灭活的组织培养病毒的相对粗的制品。这种组织培养的混 合物可导致严重的副作用，如变应性反应和易感家畜的流产。
较新形式的FMDV疫苗不使用灭活的病毒。它们是合成的肽疫苗 和重组蛋白疫苗。FMDV病毒蛋白l(VPl)上的免疫显性位点的鉴定为 设计合成肽和重组蛋白FMD疫苗提供了新的思路。与常规疫苗相比， 这两种类型的疫苗在生产和应用中都是安全的。它们也很容易处理， 储存，运输，经设计能符合特殊的需要。
在每个末端加上半胱氨酸残基之后，用戊二醛或空气氧化使VP1
的141a.a.-160a.a.肽聚合化，从而开始合成的FMDV肽疫苗研究，发现 未偶联的肽可成为免疫原性的肽。1987年，Francis及其同事报道了具 有游离巯基的C末端半胱氨酸的存在可大大增加游离的141-160a.a.肽 的免疫原性。当加上多个半胱氨酸残基时也可得到类似的结果。这表 明游离巯基半胱氨酸残基的存在可以形成导致更适宜的二级结构的肽 二聚体，所述二级结构可在体内导致免疫复合物的形成(Francis， 1995)。 根据这一思路，将串联重复(Cys 137-162(x2))的免疫原性与单拷贝Cys 137-163肽的免疫原性相比较，发现串联重复的FMDV肽一般比单拷贝 的二硫键二聚体的免疫原性更强。增加半胱氨酸残基可导致二硫键四 聚体结构的形成，该结构可进一步改善免疫应答。
使用Tam多抗原肽(MAP)系统(Tam 1988)进一步检测多拷贝合成 肽的想法。该系统可以在分支赖氨酸骨架上固相合成肽抗原以产生几 个多赖氨酸八聚体构建体。具有多拷贝肽的该系统导致大大增强的免 疫应答。
为了应用多拷贝FMDV肽，通过将小的肽序列与编码较大蛋白质 的基因融合应用了重组DNA技术。这些较大的重组疫苗蛋白质具有多 个特点。与通过化学交联制备的那些结构相比，将肽与载体连接的目 的是提供完全均一和确定的结构以提供免疫原(Francis， 1991)。首先使 单或多拷贝的FMDV免疫原性肽与细菌蛋白质，P-半乳糖苷酶的N-末 端融合以研究此方法(Broekhuijsen等，1986; Winther等，1986)。选择P-半乳糖苷酶的原因是已表明它可引发产生针对位于N末端的VP1表 位的抗体，它也含有几个T细胞表位(Krzych等，1982;Manca等，1985)。 已发现这个多拷贝FMDV肽-(3-半乳糖苷酶重组蛋白的免疫原性与使用 赖氨酸背景系统得到的(Broekhuijsen等，1987)相类似。
然后，使用与乙肝病毒核心抗原(HBcAg)之N末端融合的FMDV
肽序列进一步开发多个肽的提供以产生HBC融合颗粒。据报道这一
27nm的杂合蛋白颗粒能完全保护豚鼠，其结果与灭活的FMDV VP1 142a.a.-160a.a.肽所引发的相似，可保护动物免受攻击性感染。
尽管最初是有希望的，但合成肽方法和重组蛋白疫苗方法似乎存 在缺点，其中有三级结构的可预见性差和免疫原性弱。如果肽表现出
其所需功能必需的三维水平上特定的构象的话，溶液中的肽却以不总 是最适于受体结合(B细胞受体和可能是T细胞受体和主要组织相容性 基因产物)的构象存在。
在合成肽相对较小的情况下，注射后容易在体内降解。因此，它 们在提供长期免疫应答方面不是很有效，这可能是因为重组蛋白疫苗 不能表现出适当的构象。另外，肽合成是昂贵的，可导致疫苗的高生 产花费。如上所述，通过与(3-半乳糖苷酶或HBcAg类的微生物蛋白质 之N末端融合可在肽疫苗上提供FMDV表位。然而，使用(3-半乳糖苷 酶可引发很多额外的和不必要的免疫应答(Bona等，1994)。用此重组蛋 白疫苗重复免疫之后，可产生如即发性超敏反应的副作用，导致动物 患严重的枯草热和气喘病。
核酸疫苗或DNA疫苗代表着控制传染因子的新方法。这些新疫苗 易于设计和制备。使用重组DNA技术将编码用作免疫原的一种或多种 蛋白质的DNA序列克隆至真核表达载体中。
抗原化抗体是其可变区经基因工程改造可表达不同抗原之表位的 抗体。抗原化抗体可用作针对特异性B或T细胞表位产生免疫应答的 免疫原。因此，抗原化抗体可用于替代常规或合成肽免疫接种法。
因此，既可提供安全的可能性又可提供效力的最有效的疫苗类型 是抗原化抗体疫苗。抗体的抗原化方法由下列步骤组成，即将得自非 免疫球蛋白之抗原的肽表位移植到抗体分子的互补决定区("CDR")环中。由于CDR环暴露于抗体分子的表面，它们为抗体的抗原性作出了
主要的贡献。与上述合成疫苗不同的是，抗原化抗体经由Fc受体耙向 抗原呈递细胞，籍此使II类主要组织相容性(MHC)分子的抗原呈递最 大化。抗原化抗体也为B细胞提供了连续不断的抗原肽来源以在I类 MHC分子中呈递。除了 B细胞水平上的免疫原性外，抗原化抗体作为 经加工的肽产物起作用以产生Th-细胞免疫原性。
因此，本发明的目的是提供抗口蹄疫的抗原化抗体疫苗以提供克 服了现有技术的一些缺点，较安全，更便宜和/或更有效的疫苗产品， 并为公众提供有用的选择。
尽管使用的是与奶牛IgG连接的奶牛FMDV病毒表位，本发明仍 可用于抗猪FMD，该疫苗也可用于如奶牛等的其它动物。
本发明由疫苗组成，所述疫苗的功能可由四种不同形式提供，即 两种蛋白质疫苗构建体和两种相关的DNA疫苗对应物构建体。该疫苗 所有的形式都提供抗猪FMD和FMDV的免疫功能。特别的是，蛋白 质形式的疫苗是抗原化抗体疫苗；此肽序列含有取代猪IgG之CDR环 的FMDV表位或FMDV单个或串联重复的表位由猪IgG重链恒定区蛋 白质携带的嵌合蛋白。
例如，用基因工程的方法改造用于移植到CDR中的特定FMDV 表位。当单个IgG载体为质粒形式时，对应于第一种形式蛋白质疫苗 的第一种形式的DNA对应物利用FMDV表位cDNA序列。对应于第 二种形式蛋白质疫苗的第二种形式的DNA对应物利用FMDV表位 DNA序列，所述序列不同地与猪IgG的重链恒定区cDNA连接。另夕卜， 可使用此疫苗进行抗猪FMD或FMDV的免疫接种方法。施用此疫苗 的方法各不相同，对于蛋白质形式的疫苗而言，可通过例如常规的注 射来给药。当施用DNA形式的疫苗时，使用表皮基因枪或注射给药。
利用实施例并参照附图可解释本发明优选的实施方案，其中
图la图解显示了使用猪IgG的抗原化抗体疫苗的结构即使用猪 IgG的抗原化抗体疫苗，FMDV表位取代了猪IgG重链和轻链上的 CDR2禾卩CDR3区域；
图lb图解显示了使用FMDV单个或串联重复表位的抗原化嵌合 疫苗的结构即使用与猪IgG重链恒定区连接的FMDV单个或串联重 复表位的抗原化抗体疫苗；
图2a显示了抗原化抗体疫苗的相应cDNA,该疫苗使用IgG cDNA 作为质粒载体即使用猪IgGcDNA为质粒载体的DNA疫苗，FMDV 表位DNA序列被移植到猪IgG重链和轻链cDNA的CDR2和CDR3 区域；
图2b显示了抗原化嵌合疫苗的相应cDNA，该疫苗使用FMDV单 个或串联重复表位即使用与猪IgG重链恒定区cDNA连接的单个或 串联重复FMDV表位DNA序列的DNA疫苗；
图3显示了抗原化抗体重链分子的氨基酸序列，其中CDR3区域 被FMDV VP1 aa 200至213取代；
图4显示了图3所示氨基酸相应的cDNA序列；
图5显示了抗原化抗体重链分子的氨基酸序列，其中CDR3区域 被FMDV VP1 aa 141至160取代；
图6显示了图5所示氨基酸相应的cDNA序列；
图7显示了抗原化嵌合疫苗分子的cDNA序列，黑体部分表示 FMDV VP1的表位(aa 141至160, aa 200至213)，其余序列属于猪IgG 重链恒定区；
图8显示了抗原化嵌合疫苗分子的蛋白质序列，黑体部分表示 FMDV VP1的表位(aa 141至160， aa 200至213)，其余序列属于猪IgG 重链恒定区；
图9显示了对应于图8中IgG轻链之cDNA序列的4个cDNA序
列；


图10显示了编码IgG轻链的4个氨基酸序列，黑体序列是构架区 域，下划线序列是CDR区域，CDR2或CDR3序列可被相应的FMDV表位序列取代；
图11A显示了所发生的重叠(延伸)PCR:即两个阶段发生的重叠/ 延伸PCR，首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增Ck/CDR3区域。 CDR3的寡核苷酸是互补的，较长的引物3也含有VP1 141-160或 200-213残基，这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(a和b);
图11B显示了所发生的重叠(延伸)PCR:即两个阶段发生的重叠/ 延伸PCR。首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增CH/CDR3区域。 CDR3的寡核苷酸是互补的，较长的引物7也含有VP1 141-160或 200-213残基，这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(c和d)。
本发明基于一种新的抗FMD疫苗类型，这种新的疫苗类型可引发 抗FMD的免疫应答。本发明由编码FMDV表位之cDNA序列的基因 工程改造构成。疫苗也含有猪IgG cDNA构建体作为FMDV表位的载 体。通过将FMDV肽表位移植到猪IgG CDR环或将FMDV表位与图 lb所示的猪IgG恒定区连接进行FMDV表位和猪IgG蛋白质形式的缀 合。
因此，如图la和lb所示，将得自FMDV的肽表位移植到猪抗体 CDR环中可产生蛋白质形式的抗原化抗体疫苗分子。通过以FMDV之 VP1基因为基础进行PCR可合成FMDV肽表位。使用重叠PCR法将 FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内。所 得抗原化抗体基因被克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至CHO或 骨髓瘤细胞中。
本发明的疫苗实际上具有两个优选的类型，每个类型具有两种优 选的形式，因此，如图la，lb和图2a，2b所示，本发明总共有4种不同 的实施方案将在本文中讨论。其中两种是蛋白质形式(图la, lb)，已知 它们是可通过注射给药的抗原化抗体疫苗。第一种类型是利用猪IgG 蛋白为FMDV表位的载体，并被注射至猪肌肉组织的抗原化抗体疫苗。 第一种形式的这种抗原化抗体疫苗(图la)将FMDV表位插入到猪IgG重链和轻链的CDR2和CDR3区域内。第二种形式的这种抗原化抗体 疫苗C图lb)利用了仅与猪IgG重链恒定区连接的单个或串联重复的 FMDV表位，形成了嵌合的蛋白质。因此，第二种形式的这种抗原化 抗体疫苗也被称为抗原化嵌合疫苗。
本发明的第二种类型被称为裸露的DNA疫苗，通过基因枪注射可 施用该疫苗。各种DNA形式具有相应的蛋白质形式的对应物。两种形 式的这种裸露的DNA疫苗对应于上述的其蛋白质对应物。施用后，宿 主细胞机制可表达这两种DNA形式。相应的蛋白质等同物可直接施用 于动物，其功能与裸露的DNA疫苗形式相同。第一种形式的这种裸露 DNA疫苗将FMDV表位DNA序列移植到猪IgG重链和轻链cDNA的 CDR2和CDR3区域内。第二种形式的这种DNA疫苗利用仅与猪IgG 重链恒定区cDNA连接的FMDV表位DNA序列(图4)。当转录和翻译 过程在宿主细胞机器内产生产物时，这两种形式的裸露DNA疫苗将分 别发挥两种形式的抗原化抗体疫苗的功能。
疫苗的构建包括三个主要的步骤，即l)克隆猪单个IgG重链恒定 区，和猪轻链，2)将两个FMDV免疫原的序列连接在一起和3)将猪IgG 单个重链恒定区与FMDV免疫原的序列连接在一起，然后插入细菌表 达载体。该方法的细节解释如下。
l)克隆猪单个IgG重链恒定区
使用可商购的试剂盒(mRNA制备试剂盒，Pharmacia),根据厂商 的描述进行猪脾脏mRNA的提取和纯化。简单地说，用1.2ml提取缓 冲液匀浆3g新鲜猪脾脏，用2.4ml洗脱缓冲液稀释经匀浆的组织提取 物并彻底混合。将匀浆物转移到无菌试管中，离心1分钟得到澄清的 匀浆物。将lml澄清的匀桨物放在寡(dT)-纤维素小球顶端。将试管倒 转3分钟以重新悬浮寡(dT)-纤维素。于16,000Xg下离心IO秒钟以收 集沉淀物，为了进行洗涤，用lml高盐缓冲液将寡(dT)-纤维素洗涤5 次，并于16,000Xg下离心IO秒钟，接着用lml低盐缓冲液洗涤3次，并于16，000Xg下离心10秒钟。然后将沉淀物重新悬浮于0.3ml低盐 缓冲液中并转移到MicroSpinTM柱上，将该柱全速离心5秒钟，弃去 流出液，用新的收集管替代旧管，重复2次此步骤。将柱置于无菌微 量离心管中，加入0.2ml预温的洗脱缓冲液，全速离心5秒钟以收集含 mRNA的洗脱物。在样品中加入10ml糖原溶液和1/10体积的醋酸钾溶 液，将样品与500ml 100%乙醇混合并在—20。C下放置至少30分钟。于 4°C， 14,000 rpm下离心5分钟以收集沉淀的mRNA。弃去上清液，将 沉淀的mRNA溶解于经DEPC-处理的水中。通过260nm下的UV吸收 测定RNA的量。
RT-PCR分析
使用一套猪IgG 5'和3'特异性引物，通过RT-PCR扩增编码猪IgG 重链恒定区的cDNA片断。使用猪IgG3'特异性引物引发由总RNA合 成第一条cDNA链。于37'C，通过MMLV逆转录酶进行逆转录60分 钟，于70。C终止15分钟。在猪IgG5'特异性引物的存在下，通过PCR 扩增cDNA产物。PCR的设置如下，并进行30轮循环94'C变性1分 钟，50'C退火1分钟，72'C延伸2分钟，最后于72'C延伸6分钟。在 1.0。/。低融点琼脂糖凝胶上分级分离PCR产物，使用苯酚:氯仿提取和乙 醇沉淀从凝胶中纯化大小相当于IgG重链恒定区的带。然后将DNA与 较后的FMDV免疫原的序列(F1)连接。
由猪IgG基因(Kacskovics等，1994)设计所用的PCR引物，引物序 列如下
猪lgG3'特异性引物
5' GAC GCT CGA GTC ATC ATT TAC CCT GAG T 3'
猪lgG5'特异性引物
5' AGC TAA GCT TGC CCC CAA GAC GGC CCC A 3' 2)连接两个FMDV免疫原的序列
制备对应于FMDV的VPl(Kurz等，1981)之残基141-160和200-213(以残基155-160序列为重叠区域制备两个序列)的两个寡核苷 酸序列。通过重叠PCR连接两个序列。PCR设置如下并进行5轮循环 94'C1分钟，63。C3分钟。使用两个引物VP1 3'引物和VP1 5'引物在3' 末端加上一个Hind III限制性位点，在5'末端加上一个Nde I限制性位 点。PCR的设置如下，并进行24轮循环94'C变性1分钟，5(TC退火 1分钟，72'C延伸2分钟，最后于72'C延伸6分钟。在1.5%低融点琼 脂糖凝胶上分析PCR产物，切下具有正确大小的产物并纯化之。将连 接的片断称为FMDV-免疫-序列。由 VP1 141a.a,160a.a.和 200a.a,213a.a. (Kurz等，1981)设计所用的VP1 3'和5'引物，引物序列如 下
VP1 5'引物
5' ATG CCA TAT GGT ACC AAA C 3' VPl 3'引物
5' ATG CAA GCT TCA ACT TCT G 3'
图11A阐明了两个阶段发生的重叠(延伸)PCR。首先，扩增 CDR1/CDR2区域，同时扩增Ck/CDR3区域。CDR3的寡核苷酸是互补 的；较长的引物3也含有VP1 141-160或200-213残基。这使得在随后 的PCR中可融合这两个产物(a和b)。图IIB阐明了两个阶段发生的重 叠(延伸)PCR。首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增CH/CDR3区 域。CDR3的寡核苷酸是互补的；较长的引物7也含有VP1 141-160或 200-213残基。这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(c和d)。
3)连接猪IgG单个重链恒定区，FMDV-免疫-序列片断和细菌表达
载体
用Nde I和Hind III消化上述片断；用Hind III和Xho I消化猪单 个IgG重链恒定区，用Nde I和Xho I消化细菌表达载体。通过苯酚/ 氯仿提取和乙醇沉淀纯化这3个经消化的片断，然后于16。C使用T4 DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化到JM109中，通过微量质粒分 离，再通过限制性酶消化筛选菌落。通过DNA测序分离和检査正确克隆的质粒。最后，将正确的质粒转化到大肠杆菌BL(21)DE3pLysE中， 质粒被称为pFl-IgG。
因此，本发明可提供抗口蹄疫的抗原化抗体疫苗，以提供克服了 现有技术的一些缺点，较安全，更便宜和/或更有效的疫苗产品。
本发明想在本文所述的整个内容中掺入等价物，其中这种等价物 对本领域技术人员而言是显而易见的。本发明的内容是利用实施例提 供的，但并不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权 利要求书限定。
序列表
:110:
:120:
:130:
:160:
:210: :211: :212: :213: :400:
香港科技大学 U蹄疫的抗原化抗体疫苗 SP工081546-01 22
470 PRT
Sus sp.
Met Glu Phe Arg Leu Asn
Val Gin Gly Glu Glu Lys 20
Trp Val Val 10
Leu Phe Ala Leu 15
Leu Val 25
Pro Gly Gly 35
Ser Leu Lys Leu Ser 40
Ser Ser 50
Glu Trp 65
Thr
Lieu
Asp Ser Val
Tyr lie His 55
Ala Gly Leu 70
Lys Gly Arg 85
Trp Tyr* Phe
Val
Ser
Glu Ser Gly Gly Gly 30
Cys Val Gly Ser Gly 45
Arg Gin Ala Pro Gly 60
Leu Gin Gly
Leu Val Gin
Phe Thr Phe
Lys
Ser Thr Thr Pro Thr Tyr 75 80
Gly Leu Tyr Ser
Asp工le 90
Thr Ala
Tyr Leu Gin Met 100
Asn Gly Leu 105
Tyr Tyr Cys 115
Gin Lys 130
Lys Thr 145
Leu
Ala
Gly Lys Arg His Lys Gin 120
Trp Gly Pro Gly Val Glu 135
Pro Ser Val Tyr Pro 150
Ser Arg Glu Asp
Lys Thr Glu Asp 110
Glu工le Val Ala 125
Ala Gin Asn
Thr
Pro
Ala Arg Val Lys
Val Val 140
Val Ser Ser Ala Pro
Leu Ala 155
Pro Cys Gly Arg Asp Val 160
Ser Gly Pro
Asn Val 165
Ala Leu
Glu Pro
Val Thr 180
Val Thr Trp
Gly Cys 170
Asn Ser 185
Leu Ala
Gly Ala
Ser Ser 175
Leu Thr 190
His Thr Phe Pro 195
Ser Met Val Thr 210
Cys Asn Val Asn 225
Ser Val
Leu Gin Pro 200
Ser
Gly Leu Tyr 205
Tyr Phe Pro Ser Gly Val Ser Leu Ser
Val Pro Ala Ser Ser 215
Leu Ser Ser Lys 220
His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp 230 235
Ser
Lys 240
Tyr* Thr Arg ValGly工le His Gin Pro
245
Gin Thr Cys Pro
250
工le
Ala Gly Pro Ser 260
Val
Met lie Ser 27S
Gin Thr
Lys Glu
Val His 305
His Ala Glu
Phe lie Phe 265
Pro Glu Val 280
Val Gin Phe 295
Pro Pro
Thr Cys
Cys Pro Gly 2S5
Lys Pro Lys 270
Val Val 285
Val
Ser
Trp Tyr 300
Val Asp
Thr Ala
Glu Thr 310
Arg Pro
Lays Glu 315
Glu Gin Phe
Cys Glu Val Asp Thr Leu Asp Val Ser Gly Val Glu
Asn Ser Thr 320
Tyr Arg Val Gly Lys
Val Ser 325
Val
Leu Pro工le 330
Gin His Gin Asp Trp Leu lys 335
Glu Phe 340
Lys Cys
工le Thr Arg 355
Thr lie Ser
Lys Val 345
Lys Ala 360
Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro 350
lie Gly
Gin Ser 365
Glu Pro Gin
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu 370 375
Glu Leu 380
Ser Arg Ser Lys Val
Thr lieu 385
Thr Cys Glu Trp Lys
L<eu Val 390
lie Gly
Phe Tyr 395
Pro Pro
Asp
工le His Val 400
Thr Pro
405
Pro Gin Gin 420
Leu Ala Val 435
Ala Val Met
450
Ser Lys Thr 465
Asp Lys
Gly Asp Ala
Gin Pro Glu 410
Val Asp Gly 425
Arg Trp Asp 440
Pro Glu Asn
Thr Tyr Arg Thr 415
His Glu Ala Leu His Asn 455
Gin Gly Lys 470
Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 430
His Gly Asp Lys Phe Glu Cys 445
His Tyr Thr Gin Lys Ser lie
460
<210> 2 <211> 1505 <212> DNA <213> Sus sp.
<400> 2
atggagtttc ggctgaactg ggtggtcttg tttgctctct tacaaggtgt ccagggtgag 60
gagaagctgg tggagtctgg aggaggcctg gtgcagcctg gggggtctct gaaactctcc 120
tgtgtcggct ctggattcac cttcagtagt acctatattc actgggtccg ccaggctcca 180
gggaagggac tggagtggct ggcaggtctc tacagtagta ctacgccgsic ctactactca 240
gactctgtgaagggccggttcgacatctcc
caaatgaacggcctgaaaaccgaaigacacg
caggaaatcgtagctccagtaaaacagasg
tcctcagcccccaagacggccccatcggtc
tctggccctaiacgtggccttgggctgcctg
atgacctggaactcgggcgccctgaccagt
ccgtcsgggctctactccctcagcagcatg
aagagctacacctgcaatgtca^ccacccg
ggaatacaccagccgcaaacatgtcccata
gtcttcatcttCCCtCC3Macccaaggac
acgtgcgtggtggtggacgtcagcaaggag
gacggrggtagaggtgcacacggccgagacg
taccgtgtggtcagcgtcctgcccatccag
aagtgcaaggtcaacaacgtagacctccca
atagggcagagccgggagccgcsggtgtac
aiggagcaaLagtcacgctaacctgcctggtc
gagtggaagagcaacggacagccggagcca
caggacgtggacgggaccttcttcctgtac
gaccaitggagacaaatttgagtgtgcggtg
cagaagtccatctccaagactcagggtaaa
gggtcccgcgagctcgcctgagccccagcg
agagaggacg cccagaacac ggcctatcta 300
gcccgctact actgtggaaa gcgtcacaaa 360
ttgtggggcc caggcgttga agtcgtcgtg 420
taccctctgg ccccctgcgg cagggacacg 480
gcctcaagct acttccccga gccagtgacc 540
ggcgtgcaca ccttcccatc cgtcctgcag 600
gtgaccgtgc cggccagcag cctgtccagc 660
gccaccacca ccaaggtgga caagcgtgtt 720
tgcccaggct gtgaagtggc cgggccctcg 780
accctcatga tctcccagac ccccgaggtc 840
cacgccgagg tccagttctc ctggtacgtg 900
agaccaaagg aggagcagtt caacagcacc 960
caccaggact ggctgaaggg gaaggagttc 1020
gcccccatca cgaggaccat ctccaaggct 1080
accctgcccc cacccgccga ggagctgtcc 1140
attggcttct acccacctga catccatgtt 1200
gagaacacat accgcaccac cccgccccag 1260
agcaaactcg cggtggacaa ggcaagatgg 1320
atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
tgagccaccc gctgcacccc acgtgctctc 144 0
ctgtgtacat acgtcccggg ccagcatgaa 1500
1505
<210> 3 <211> 476 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 3
Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gin Gly 5 10 15
Val Gin Gly Glu Glu Lys Leu Val Glu Se:r Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45Ser Ser 50
Glu Trp 65
Thr Tyr工le
His 55
Leu
Asp Ser Val
Ala Gly 70
Lys Gly 8S
Trp Tyr Arg Phe
Val Arg Gin Ala 60
Leu
Ser Ser Thr* 75
Thr
Asp lie 90
Ser Arg
Thr Ala
Tyr Leu Gin 100
Met Asn Gly Leu Lys Thr 105
Pro Gly Lys Gly Leu
Pro Thr Tyr Tyr Ser 80
Glu Asp Ala Gin Asn 95
Glu Asp Thr Ala Arg 110
Tyr Tyr Cys 115
Gly Lys Val
Pro Asn 120
!Leu
Arg
Gly Asp 125
Leu Gin Val Leu
Ala Gin 130
Val Val 145
Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro 135
Trp Gly 140
Pro Gly Val Glu Val
Ser
Ser Ala Pro 150
L>ys Thr
Ala Pro 155
Ser Val
Pro Cys Gly
Arg Asp 165
Val
Ser Gly Pro 170
Asn Val Ala
Tyr Pro Leu Ala 160
Leu Gly Cys Leu 175
Ala Ser
Ser Tyr 180
Phe Pro
Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly 185 190
Ala Leu Thr 195
Ser Gly Val His Thr Phe Pro 200
Ser Val 205
Leu Gin Pro Ser
Gly Leu 210
Ser Ser 225
Lys Val Cys Pro
Tyr Lys Asp
Ser Leu Ser Ser Met Val 215
Thr Val 220
Pro Ala Ser Ser Leu
Ser
Tyr Thr 230
Lys Arg 245
Val
Cys Gly
Asn
Val Asn 235
His Pro
工le His 250
Gin Pro Gin
Ala Thr Thr Thr 240
Thr Cys Pro lie 255
Gly Cys 260
Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe工le Phe Pro Pro
265
Lys Pro Lys 275
Asp Thr Leu Met lie Ser Gin 280
285
270
Pro Glu Val Thr Cys
Val Val 290
Tyr Val 305
Val Asp Val Ser Lys Glu His 295
Ala Glu 300
Val
Asp
Gly
Val Glu 310
Val His
Thr Ala 315
Glu Thr:
Glu Gin Phe
Asn Ser1 325
His Gin
Asp Trp Leu 340
Val Asp Leu Pro Ala 355
Thr
Lys
Pro
Tyr Gly
Arg Val 330
Lys Glu 345
Val Ser Val
Gin Phe Ser Trp
Arg Pro Lys Glu 320
Leu Pro lie Gin 335
工le Thr Arg 360
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 350
Thr lie Ser Lys Ala lie Gly 365
Gin Ser Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu370 375 380
Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val工le Gly Phe Tyr 385 390 395 400
Pro Pro Asp lie His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gin Pro Glu Pro 405 410 415
Glu Asn Thr Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gin Gin Asp Val Asp Gly Thr 420 425 430
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His 435 440 445
Gly Asp Lys Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460
Tyr Thr Gin Lys Ser lie Ser Lys Thr Gin Gly Lys 465 470 47S
<211> 1523 <212> DNA <213> Sus sp.
<400> 4 atggagtttcggctgaactgggtggtcttgtttgctctcttacaaggtgtccagggtgag60
gagaagctggtggsgtctggaggaggcctggtgcagcctggggggtctctgaaactctcc120
tgtgtcggctctggattcaccttcagtagtacctatattcactgggtccgccaggctcca180
gggaagggactggagtggctggcaggtctctacagtagtactacgccgacctactactca240
gactctgtgaagggccggttcgacatctccagagaggacgcccagaacacggcctatcta300
caaatgaacggcctg汪aasccgaiagscacggcccgctactactgtggsaaggtaccaaac360
ctgcgtggtgacctgcaggtacttgctcagaaagttgctcgtactctgccatggggccca420
ggcgttga^gtcgtcgtgtcctcagcccccaagacggrccccatcggtctaccctctggcc480
ccctgcggcagggacacgtctggccctaacgtggccttgggctgcctggcctcaagctac540
ttccccgagccagtgaccatgacctggaa_ctcgggcgccctgaccagtggcgtgcacacc600
ttcccatccgtcctgcagccgtcagggctctactccctcagcagcatggtgaccgtgccg
gccagcagcctgtccagcaatgcaatgtcaaccacccggcC5LCC3CC3CC720
aaggtggacaagcgtgttggccgcaaacatgtcccatstgcccaggctgt780
gaagtggccgggccctcggtcttcatcttccctcca^33cccaaggacaccctcatgatc840
tcccagacccccgsggtcacgtgcgtggtggtggacgtcagcaaggagcacgccgaggtc900
cagttctcctggt3cgtggscggggtagaggtgcacacggccgagacgagaccaaaggag960
gaigcagttca acagcaccta ccgtgtggtc ctgaagggga aggagttcaa gtgcaaggtc aggaccatct ccaaggctat agggcsgagc cccgccgagg agctgtccag gagcaaagtc ccacctgaca tccatgttga gtggaagagc cgcaccaccc cgccccagca ggacgtggac gtggacaagg caagatggga ccatggagac ctgcacaacc actacaccca gaagtccatc tgcaccccac gtgctctcgg gtcccgcgag gtcccgggcc agcatgaaat aaa
agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg 1020
aacaacg仁ag acctcccagc ccccatcacg 1080
cgggagccgc aggtgtacac cctgccccca 1140
acgctaacct gcctggtcat tggcttctac 1200
aacggacagc cggagccaga gaacacatac 1260
gggaccttct tcctgtacag caaactcgcg 1320
aaatttgagt gtgcggtgat gcacgaggct 1380
tccaagactc agggtaaatg agccacccgc 1440
ctcgcctgag ccccagcgct gtgtacatac 1500
1523
<210> 5 <211> 1089 <212> DNA <213> Sus sp.
<400> 5
gtaccaaacc tgcgtggtga cctgcaggta cgtcacaaac aggaaatcgt agctccagta tcggtctacc ctctggcccc ctgcggcagg tgcctggcct caagctactt ccccgagcca accagtggcg tgcacacctt cccatccgtc aigcaitggtga ccgtgccggc cagcagcctg cacccggcca ccaccaccaa ggtggacaag cccatatgcc caggctgtga agtggccggg aaggacaccc tcatgaitctc ccagaccccc aaggagcacg ccgaggtcca gttctcctgg gagacgagac caaaggagga gcagttcaac atccagcacc aggactggct gaaggggaag ctcccagccc ccatcacgag gaccatctcc gtgtacaccc tgcccccacc cgccgaggag ctggtcattg gcttctaccc atcctgacatc gagccagaga acacataccg caccaccccg ctgtacagca aactcgcggt ggacaaggca
cttgctcaga aagttgctcg tactctgcca 60
aaacagaagt tggcccccaa gacggcccca 120
gacgtgtctg gccctaacgt ggccttgggc 180
gtgaccgtga cctggaactc gggcgccctg 240
ctgcagccgt cagggctcta ctccctcagc 3 00
tccagcaaga gctacacctg caatgtcaac 360
cgtgttggaa tacaccagcc gcaaacatgt 420
ccctcggtct tcatcttccc tccaaaaccc 48 0
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtcagc 54 0
tacgtggacg gggtagaggt gcacacggcc 600
agcacctacc gtgtggtcag cgtcctgccc 660
gagttcaagt gcaaggtcaa caacgtagac 720
aaggctat3g ggcaigagccg ggagccgcag 780
ctgtccagga gcaaagtcac gctaacctgc 840
catgttgagt ggaagagcaa cggacagccg 900
ccccagcagg acgtggacgg gaccttcttc 960
agatgggacc atggagacaa atttgagtgt 1020
gcggtgatgc acgaggctct gcacaaccac tacacccaga agtccatctc caagactcag 1080 ggtaaa仁ga 1089
<210> 6 <211> 3S2 <212> PRT <213> Sus sp.
<400> 6
Val Pro Asn Leu Arg Gly 5
Arg Thr Leu Pro Arg His 20
Asp Leu Gin 10
Val
Leu Ala Gin Lys Val Ala 15
Lys Gin 25
Glu工le
Lys Leu Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val 35 40
Gly Arg 50
Ser Tyr 65
Asp Val Ser Gly Pro Asn Val Ala 55 60
Phe
Thr Ser Gly Tyr Ser
Pro Glu 70
Val His 85
Pro Val Thr
Val Thr 75
Val Ala 30
Tyr Pro 45
Leu Gly Trp Asn
Thr Phe
Pro Ser 90
Val Leu Gin
Pro Val Lys Gin Leu Ala Pro Cys Cys Leu Ala Ser
Ser Gly Ala Leu 80
Pro Ser Gly lieu 95
Leu Ser Ser 100
Met Val Thr Val Pro 105
Ala Ser Ser Leu Ser Ser 110
lays Ser* Tyr 115
Asp Lys 130
Gly Cys 145
Lys Asp Val Asp
Arg
Thr
Thr Cys Val Gly
Asn
Val Asn 120
His Pro
Ala Thr 125
lie
135
His Gin Pro
Gin Thr 140
Cys
Val Ala Gly 150
Pro Ser
Val Phe 155
lie Phe
Leu Met 165
lie
Ser Gin Thr 170
Pro Glu Val
Val Ser 180
Lys Glu
Asp Gly Val 195
Phe Asn Ser 210
Asp Trp Leu 225
Leu Pro Ala
Glu Val His
His Ala 185
Thr Ala 200
Glu Val Gin
Phe 190
Glu Thr
Arg Pro
205
Thr Tyr Arg Val Val Ser 215
Val Leu Pro 220
Lys Gly L ys Glu Phe 230
Lys Cys Lys Val 235
Pro工le Thr Arg Thr lie Ser Lys Ala 245 250
Thr Thr Lys Val
Pro lie Cys Pro
Pro Pro Lys Pro 160
Thr Cys Val Val 175
Ser Trp Tyr Val Lys Glu Glu Gin 工le Gin His Gin
Asn Asn Val Asp 240
lie Gly Gin Ser 255Arg Glu Pro Gin 260
Val
Tyr Thr Leu 265
Pro
Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser 270
Arg Ser Lys 275
Val Thr
Asp工le 290
Thr Tyi 305
His Val Glu
Leu Tyr Ser Lys Phe
Leu Thr 280
Trp Lys 295
Arg Thr
Glu
Lys Leu Ala Val 325
Cys Ala Val Met
Cys Leu
Ser Asn
Val工le Gly 285
Gly Gin Pro 300
Thr Pro Pro 310
Gin Gin Asp Val Asp 315
Asp Lys Ala Arg Trp 330
His Glu Ala Leu His
Phe Tyr Pro Pro
Glu Pro Glu Asn
Gly Thr Phe Phe 320
Asp His Gly Asp 335
Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gin Lys Ser工le Ser Lys Thr Gin Gly Lys 355 360
<400> 7
<210: <211: <212: <213-
217 PRT
Sus sp.
Asp Ser Gin Thr Val lie Gin Lys Pro 5 10
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala 20 25
工le Asn Tyr Pro Ser Trp Phe Gin 35 40
Thr Val lie Tyr Asn Thr Asn Asn 50 55
Ala工le Ser Phe Ser Leu Gly 15
Phe Ser Ser Gly Ser Leu Thr Gly 30
Arg Thr Pro Gly Gin Pro Pro Gin 45
Arg Pro Thr Gly Val Pro工le Arg
60
Phe Ser Gly Ala工le Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr 工le Thr Gly 65 70 75 80
Ala Gin Ala Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Leu Tyr Lys Ser 85 90 95
Ser Ala Gin工le Thr Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Thr Val Asn Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125
Glu Leu Gly Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu工le Ser Asp Phe 130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Thr Trp Lys Ala Gly Gly Thr Thr Val 145 150 155 160
Thr Gin Gly Val Glu Thr 165
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyx 180
Ser Ser Gly Phe Thr Cys 195
Lys Thr Val Thr Pro Ser
210 215
Thr Lys Pro 170
Leu Ala Leu 185
Gin Val Thr 200
Glu Cys Ala
Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 175
Ser Ala Ser Asp Trp Lys Ser 190
His Glu Gly Thr工le Val Glu 205
<210> 8 <211> 21S <212> PRT <213> Sus sp.
<400> 8
Asp Ser Gin Thr Val lie 5
Gly Thr Val Thr Leu Thr 20
Gin Glu Pro Ala Met 10
Ser Val Ser Pro Gly 15
Cys Ala 25
Phe Thr Ser
Ser Asn His 35
Leu Val 50
Phe Ser 65
lie
Gly
Ala Gin Ala
Pro Gly Trp
Tyr Arg Thr 55
Ala lie Ser
70
Asn Asp Glu 85
Tyr 40
Gin
Asn Asn
Gly Asn
Gin Thr Pro 45
Arg Pro Thr 60
Lys Ala Ala
75
Ala
Asp Tyr 90
Asn Thr
Tyx Phe 100
Phe Gly Gly Gly Thr 105
Phe Cys Arg Leu
Gly 30
Gly Gly Leu Thr
Ser Val Thr Thr Gin Pro Pro Arg Val Pro Ser Arg
Ser lie Thr Gly 80
Lieu 95
Thr Val 110
Trp Lys Asp Leu Gly Gin
Pro Lys Ala 115
Ala Pro Met
Val Asn 120
Leu
Phe Pro Pro 125
Ser Ser Glu Glu
Leu Gly 130
Pro Gly 145
Thr Asn
Ala Val
Lys Ala 135
Thr Leu Val
Cys Leu 140
Thr Val Thr Trp 150
Lys Ala 155
工le Ser Asp Phe Tyr Gly Gly Thr
Gin Gly Val
Glu Thr 165
Ala Ala
Ser Ser Tyr 180
Ser Gly Phe Thr Cys 195
Thr Lys Pro Ser Lys 170
Leu Ala Leu Ser Ala 185
Gin Val Thr His Glu 200
Gin Ser
Ser
Asp 190
Asn 175
Trp
Gly Thr工le 205
Thr Val Thr 160
Asn Lys Tyr Lys Ser Ser Val Glu Lys
Thr Val Thr Pro Ser Glu Cys Ala
210 215
<210> 9 <211> 216 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 9
Asp Ser Gin Thr Val工le 5
Gly Thr Val Thr Val Thr 20
Gin Glu Pro 10
Ala Met
Ser Val 15
Ser Pro Gly
Cys Ala 25
Phe Ser Ser
Gly 30
Ser Val Thr Ser
Ser Asp Tyr 35
Pro Ser Trp Phe Gin Gin 40
Thr Pro 45
Gin
Thr Val 50
Ser Gly 65
工le
Ala
Gin Ala Glu
Tyr Arg Thr 55
Met Ser Gly 70
Asp Glu Ala 85
Arg Tyr
Gin Val 100
Phe Gly
Asn Asn Asp Gly
Lys Lys
Pro
Pro Asp 60
Ala Ser
75
Gly Trp Leu Thr工le
Val
Pro Pro Arg Pro Gly Leu
Thr Gly Ala 80
Tyr Phe 90
Cys Ala Leu
Glu Glu Lys Ser 95
Gly 105
Thar His Leu
Thr Val Leu Gly Gin 110
Pro Lys Ala 115
Ala Pro Thr
Val Asn 120
Phe Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 125
Leu Gly 130
Pro Gly 145
Thr Asn
Ala Val
Lys Ala 135
Thr Val 150
Thr Leu Val
Cys Leu 140
Thr Trp
Lys Ala 155
Gin Gly Val
Glu Thr Thr 165
Ala Ala
Ser Arg Tyr Leu 180
Ser Gly Phe Thr Cys Gin 195
Thr Val Thr Pro Ser Glu 210 215
Lys Pro Ser Lys 170
Ala Leu Ser Ala 185
Val Thr His Glu 200
Gly
Gin
Ser
工le Ser Asp Phe Tyr
Gly Thr Thr Val Thr 160
Ser Asn Asn Arg Tyr 175
Asp Trp Lys Phe Ser 190
Gly Thr工le Val Glu Lys 205
Cys Ala
:210> 10 :211> 216 :212> PRT :213> Sus sp. :400> 10Asp Ser Gin Thr Val lie
Gly Thr Val Ala Leu 20
Thr
Gin Glu Pro Ala Met Ser Val Ser Pro Gly
10 15
Cys Ala Phe Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr
25 30
Ser Asn Tyr Pro Ser Trp Phe Gin Thr 3S 40
Leu 工le 50
Ser Gly 65
Trp Arg Thr Asn Asn Arg Pro 55
Pro Gly 45
Thr Gly 60
Ala
Gin Ala Asn
工le Ser 70
Asp Glu 85
Ala Asn
Val lie Phe 100
Gly Asn Lys Asp Gly
Ala Ala Leu 75
Gin
Val
Thr
Pro Pro Arg Gin Pro Gly Arg Phe
工le Thr Gly Ala 80
Ala
Gly
Tyr Phe 90
Cys Thr Leu
Cys 95
Gly 105
Thr H丄s Leu
Thr Val 110
Ijys Sear Thr Leu Gly Gin
Pro Lys Ala 115
Ala Pro Thr Val Asn Leu 120
Phe Pro Pro 125
Ser Ser Glu Glu
Leu Gly 130
Pro Gly 145
Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val 135
Cys Leu 140
Ala
Gin Gly Val
Val Thr Val 150
Glu Thr Thr 165
Thr Trp Lys
Lys Ala 155
工le Ser Asp Phe Tyr Gly Gly Thr
Ala Ala
Ser Arg Tyr Leu 180
Ala
Pro Ser Lys 170
Leu Ser Ala 185
Gin Ser
Asn 175
Ser Gly Phe Thr Cys Gin 195
Thr Val Thr Pro Ser Glu 210 215
Val Thr His Glu 200
Cys Ala
Ser Asp Trp 190
Gly Thr工le 205
Thr Val Thr 160
Asn Arg Tyr Lys Phe Ser Val Glu Lys
<210〉 11 <211> 80S <212> DNA <213> Sus sp.
<400> 11
gtgccaaggt tgcatgcctg caggtcgact ctaaagaggc cccttcccaa aattgtcccc ctcctccctg tcggctcagg ggtggattct ttttctcttg gagggaccgt cacactcacc attaactacc ctagctggtt ccagcggaca
agtacggggg gggggggggg gggcaggagg 60
accatggcct gaacggtgct tctgatcgrgg 12 0
caaactgtga tccaaaaacc ggcaatctct 180
tgtgccttta gctctgggtc actcactggt 240
ccaggccagc ctcctcaaac tgttatctac 300accgcccgactggggtccccattcgcttctctggagccatctctgggaac360
aaagccgccctcaccatcacgggggcccaggctaaggacgaggccgactacttctgtgct420
ctgtataaaagtagcgctcagattacgttcggcggtgggacccatctgaccgtcctcggt480
cagcccaaggccgctccc3Cggtcaacctcttcccgccctcctctgaggagctcggcacc540
aacaaggccaccctggtgtgtctaataagtgacttctacccgggcgccgtgacggtgacc600
tggaaggcsggcggcaccaccgtcacccagggcgtggagaccsccaeigccctcgaaacag"0
agtscgcggcC3gcagct3cctggccctg仁ccgccagtgactgga33tct720
tccagcggc仁tcacctgccaggtcacccacgaggggaccattgtggagaagacagtgacg780
ccctccgagtgcgcctaggg3tCCC805
<210> 12 <211> 751 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 12
gggggggggctgaggaggccgcgtcccaagattgtccccaccatggcctgaacggtgctt60
ctg3tcgggctcctcgctgtcggctcaggggtggattctcaa^ctgtgatccaggagccg120
gcgatgtcagtgtctcctggagggaccgtcacactcacctgtgcctttac3tctgggtca180
gtcactactagtaaccaccccggctggtacceigcagscaiccaggccagcctccccgsctg240
gtgatttacaggacaa^caaccgcccgactggggtccccagtcgcttctctggsgccaitc300
tctgggaacaaagccgccctcagcatcacgctaatgacgaggccgactat360
ttctgtactctgtggaaagataacacsit3ttttttcggcggtgggacccg仁ctgaccgtc420
ctcggtcagcccaaggccgctcccatggtcaatctcttcccgccctcctctgaggagctc480
ggcaccaacaaggccaccctggtgtgtctaataagtgacttctacccgggcgccgtgacg540
gtgacctggaaggcaggcggcaccaccgtcacccagggcgtggagaccaccaagccctcg600
acaacaagtacgcggccagceigctacctggccctgtccgccagtgactgg660
aa^tcttcca^gcggcttcacctgccaggtc3cccacgaiggggscc3ttgtggagaagaca720
gtgacgccctccgagtgcgcctsgggstccc751
<210> 13 <211> 657 <212> DNA <213> US sp. <400> 13
gtggattctc agactgtgat ccaggagccg gcgatgtcag tgtctcctgg agggaccgtc 60acag仁cacct gtgcctttag ctctgggtca gtcactagta gtgactaccc aagctggttc 120
cagcagacac caggccagcc tcctcgaact gtcatctaca gaacaaacaa gccgcccgac 180
tgggtcccag gtctctctgg agccatgtct gggaacaaag cgtccctcac catcacgggg 240
gcccaggctg aggacgaggc tgactacttc tgtgctctgg aggaaaagtc acggtatcag 3 00
gttttcggcg gtgggaccca tttgaccgtc ctcggtcagc ccaaggccgc tcccacggtc 360
aacttcttcc cgccctcctc tgaggagctc ggcaccaaca aggccaccct ggtgtgtcta 42 0
ataagtgact tctacccggg cgccgtgacg gtgacctgga aggcaggcgg caccsiccgtc 480
acccagggcg tggagaccac caagccctcg aaacagagca aicaacaggta cgcggccagc 540
aggtacctgg ccctgtccgc cagtgactgg aaattctcca gcggcttcac ctgccaggtc 600
acccacgagg ggaccattgt ggagaagaca gtgacgccct ccgagtgcgc ctaggga 657
<210> 14 <211> 687 <212> DNA <213> Sus sp.
<400> 14
cctggactcc tctctcctgt tcgggtggat tcagtgtctc ctggagggac cgtcgcactc accagtaact accccagctg gttccagaag tggagaacaa acaaccgccc gactggggtc aacaaagccg ccctcaccat cacgggggcc actc亡gtgta aaagtactgc taatgtaatt ggtcagccca aggccgctcc cacggtcaac accaacaagg ccaccctggt gtgtctaata acctggaaag caggcggcac caccgtcacc cagagcaaca acaggtacgc ggccagcagg ttctccagcg gcttcacctg ccaggtcacc acgccctccg agtgcgccta gggacac
tctcagactg tgatccagga gccggcgatg 60
acctgtgcct ttagctctgg gtcagtcact 120
acaccaggcc agcctccccg acagctgatc 180
cccggtcgct tctctggagc catctctggg 240
caggctaatg acgaggccga ctacttttgt: 3 00
ttcggcggtg ggacccatct gaccgtcctc 360
ctcttcccgc cctcctctga ggagctcggc 420
agtgacttct acccgggcgc cgtgacggtg 480
cagggcgtgg agacaaccaa gccctcgaaa 540
tacctggccc tgtccgccag tgactggaaa 600
cacgagggga ccattgtgga gaagacagtg 660
687
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213〉 Sus sp.
<400> 15
gacgctcgag tcatcattta ccctgagt 28
<210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 16
agctaagctt gcccccaaga cggcccca 28
<210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 17
atgccatatg gtaccaaac 19
<210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 18
atgcaagctt caacttctg 19
<210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 19
Arg His Lys Gin Glu工le Val Ala Pro Val Lys Gin Lys Leu 5 10
<210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Sus sp.
<400> 20
cgtcacaaac aggaaatcgt agctccagta aaacagaagt tg 42
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Sus sp.
<400> 21gtaccaaacc tgcgtggtga cctgcaggta cttgctcaga aagttgctcg tactctgcca 60
<210> 22
<211> 102
<212> DNA
<213> Sus sp.
<400> 22
gtaccaaacc tgcgtggtga cctgcaggta cttgctcaga aagttgctcg tactctgcca 60 cgtcatcaaac aggaaatcgt agctccagta aaacagaagt tg 10权利要求
1.猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗FMD的免疫系统应答，所述疫苗具有FMDV表位之cDNA构建体或其蛋白质对应物。
2. 权利要求l所述的疫苗，其中所述疫苗包括蛋白质并具有将得 自FMDV的肽表位移植到IgG抗体CDR环的构建体。
3. 权利要求2所述的疫苗，其中所述疫苗是抗原化抗体疫苗，所 述抗原化抗体疫苗利用猪IgG蛋白作为FMDV表位的载体。
4. 权利要求3所述的疫苗，其中所述疫苗利用IgG蛋白作为 FMDV表位的载体，所述FMDV表位被插入到IgG重链和轻链的CDR2 和CDR3区域内。
5. 权利要求3所述的疫苗，其中所述疫苗利用与IgG重链恒定区 相连接的串联重复的FMDV表位。
6. 权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗是裸露的DNA疫苗， 所述裸露的DNA疫苗利用IgG cDNA基因作为FMDV表位的载体。
7. 权利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗将FMDV表位DNA序 列移植到猪IgG重链和轻链cDNA的CDR2和CDR3区域内。
8. 权利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗利用与IgG重链恒定区 cDNA相连接的FMDV表位DNA序列。
9. 权利要求4所述的疫苗，其中IgG的轻链包括容纳FMDV表位 的CDR2和CDR3区域。
10.权利要求9所述的疫苗，其中FMDV表位携有FMDV或其毒 株衍生物的免疫原性。
11.权利要求4所述的疫苗，其中所述IgG轻链可具有下列4种 氨基酸序列中的一种PIGL1序列<sequence>see original document page 3</sequence>PIGL2序列<sequence>see original document page 3</sequence>PIGL4序列<sequence>see original document page 3</sequence>
12.权利要求7所述的疫苗，其中IgG轻链可具有下列之一的基因密码<formula>see original document page 4</formula>721 GTGACGCCCT CCGAGTGCGC CTAGGGATCC CD. PIGL3序列 座位 'PPL2 657 bp碱基数 139 A 211 C188 G119 T来源1GTGGATTCTCAGACTGTGATCCAGGAGCCGGCGATGTCAG TGTC"TCCTGG AGGGACCGTC61ACAGTCACCTGTGCCTTTAGCTCTGGGTCA GTCACTAGTA GTGACTACCC AAGCTGGTTC121CAGCAGACACCAGGCCAGCCTCCTCGAACTGTCATCTACA GAACAAACAA GCCGCCCGAC181TGGGTCCCAGGTCTCTCTGGAGCCATGTCTGGGAACAAAG CGTCCCTCAC CATCACGGGG241GCCCAGGCTGAGGACGAGGCTGACTACTTCTGTGCTCTGG AGGAAAAGTC ACGGTATCAG301GTTTTCGGCG GTGGGACCCA TTTGACCGTCCTCGGTCAGC CCAAGGCCGC TCCCACGGTC361AACTTCTTCC CGCCCTCCTCTGAGGAGCTCGGCACCAACA AGGCCACCCT GGTGTGTCTA421ATAAGTGACTTCTACCCGGG CGCCGTGACGGTGACCTGGA AGGCAGGCGG CACCACCGTC481ACCCAGGGCG TGGAGACCACCAAGCCCTCG AAACAGAGCA ACAACAGGTA CGCGGCCAGC541AGGTACCTGGCCCTGTCCGCCAGTGACTGGAAATTCTCCA GCGGCTTCAC CTGCCAGGTC601ACCCACGAGGGGACCATTGTGGAGAAGACA GTGACGCCCT CCGAiSTGCGC CTAGGGAD. PK L4序列座位 PPL4 687 bp DNA碱基数 144 A 230 C 186 G127 T来源1CCTGGACTCCTCTCTCCTGTTCGGGTGGATTCTCAdACTG TGATCCAGGA GCCGGCGATG 61TCAGTGTCTC CTGGAGGGACCGTCGCACTCACCTGTGCCT TTAGCTCTGG GTCAGTCACT121ACCAGTAACT ACCC;CAGCTGGTTCCAGAAGACACCAGGCC AGCCTCCCCG ACAGCTGATC181TGGAGAACAA ACAACCGCCCGACTGGGGTCCCCGGTCGCT TCTCTGGAGC CATCTCTGGG241AACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCTAATG ACGAGGCCGA CTACTTTTGT301ACTCTGTGTA AAAGTACTGCTAATGTAATTTTCGGCGGTG GGACCCATCT GACCGTCCTC361GGTCAGCCCA AGGCCGCTCCCACGGTCAACCTCTTCCCGC . CCTCCTCTGA GGAGCTCGGC421ACCAACAAGGCCACCCTGGTGTGTCTAATA AGTGACTTCT ACCCGGGCGC CGTGACGGTG481ACCTGGAAAGCAGGCGGCACCACCGTCACC CAGGGCGTGG AGACAACCAA GCCCTCGAAA541CAGAGCAACA ACAGGTACGCGGCCAGCAGG TACCTGGCCC TGTCCGCCAG TGACTGGAAA601TTCTCCAGCGGCTTCACCTGCCAGGTCACC CACGAGGGGA CCATTGTGGA GAAGACAGTG661 ACGCCCTCCG AGTGCGCCTA GGGACAC
13. 权利要求3所述的疫苗，其中FMDV表位具有下列氨基酸序列RHKQEIVAPVKQKL 。
14. 权利要求6所述的疫苗，其中FMDV表位具有下列cDNA序列CGTCACAAACAGGAAATCGTAGCTCCAGTAAAACAGAAGTTG
15. 权利要求5所述的疫苗，其中所述IgG重链具有下列cDNA 序列，其中黑体序列是FMDV序列1ATGGAGTTTC GGCTGAACTG TACAAGGTGT CCAGGGTGAG61 GAGAAGCTGG TGGAGTCTGG GGGGGTCTCT GAAACTCTCC121TGTGTCGGCT CTGGATTCAC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA181 GGGAAGGGAC TGGAGTGGCT CTACGCCGAC CTACTACTCA241 GACTCTGTGA AGGGCCGGTT CCCAGAACAC GGCCTATCTA301 CAAATGAACG GCCTGAAAAC ACTGTGGAAA GCGTCACAAA361 CAGGAAATCG TAGCTCCAGT CAGGCGTTGA AGTCGTCGTG421 TCCTCAGCCC CCAAGACGGC CCCCCTGCGG CAGGGACACG481 TCTGGCCCTA ACGTGGCCTT ACTTCCCCGA GCCAGTGACC541 ATGACCTGGA ACTCGGGCGC CCTTCCCATC CGTCCTGCAG601 CCGTCAGGGC TCTACTCCCT CGGCCAGCAG CCTGTCCAGC661 AAGAGCTACA CCTGCAATGT CCAAGGTGGA CAAGCGTGTT721 GGAATACACC AGCCGCAAAC ATGTCCCATA TGCCCAGGCT GTGAAGTGGC CGGGCCCTCG.781 GTCTTCATCT TCCCTCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCAGAC CCCCGAGGTC841 ACGTGCGTGG TGGTGGACGT CAGCAAGGAG CACGCCGAGG TCCAGTTCTC CTGGTACGTG901 GACGGGGTAG AGGTGCACAC GGCCGAGACG AGACCAAAGG AGGAGCAGTT CAACAGCACC961 TACCGTGTGG TCAGCGTCCT GCCCATCCAG CACCAGGACT GGCTGAAGGG GAAGGAGTTC1021 AAGTGCAAGG TCAACAACGT AGACCTCCCA GCCCCCATCA CGAGGACCAT CTCCAAGGCT1081 ATAGGGCAGA GCCGGGAGCC GCAGGTGTAC ACCCTGCCCC CACCCGCCGA GGAGCTGTCC1141 AGGAGCAAAG TCACGCTAAC CTGCCTGGTC ATTGGCTTCT ACCCACCTGA CATCCATGTT1201 GAGTGGAAGA GCAACGGACA GCCGGAGCCA GAGAACACAT ACCGCACCAC CCCGCCCCAG1261 CAGGACGTGG ACGGGACCTT CTTCCTGTAC AGCAAACTCG CGGTGGACAA GGCAAGATGG1321 GACCATGGAG ACAAATTTGA GTGTGCGGTG ATGCACGAGG CTCTGCACAA CCACTACACC1381 CAGAAGTCCA TCTCCAAGAC TCAGGGTAAA TGAGCCACCC GCTGCACCCC ACGTGCTCTC1441 GGGTCCCGCG AGCTCGCCTG AGCCCCAGCG CTGTGTACAT ACGTCCCGGG CCAGCATGAA1501ATAAA 。
16.权利要求5所述的疫苗，其中所述重链具有下列氨基酸序列， 其中黑体序列是FMDV表位区域MEFRLNWWL FALLQGVQGE EKLVESGGGL VQPGGSLKLS CVGSGFTFSS TYIHWVRQAP GKGLEWLAGL YSSTTPTYYS DSVKGRFDIS REDAQNTAYL QMNGUCTEDTARYYCGKRHKQEIVAPVKQK LWGPGVEVVV SSAPKTAPSVYP LAPCGRDVSG PNVALGCLAS SYFPEPVTVT WNSGALTSGV HTFPSVLQPSGLYSLSSMVT VPASSLSSKS YTCNVNHPAT TTKVDKRVGI HQPQTCPICP GCEVAGPSVF IFPPKPKDTL MISQTPEVTC WVDVSKEHA EVQFSWYVDG VEVHTAETRP KEEQFNSTYRWSVLPIQHQ DWLKGKEFKC KVNNVDLPAP ITRTISKAIG QSREPQVYTL PPPAEELSRSKVTLTCLVIG FYPPDIHVEW KSNGQPEPENSISKTQGK
17.权利要求1、 2或6所述的疫苗，其中所述疫苗是使用移植 制备的。
18.猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗FMD的免疫系统应答， 所述疫苗具有FMDV表位之cDNA构建体或其蛋白质对应物，所述蛋 白质形式的疫苗是通过将FMDV表位移植到猪IgG的CDR2和CDR3 区域中制备的。
19. 权利要求l、 17或18所述的疫苗，其中所述疫苗是DNA形 式的疫苗，该疫苗是通过将FMDV肽表位的cDNA插入到猪IgG基因 的CDR区域内以构建DNA质粒，然后克隆质粒以表达而产生的。
20. 猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗FMD的免疫系统应答， 所述疫苗具有FMDV表位之cDNA构建体或其蛋白质对应物，所述疫 苗为蛋白质形式的疫苗，可通过注射到猪肌肉组织中给药。
21. 权利要求18、 19或20所述的疫苗，其中所述疫苗是DNA形 式的疫苗，可通过注射到猪表皮中给药。
22. 制备猪口蹄疫疫苗的方法，所述方法包括将得自FMDV的表 位移植到猪抗体CDR环的步骤，其中所述FMDV肽表位是通过PCR 由FMDV的VP1基因克隆得到的。
23. 权利要求22所述的制备疫苗的方法，其中所述PCR法是重叠 PCR法，使用该方法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链 基因的CDR区域内，其中重链和轻链基因是克隆至哺乳动物或昆虫细 胞表达载体以供表达的抗原化抗体基因。
全文摘要
提供了治疗猪口蹄疫的疫苗，此疫苗是将得自FMDV的肽表位移植到猪抗体CDR环而产生的抗原化抗体疫苗。可通过PCR由FMDV的VP1基因克隆FMDV肽表位。使用重叠的PCR法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内，将所得的抗原化抗体基因克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至CHO或骨髓瘤细胞，选择稳定的转染子细胞系以大量产生所需的蛋白质疫苗。
文档编号A61K39/00GK101342368SQ200810090580
公开日2009年1月14日 申请日期1999年9月30日 优先权日1999年4月15日
发明者雍 谢 申请人:香港科技大学