专利名称：叶酸-IgG偶联物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及叶酸-IgG偶联物及其制备方法以及它的应用。
背景技术：
叶酸是1941年由米切尔(H. K. Mitchell)从菠菜中提取纯化的，由喋啶，对氨基 苯甲酸和谷氨酸残基组成的一种水溶性B族维生素，是人体必需的一种物质，具有促进骨 髓中幼细胞成熟的作用，如果缺少叶酸可导致红血球的异常未成熟细胞的增加及白血球减 少。最新的研究表明叶酸可能会引发癌细胞的凋亡，对癌细胞的基因表达有一定影响，具有 一定的抗癌作用。其最重要的原因在于叶酸在体内能与叶酸受体结合，叶酸受体(FR)分为 α和β亚型，研究表明在90%的卵巢癌、晚期乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结肠癌、肺癌、 脉络膜癌、室管膜细胞瘤中出现高表达的FR-α ；在恶性增殖的白细胞(白血病)表面及类 风湿关节炎等自身免疫性疾病患者体内激活的巨噬细胞表面有高表达的FR-β，而叶酸受 体在正常组织中几乎不表达。因此叶酸和叶酸受体在靶向治疗技术中具有很好的研究前
旦
ο一、癌症治疗的现有技术国际卫生组织(WHO)指出在2010年癌症将超过心脏病成为世界第一大杀手，与 1990年相比，全球癌症患者的发病率增长了 19%，死亡率增长了 18%，预计2020年全世界 癌症发病率将增加50%，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。目前全世界发病 率最高的癌症是肺癌，每年新增患者人数为120万；其次是乳腺癌，每年新增大约100万患 者；随后依次是肠癌(94万人)、胃癌(87万人)、肝癌(56万人)、子宫颈癌(47万人)、食 道癌(41万人)等。此外，美国、意大利、澳大利亚、德国、荷兰、加拿大和法国等发达国家癌 症发病率较高，北非、南亚及东亚一些发展中国家的发病率则较低，而发病率也呈逐年上升 的趋势，严重威胁到了人类的正常生活。现在治疗癌症的代表性方法有(1)外科疗法是在癌症尚未转移前将病灶切除的方法，外科疗法是现今治疗恶 性肿瘤最重要的手段，对早、中期恶性肿瘤应列为首选方法，而对扩散性癌症却很难治疗。(2)放射线疗法利用射线对癌细胞诱发产生DNA损伤及染色体畸变或断裂，引起 细胞或其子代失去活力达到抑制肿瘤生长的目的。但射线对正常组织细胞也有损害作用， 尤其光辐射量增大时容易损伤造血器官和血管组织，引起白细胞和血小板减少、皮肤粘膜 改变，胃肠道反应等；而且放射性疗法对复发性癌症和对射线不敏感的癌症治疗效果不佳。(3)化学疗法主要适用于中、晚期癌症的综合治疗。按其作用机理分为五类① 影响核酸合成，如氟尿嘧啶、甲氨喋呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤、羟基脲等；②影响蛋白合成，如 长春新碱、门冬酰胺酶等；③直接破坏DNA，如氮芥、噻替哌、环磷酰胺、白消安、丝裂霉素、 博菜霉素、丙正胺等；④嵌入DNA中干扰模板作用，如阿霉素、柔红霉素、光辉霉素、丙脒腙 等；⑤影响体内激素平衡，如性激素、肾上腺皮质激素等。此种疗法的副作用包括骨髓抑制、 胃肠道反应、脱发和化学性静脉炎等。
(4)免疫疗法通过机体内部防御系统，经调节功能达到遏制肿瘤生长的目的。这 类药物通常价格昂贵且伴有过敏反应、胃肠道反应、水肿等副作用。以上治疗方法常常联合应用对抗癌症，其中化疗药物不可避免的副作用使得新的 化疗药物的开发显得尤为必要。近来，基于单克隆抗体的靶标治疗药物受到肿瘤患者的青 睐，如Here印tin 、Avastin 和Rituxan ，与常规化疗药物相比，其最大的优势在于低毒， 据统计，其市场已达到4百万美元/年。但此类药物开发至临床投入巨大且市场价格昂贵， 另外，可用于治疗癌症范围相对窄。二、自身免疫性疾病治疗的现有技术自身免疫性疾病(Autoimmune disease)是指对正常机体组成成分的抗体或有免 疫功能的细胞，致使机体发生器质性或功能性的障碍而引起的疾病。同时，从临床来看，自 身免疫性疾病可能出现以下特征(1)血浆Y-球蛋白在1. 5%以上。(2)检出病变脏器的自身抗体。(3)见到变性的Y-球蛋白或其相应的抗原等沉积在肾小球等部位。(4)在病变组织见有大量淋巴细胞和浆细胞浸润。(5)应用肾上腺皮质激索能够得到一度或持续的良好效果。(6)见到一种以上的自身免疫性损害和症状。(7)检出能在常温下对病变脏器发生反应的自身抗体。(8)检出的抗体能特异性的作用于相应的自身抗原。(9)用同样的抗原在实验动物中能产生相应的抗体。(10)实验动物的病变与临床病例相类似。(11)通过含抗体的血清，或用免疫学的方法所激活的淋巴活性细胞，可引起类似 的疾病。以上标准，提示了自身抗体对病变部位的侵袭，仅仅是临床标准，没有涉及其病因 的作用。自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病等(1)炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)主要包括溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC)和克隆氏病(Crohn，s disease，CD)两种。第十届欧洲胃肠病 学年会上，欧洲克隆氏病与炎性肠病联合会主席RodMitchell指出，目前在欧洲有100万 IBD患者，在西方国家大部分地区溃疡性结肠炎发病率稳定，最高到10例/10万人口。而克 隆氏病的发病率在过去30年升高了 600%，我国发病率也呈明显的上升趋势，此病症可导 致患者发生结直肠癌的风险显著升高，严重威胁人类的健康。尽管研究多年，人类目前仍然 无法完全治愈该病。(2)类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以慢性进行性关节滑膜 病变为特征的全身性自身免疫性疾病。主要表现为进行性侵蚀性关节炎及晨僵，部分患者 可以出现发热、贫血、皮下结节和淋巴结肿大，如不给予及时治疗，最终会导致受累关节强 直、畸形和功能丧失，严重影响生活质量。类风湿性关节炎在全世界成人中的发病率约占 1 % 2 %，并随着年龄的增长而增高，35岁以下成人的发病率约0. 3 %，而65岁以上者发病 率超过10%。我国按照美国风湿病学诊断标准对人群普查，调查结果显示，成人患病率为0. 32% 0. 4%，按此数字估计，我国有类风湿性关节炎患者约400万左右。(3)红斑狼疮(lupus erythematosus, LE)是一种自身免疫性疾病，发病缓慢，隐 袭发生，临床表现多样、变化多端，分为盘状红斑狼疮(DLE)，系统性红斑狼疮(SLE)、亚急 性皮肤型红斑狼疮、深部红斑狼疮等类型。此病能累及身体多系统、多器官，在患者血液和 器官中能找到多种自身抗体。(4)银屑病是一种有特征鳞屑性红斑的复发性、慢性皮肤病，可能与遗传、感染、代 谢障碍、内分泌影响、神经精神因素和免疫异常等有关。临床表现以皮肤上出现丘疹及斑 块，上覆以银白色鳞屑为主。因其皮损厚硬，状如牛皮，所以又有“牛皮癣”的俗称；因其鳞 屑层层脱落，就象粗的松树皮，故中医学称之为“松皮癣”。银屑病在临床上有四种类型寻 常型、脓疱型、关节病型和红皮病型，本病在自然人群中的发病率为0. 1% -3%，根据全国 银屑病流行病学调查显示，我国银屑病平均患病率为0. 167%。其病因和发病机理至今仍不 完全清楚，其治疗目前大多只能达到近期效果，具有一定的不良反应。治疗自身免疫性疾病的常用药物包括(1)非留体类抗炎药(NSAIDS):如水杨酸制剂、吲哚美辛、丙酸衍生物、灭酸类药 物等，用于初发或轻症病例，其作用机理主要抑制环氧化酶使前腺素生成受抑制而起作用， 以达到消炎止痛的效果，但不能阻止类风湿性关节炎病变的自然过程。本类药物因体内代 谢途径不同，彼此间可发生相互作用不主张联合应用。(2)金制剂常用硫代苹果酸金钠，金制剂用药愈早，效果愈著。金制剂的作用慢， 3 6个月始见效，不宜与免疫抑制剂或细胞毒药物并用。口服金制剂效果与金注射剂相 似。副作用有大便次数增多，皮疹，口腔炎等，但停药后有复发可能。(3)青霉胺能选择性抑制某些免疫细胞使IgG及IgM减少。副作用有血小板减 少，白细胞减少，蛋白尿，过敏性皮疹，食欲不振，视神经炎，肌无力，转氨酶增高等。(4)氯 喹可作为水杨酸制剂或递减皮质类固醇剂量时的辅助药物。疗程中常有较多胃肠道反应 如恶心、呕吐和食欲减退等。长期应用会发生视网膜的退行性变和视神经萎缩等。(5)左旋咪唑可减轻疼痛、缩短关节僵硬的时间。副作用有眩晕、恶心、过敏性皮 疹、视力减退、嗜睡、粒细胞减少、血小板减少、肝功能损害、蛋白尿等。(6)免疫抑制剂适用在其它药物无效的严重类风湿性关节炎患者，副作用有骨 髓抑制、白细胞及血小板下降，肝脏毒性损害及消化道反应、脱发、闭经、出血性拼膀光炎寸。(7)肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素对关节肿痛，控制炎症，消炎止痛作用迅 速，但效果不持久，对病因和发病机理毫无影响。一旦停药短期可即复发。对RF、血沉和贫 血也无改善，长期应用将导致严重副作用。这两种疾病都有治疗困难，治疗副作用大的问题，需要更有针对性的靶向治疗技 术来治疗这些疾病。
发明内容
本发明利用叶酸受体在癌细胞和自身免疫性疾病患者体内激活的巨噬细胞表面 中的特异性表达特性，将叶酸与抗体免疫球蛋白IgG偶联，提供一种叶酸-IgG偶联物及其 制备方法与在制备抗癌药物和治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
因此本发明的一个目的是提供一种叶酸-IgG偶联物，由叶酸与IgG构成，叶酸的 分子式为=C19H19N7O60 IgG为人源IgG或重组IgG或IgG的Fc段。本发明的另一个目的是提供一种叶酸-IgG偶联物的制备方法，将0. 1 30mol叶 酸(F)与0. 1 40mol 二环己基碳二亚胺(DCC)、0. 1 30mol羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)在 室温下于DMSO中反应2 5小时，离心取沉淀，与0. 01 2. O倍量人源IgG或重组IgG或 IgG的Fc段室温反应2 5小时后，将反应物过分子筛，收集产物即为叶酸-IgG偶联物。本发明的第三个目的是提供叶酸-IgG偶联物在制备治疗癌症药物中的应用。所述的癌症包括白血病、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝 癌、脉络膜癌、室管膜细胞瘤。本发明的第四个目的是提供叶酸-IgG偶联物在制备治疗自身免疫性疾病药物中 的应用。所述的自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤 引起的疾病，包括类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病、红斑狼疮、肺纤维化、肉样瘤病 (或结节病、Boeck肉样瘤、Schaumann良性淋巴肉芽肿病、Besnier冻疮样狼疮)。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果本发明的叶酸-IgG偶联物不会结合到正常细胞上，对正常细胞没有影响，解决了 现有技术中癌症治疗和自身免疫性疾病药物对正常细胞的损害问题。同时叶酸-IgG偶联 物无外源性蛋白质序列，不会导致体内的异源抗体中和反应。叶酸-IgG偶联物为小分子物 质，具有到达靶点时间短、血液清除速度快、穿透能力强的特点，能减少对身体的毒副作用。在制备抗癌症药物的应用中，叶酸-IgG偶联物能特异性的与癌细胞上高表达的 叶酸受体结合，然后通过IgG激活效应细胞的抗体或补体系统，并增强生物应答调节剂，如 白细胞介素-2(IL-2)等作用，产生细胞毒作用杀灭肿瘤细胞。由于是特异性结合，对正常 细胞没有影响。本发明的叶酸-IgG偶联物在制备治疗自身免疫性疾病药物的应用还具备以下优占.
^ \\\ ·自身免疫性疾病的发病机制很复杂，其病理过程涉及大量免疫细胞的激活及细胞 因子的释放，其中巨噬细胞的激活和大量炎性因子的释放在疾病的发生、发展中有着关键 性的作用。如前所述，叶酸-IgG偶联物特异性结合于类风湿关节炎等自身免疫性疾病患者 体内激活的巨噬细胞表面，并通过以下途径抑制巨噬细胞的吞噬功能或相关炎性因子的释 放，从而缓解此类疾病的症状。(1)抑制炎症性细胞因子的产生叶酸-IgG偶联物中IgG分子Fc段竞争性结合 巨噬细胞表面IgG Fc受体，使巨噬细胞不能通过Fc受体结合自身抗原-自身抗体Fc段， 吞噬功能明显受抑，炎症性因子亦随之分泌减少。(2)抑制细胞免疫反应正常情况下巨噬细胞吞噬抗原，并将抗原信息经抗原提 呈细胞(MHC)提呈给T淋巴细胞。T淋巴细胞在接受抗原信息和IL-I的刺激下，开始活 化、增殖和分化；TH2细胞分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 ；THl细胞分泌IL-2、干扰素 (IFN)，IL-12 ；细胞毒性T细胞(TC)发挥直接杀伤效应。叶酸-IgG偶联物提供大量IgG Fc 段占据巨噬细胞表面Fc受体，不能将抗原信息和IL-I提供给T淋巴细胞，致使其生物学功 能不能表达。
(3)减少自身组织破坏一些自身组织和细胞的破坏也是通过巨噬细胞吞噬作用 来实现(如血小板、红血球)。叶酸-IgG偶联物中的Fc段封闭巨噬细胞Fc受体后，可保全 已与自身抗体(如抗血小板抗体)结合的自身组织不被吞噬。
图1是叶酸-IgG偶联物的作用机制示意图
具体实施例方式实施例1叶酸-IgG偶联物，由叶酸与人源IgG偶联构成。叶酸的分子式为C19H19N706。其 制备方法如下将0. 1叶酸(F)与0. 1 二环己基碳二亚胺(DCC)、0. 1羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)在 室温下于DMSO中反应2小时，离心取沉淀，与0. 01倍量的人源IgG室温反应2小时后，将 反应物过PD-10分子筛，收集产物即为叶酸-IgG偶联物。实施例2叶酸-IgG偶联物，由叶酸与重组IgG偶联构成。叶酸的分子式为C19H19N706。其 制备方法如下将30mol叶酸与40mol 二环己基碳二亚胺(DCC)、30mol羟基琥珀酰亚胺酯(NHS) 在室温下于DMSO中反应5小时，离心取沉淀，与2. 0倍量的重组IgG室温反应5小时后，将 反应物过PD-10分子筛，收集产物即为叶酸-IgG偶联物。实施例3叶酸-IgG偶联物，由叶酸与重组IgG的Fc段偶联构成。叶酸的分子式为 C19H19N706。其制备方法如下将IOmol叶酸与20mol 二环己基碳二亚胺(DCC)、IOmol羟基琥珀酰亚胺酯(NHS) 在室温下于DMSO中反应3小时，离心取沉淀，与1. 0倍量的重组IgG的Fc段室温反应4小 时后，将反应物过PD-10分子筛，收集产物即为叶酸-IgG偶联物。实施例4叶酸-IgG偶联物(FIG)作为抗乳腺癌药物的应用实验材料药品及试剂叶酸-IgG偶联物(FIG)，按实施例2的方式制备；胎牛血清、MEM培养 基由Hyclone公司提供。乳腺癌细胞MCF-7由武汉大学菌种典藏中心提供。动物健康成熟雌性DBA/2小鼠50只，体重18 22g，由南京大学模式动物提供，生 产许可证号SCXK(苏)2005-0002。小鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。仪器TG328A型分析天平，紫外分光光度计，高速勻浆器等。实验方法动物分组与处理将上述小鼠按体重随机分为正常对照组、模型组、表阿霉素阳 性对照组、FIG lmg/kg组和FIG 100mg/kg组，试验开始前7天给予不含叶酸的鼠料。表 阿霉素阳性对照组、模型组、FIG lmg/kg组和FIG 100mg/kg组于试验第0天皮下注射 1 X 106MCF-7/只，第5天开始给药，FIG lmg/kg组及FIG 100mg/kg组分别腹腔注射FIGlmg/kgU00mg/kg,四日一次；表阿霉素阳性对照组小鼠腹腔注射表阿霉素200mg/kg，四日 一次；正常对照组和模型组小鼠腹腔注射等量的生理盐水，四日一次。小鼠于给药后第15 日禁食，次日给药后，以游标卡尺测量肿瘤体积，并计算第16天每组小鼠的平均存活时间。检测指标肿瘤体积(Volume):以游标卡尺测量实体瘤的长(L)、宽(W)和高(H)，按如下公 式计算V = 0. 5XLXWXH。平均存活时间(MST)求得每组小鼠的平均存活时间。实验结果(1)FIG对MCF-7在DBA/2小鼠体内增殖的抑制作用由表1可见，FIG lmg/kg、100mg/kg腹腔注射给药均可抑制MCF-7在DBA/2小鼠 体内的增殖。16天后，FIG lmg/kg、100mg/kg组实体瘤体积分别下降41. 5%、51.8%。表 明FIG腹腔给药对MCF-7在DBA/2小鼠体内的增殖有明显的抑制作用。(2) FIG对DBA/2荷瘤小鼠平均存活时间的影响FIG lmg/kg、100mg/kg腹腔注射给药均可提高荷瘤小鼠的平均存活时间，分别为 1. 00,2. 75倍，具体数据见表1。可见FIG能明显延长荷瘤小鼠的存活时间。表IFIG对DBAA荷瘤小鼠肿瘤体积及小鼠平均存活时间的影响(X±SD，n = 10)
权利要求
一种叶酸 IgG偶联物，其特征在于由叶酸与IgG构成，叶酸的分子式为C19H19N7O6；IgG为人源IgG或重组IgG或IgG的Fc段。
2.一种制备权利要求1所述的叶酸-IgG偶联物的方法，其特征在于将0. 1 30mol叶 酸(F)与 0. 1 40mol 二环己基碳二亚胺(N，N，-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、0· 1 30mol羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide，NHS)在室温下于二甲基亚砜(DMSO)中 反应2 5小时，离心取沉淀，与0. 01 2. 0倍量人源IgG或重组IgG或IgG的Fc段室温 反应2 5小时后，将反应物过分子筛，收集产物即为叶酸-IgG偶联物。
3.权利要求1所述的叶酸-IgG偶联物在制备治疗癌症药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的叶酸-IgG偶联物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于 所述癌症包括白血病、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、脉络膜癌、 室管膜细胞瘤。
5.权利要求1所述的叶酸-IgG偶联物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的叶酸-IgG偶联物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用， 其特征在于自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、炎症性肠病、银屑病、红斑狼疮、肺纤维 化、肉样瘤病。
全文摘要
本发明提供一种叶酸-IgG偶联物及其制备方法与应用，叶酸-IgG偶联物由叶酸与人源IgG或重组IgG或IgG的Fc段构成。叶酸-IgG偶联物的制备方法为0.1-30mol叶酸与0.1-40mol二环己基碳二亚胺、0.1-30mol羟基琥珀酰亚胺酯在室温下于DMSO中反应，离心取沉淀，与0.01～2.0倍量人源IgG或重组IgG或IgG的Fc段室温反应2～5小时后，将反应物过分子筛，收集产物即为叶酸-IgG偶联物。叶酸-IgG偶联物可以作为治疗癌症的药物和治疗自身免疫性疾病的药物。叶酸-IgG偶联物特异性地结合到癌症细胞和自身免疫性疾病患者体内激活的巨噬细胞上，而不会结合到正常细胞上，解决了现有技术中癌症治疗药物和自身免疫性疾病药物对正常细胞的损害问题。
文档编号A61P37/02GK101985471SQ20091006335
公开日2011年3月16日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者丁虹, 刘颖 申请人:武汉华耀生物医药有限公司