一种自固化微球及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种自固化微球及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、生物化工等领域中的药物载体领域。具体地说，本发明涉及一种自固化微球。本发明还涉及上述自固化微球的制备方法。本发明还涉及上述自固化微球作为生物活性物质载体的应用。
背景技术：
在医药、生物化工、化妆品、保健品以及组织工程等领域，常常会用到生物活性物 质，如蛋白、多肽等分子量大、空间结构复杂的生物大分子物质。这类物质在药物递送过程 中极易受到复杂生理环境特别是大量酶类物质的作用而遭到破坏。为解决这一问题，在过 去一段时间里人们主要采用注射的方式进行给药，但这类物质仍然存在体内半衰期短、血 药浓度波动大、需频繁给药等问题。基于以上原因，迫切需要对此类生物活性物质实现长效 缓释，采用微球作为长效缓释载体即为解决方法之一。微球在药物控释体系中占有重要的地位，以其作为载体包载生物活性物质，不仅 能避免体内酶和其他多种因素对药物活性的影响，而且也能通过载体的缓慢降解，实现药 物的长效缓释。但作为生物活性物质的载体，这类微球在制备时仍存在一些问题，会对药 物的活性产生影响。如使微球固化所采用的共价交联剂，如戊二醛等，也会与药物的活性基 团反应，使药物失活。并且对于大分子物质来说，如采用化学交联的微球作为载体，由于化 学交联的作用力较强，形成的球体结构较为致密，大分子物质从微球中向外的扩散速度很 慢，难以达到有效的血药浓度。此外，传统的搅拌法、喷射法等所制备的微球的粒径均一性 很差，粒径大小很难控制。当作为药物载体时，这会直接影响到药物的包埋率和生物利用 度。首先，在微球制备过程中，乳液的不均一会导致大小液滴合并，造成药物外泄，降低药物 包埋率。其次，在给药时，大的微球很容易被截留，不易被体内组织吸收，影响药物在体内的 分布，同时也降低药物生物利用度。载药微球的粒径大小难以控制，还会导致药物释放重复 性差，很难对其在体外体内释放速率做出精确量化，最终影响给药量的判断。因此，对于微 球类药物载体而言，制备方式是否温和、简单；粒径是否均一、可控，直接影响到药物的包埋 率、药物活性、用药成本、释药可控性以及在体内生物利用度等一系列关键问题，必须加以 解决。为了解决这些问题，曾经采用传统膜乳化法将具有低临界溶解温度(Low critical solution temperature,LCST)的温度敏感材料制备成适于生物活性物质包埋的 自固化微球。所用的温度敏感材料的LCST在37°C左右，当环境温度从其LCST以下升高至其 LCST以上时，温度敏感材料具有从溶液向凝胶转变的温度敏感性质，并且该材料的温敏相 变行为不可逆。自固化微球的制备利用温度敏感材料随温度发生相转变的性质，先在低于 其LCST的操作温度下(优选4°C )采用传统膜乳化法制备粒径均一的乳液，再将操作温度 升高到所用温度敏感材料的LCST以上，使乳液滴发生自固化得到粒径均一的微球。由于体 系中不用加入共价交联剂，并且采用了较为温和的传统膜乳化法制备微球，可以有效地保
4护活性物质的活性，控制微球的粒径分布范围，提高药物包埋率，实现药物的长效缓释。并 且所制备的微球为具有网络结构的凝胶微球，有利于大分子物质向外扩散。所采用的传统 膜乳化法的制备原理为将分散相在气体(通常为氮气)压力作用下缓慢压入微孔膜的膜孔 (所采用的微孔膜一般具有均勻大小的膜孔，常用的膜为Shriasu Porous Glass(SPG)膜和 聚合物膜)，在膜另一侧出口处，当所形成的乳液滴达到一定大小后便在各种力的作用下脱 离膜孔表面进入到连续相，形成液滴。所施加的过膜压力大小一般等于或略大于液滴脱落 所需的临界压力。传统膜乳化法可以通过选择不同孔径的微孔膜制备粒径在3-50微米之 间的微球，根据所用分散相和连续相的性质不同，形成的乳液滴的粒径大小与所用膜的膜 孔径大小一般呈3-10倍的线性关系。但当制备粒径小于10微米的微球时，所用的膜孔径 非常小(通常小于3微米)，此时即使在较高的过膜压力下乳化速度还是非常慢，尤其是当 所采用的温度敏感性材料具有较高的黏度时乳化速度更为缓慢，较高的黏度会使生成的液 滴在膜表面脱落困难，需要较长的乳化过程。增大压力在一定程度上能提高乳化速度，但太 大的压力会降低微球粒径的均一性。而作为制备药物载体的首选材料之一的多糖材料由于 其分子量较大，通常具有较高黏度。并且小粒径的微球在药物载体、免疫佐剂方面也有着广 泛的应用。有研究表明，在作为乙肝疫苗佐剂时，纳米颗粒比微米颗粒具有更好的效果。

发明内容
本发明的目的在于提供一种适于作为生物活性物质载体的自固化微球。本发明的又一目的在于提供一种上述自固化微球的制备方法。为实现上述目的，本发明提供的自固化微球，由具有低临界溶解温度的温敏性材 料制备而成，其平均粒径范围为δΟηπι-ΙΟΟμπι，其粒径分布系数小于20%，优选小于15%。 所述粒径分布系数按下式计算C. V. = {[ Σ (Cli-Cl)2/N]1/2/d} X 100%式中C. V.代表粒径分布系数；Cli代表各个微球的直径；d代表微球的数均平均粒径，d = Σ di/N ；N为用于计算粒径的微球数量，且N彡200个；通过下述方法得到1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分散相；2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预乳液；4)将步骤3中所述预乳液在压力下使其通过微孔膜一次或多次得到乳液；5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以上，使液滴固 化得到微球。本发明提供的制备上述自固化微球的方法，主要步骤如下1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分散相，生物 活性物质或功能成分在分散相中的浓度为0-10g/mL，温敏性材料在分散相中的浓度为0. lwt. % -50wt. % ；2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预乳液，分散相 与连续相的体积比为1 1-1 1000，优选为1 2-1 200 ；4)将步骤3中所述预乳液通过孔径为0. 1-100微米的微孔膜一次或多次得到乳 液；微孔膜的孔径优选为0. 8-50微米；5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以上，使液滴固 化得到微球；所述温敏性材料选自具有低临界溶解温度的一种或几种温敏材料的混合物或共 聚物，其低临界溶解温度介于25°C -60°C之间。 所述的方法，其中温敏性材料选自壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-甘 油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐混合物、羧甲基壳聚糖-甘油磷 酸盐混合物、壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合物、壳聚糖-聚乙烯醇混合物、壳聚 糖-磷酸氢二钾混合物、羟丁基壳聚糖、泊洛沙姆、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基 纤维素、泊洛沙姆-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰 胺-壳聚糖季铵盐共聚物、聚乙二醇-聚己内酯共聚物、聚乙二醇-壳聚糖共聚物、聚乳 酸-聚乙醇酸-壳聚糖共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物、聚 乳酸-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物中的一种或者几种。所述的方法，其中步骤4中预乳液通过微孔膜的压力为0-10. Okgf/cm2。所述的方法，其中步骤4中预乳液通过微孔膜的速度为0. δ-βπ ιΓ2!!-1。本发明具有下列效益(1)本发明提供的微球除了作为药物载体外，还可用作活细胞、组织或酶等载体， 应用于细胞培养、组织工程、微反应器等领域；(2)本发明提供的微球具有网络状结构以及亲水性环境，可为生物活性物质的生 长或增殖提供有利的微环境，保护物质的生物活性，并有利于反应底物和产物的扩散，促进 生物反应的进行；(3)采用本发明的制备方法，制备方法简单温和，有利于生物活性物质的活性保 持；(4)采用本发明的制备方法，对于制备纳米级的微球，可以通过热固化使乳液滴直 接发生胶凝，得到微球，因此可避免微球间的交联、仅在微球表面交联或无法充分交联微球 等情况，有利于得到粒径均一、交联均勻以及交联度高的微球。


图1是本发明制备微球的原理及流程示意图。图2是用于制备微球的均一乳液的装置示意图。图3是实施例1制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100倍。图4是实施例1制备的壳聚糖微球的扫描电镜照片，放大倍数3500倍。图5是采用不同孔径的SPG膜制备的壳聚糖微球的平均粒径与SPG膜孔径之间的 关系图。
图6是比较例1制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100倍。图7是比较例2制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100倍。图8是传统膜乳化设备的示意图。图9是比较例3制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100倍。图10是比较例4制备的壳聚糖微球的扫描电镜照片，放大倍数20000倍。
具体实施例方式本发明的自固化微球采用具有LCST的温敏性材料制备，微球的平均粒径为50纳 米-100微米，并且粒径非常均一。本发明提供的自固化微球适于作为生物活性物质载体。本发明的温敏性材料选自具有LCST的一种材料或几种材料的混合物或共聚物， 其LCST为25°C -60°C，对于包埋生物活性大分子的体系，其LCST优选为25V _40°C。温 敏性材料优选自壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖 季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐混合物、羧甲基壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖-甘油 磷酸盐-羟乙基纤维素混合物、壳聚糖-聚乙烯醇混合物、壳聚糖-磷酸氢二钾混合物、羟 丁基壳聚糖、泊洛沙姆、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆-壳聚糖 共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖季铵盐共聚物、聚 乙二醇(PEG)-聚己内酯(PCL)共聚物、聚乙二醇-壳聚糖共聚物、聚乳酸(PLA)-聚乙醇酸 (PLGA)-壳聚糖共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚 乙醇酸-聚乙二醇共聚物中的一种或者几种。在本发明中，温度敏感材料在低于其LCST的温度下为溶液状态，在高于或等于其 LCST的温度下发生从溶液向凝胶状态的相转变。在本发明的一些实施方案中，温度敏感材料为可逆性温度敏感材料，即当环境温 度从材料的LCST以上降低到以下时，温度敏感材料会发生从凝胶向溶液的相转变。此时， 需再次交联，以避免所得到的微球溶解。如泊洛沙姆体系为可逆性温度敏感材料，因此在 升温固化后需要进行再次交联。其制备方法为称取一定量泊洛沙姆407加入到9mL去离 子水中，磁力搅拌GOOrpm，IOmin)下使充分溶解，冷却到4°C作为分散相备用。泊洛沙姆 407在分散相中的浓度为20wt. %，其LCST为37°C。连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚 沸程为60-90°C)的混合物(体积比为1 2)中，乳化剂为P0-310，在连续相中的浓度为 0. Iwt. %，分散相与连续相的体积比为1 50。所用疏水SPG膜的孔径为5. 2微米，过膜压 力为2. Okgf/cm2,固化反应时的温度为50°C，保温lh。然后向反应体系中加入三乙胺2mL， 缓慢加入甲基丙烯酰氯5mL，反应池后，通氮气保护，加入引发剂(NH4) 2S208和还原剂NaHSO3 溶液，反应30min。在IOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到泊洛沙姆 微球，并将其保存在去离子水中。泊洛沙姆微球的平均粒径为3. 1微米，C. V.为15. 33%。 本领域技术人员可以根据需要，选择再次交联的交联剂种类、加入量及加入方式等。本发明的自固化微球的平均粒径介于50纳米-100微米之间。其按下式计算的粒 径分布系数小于20%，在优选条件下可以控制在15%以内C. V. = {[ Σ (Cli-CDVN]172/^ Χ100%式中，C. V.代表粒径分布系数；屯代表各个微球的直径；d代表微球的数均平均粒 径，d = Σ φ/Ν ；N为用于计算粒径的微球数量，且N彡200个。
本发明的自固化微球的尺寸非常均一，微球之间无合并现象，在保存的过程中不 会出现并聚现象。在本发明中，所述的微球为由温度敏感材料液滴通过固化形成的粒径从纳米至微 米级的微球，可以具有实心、多孔、中空、中空多孔等结构。当需要制备具有特殊孔结构的微 球时，可以在分散相中加入一定量的致孔剂。本发明提供的自固化微球中可包埋或吸附具有药用价值的药物、保健品或化妆品 的功能成分，功能成分可选自于蛋白质、多肽、酶、疫苗、细胞、基因、激素、抗菌素、抗癌药 物、动植物提取物及其混合物中的一种或者几种。本发明提供的微球中，优选包埋生物活性 物质。本发明的制备上述自固化微球的方法，其包括如下步骤(1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分散相；所述活性物质或功能成分必须完全溶解或均勻分散于步骤1中的分散相中，所述 的功能成分可选自于蛋白质、多肽、酶、疫苗、细胞、基因、激素、抗菌素、抗癌药物、动植物提 取物及其混合物中的一种或者几种，功能成分在分散相中的浓度为0-10g/mL。所述的步骤 1中功能成分的浓度可为Og/mL，此时制备的为空白微球。在本发明方法的一些实施方案中，步骤1中的温敏性材料的溶液为壳聚糖-甘油 磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸 盐混合物、羧甲基壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合 物、壳聚糖-聚乙烯醇混合物、壳聚糖-磷酸氢二钾混合物、羟丁基壳聚糖、泊洛沙姆、甲 基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰 胺-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖季铵盐共聚物、聚乙二醇(PEG)-聚己内 酯(PCL)共聚物、聚乙二醇-壳聚糖共聚物、聚乳酸(PLA)-聚乙醇酸(PLGA)-壳聚糖共聚 物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙醇酸-聚乙二醇 共聚物的水溶液或弱酸溶液中的一种或者几种，温敏性材料的LCST为25°C -60°C，对于包 埋生物活性大分子的体系，其LCST优选为25V _40°C。温敏性材料在分散相中的浓度为 0. lwt. % -50wt. %。(2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；在本发明方法的一些实施方案中，步骤2中的溶剂为在常温下呈液体状且与水不 互溶的油性物质，可使用液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、硅油、烷类碳 氢化合物中的一种或几种，也可使用其混合物。在本发明方法的一些实施方案中，当步骤2中的溶剂为油性物质时，乳化剂为油 溶性乳化剂，其亲水亲油平衡值HLB可以在3-6之间，在本发明的具体实施方案中，优选 为失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸 酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、甘油醚的聚合物(如P0-500、P0-310)、亲油-亲水嵌段共聚物 中的一种或几种。乳化剂在连续相中的浓度为0. I-IOwt. %。(3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中的连续相中得到预乳液，其中分散相 与连续相的体积比优选为1 1-1 1000，更优选为1 5-1 200 ；(4)将步骤3中的预乳液在一定的压力下使其通过孔径均一的微孔膜一次或多次 得到乳液；
在本发明方法的一些实施方案中，步骤4中的乳液过膜次数可为多次，即通过同 一微孔膜至少一次以上以得到均一乳液，优选为3-5次。在本发明方法的一些实施方案中，步骤4中的预乳液通过至少一个，优选至少两 个孔径均一的微孔膜以得到所述乳液。在另一些实施方案中，步骤4中的预乳液通过同一 孔径均一的微孔膜至少一次，优选至少两次以上以得到所述乳液。例如，所述预乳液可以连 续或间歇地通过两个或更多个孔径均一的微孔膜，先使用的微孔膜的孔径大于或等于后使 用的微孔膜的孔径。或者，所述预乳液可以通过同一孔径均一的微孔膜两次或更多次，每次 通过在相同或不同的压力条件下进行。通过选择具有合适孔径的微孔膜，将预乳液通过所 述孔径均一的微孔膜一次或多次或者通过一个或多个微孔膜后，所得乳液中的乳液滴的粒 径分布系数CV值会逐渐变小，直至小于20%，因此在步骤5中固化后即可得到本发明的平 均粒径为50纳米-100微米和CV值小于20%的凝胶微球产品。在本发明方法的一些实施方案中，微孔膜优选疏水性的膜，如聚乙烯膜、聚丙烯 膜、聚四氟乙烯膜或经过疏水处理的SPG膜。在制备过程中，可通过选择不同膜孔径的膜来 控制产品的粒径大小，常用的微孔膜的孔径为0. 1-100微米。由于不同膜孔径所制备的微 球粒径不同，所制备的微球的平均粒径与膜孔径存在某种线性关系。因此，对于某一特定体 系，可以选择不同孔径大小的膜来制备所需粒径的微球。在本发明方法的一些实施方案中，所述压力为0-10. Okgf/cm2，优选压力与所用 膜材料、膜孔径、所用分散相性质、所用连续相性质和操作温度有关。以4°C下，以平均孔 径为1. 4微米的疏水修饰SPG膜制备壳聚糖-甘油磷酸钠微球(分散相为壳聚糖-甘油 磷酸钠弱酸溶液，壳聚糖在分散相中的浓度为3. 5wt. %，甘油磷酸钠在分散相中的浓度为 10. Owt. %，弱酸溶液为0. lmol/L的醋酸溶液；连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程 为60-90°C )的混合物(体积比为5 7)，连续相中乳化剂为P0-500，浓度为%，分散 相与连续相的体积比为1 25)为例，所用压力为5. Okgf/cm2，预乳液通过微孔膜的速度为 1. δηΛιΓ、-1，所得壳聚糖微球的平均粒径为870纳米。同样条件下，以平均孔径为2. 8微米 的疏水修饰SPG膜制备壳聚糖-甘油磷酸钠微球，所用压力为3. Okgf/cm2,预乳液通过微孔 膜的速度为2. ΟπΛιΓ、-1，所得壳聚糖微球的平均粒径为1. 6微米。( 将步骤4中的乳液升温至所用温敏性材料的LCST以上，使液滴固化得到微球。上述制备方法中，步骤1至4中的操作温度低于所用温度敏感材料的LCST，优选为 40C -250C ；步骤5中的固化温度高于所用温度敏感材料的LCST，优选为25°C _60°C。在本 发明方法的一些实施方案中，当分散相中含有生物活性物质时，所用的温度敏感性材料为， 步骤1至4中的操作温度优选为4°C，步骤5中的固化温度优选为25°C -37°C。上述制备方法中，步骤5中液滴的固化可以采用直接将环境温度升高至高于所用 材料的LCST以上进行固化，也可以采用逐步升高环境温度，直至高于所用材料的相转变温 度以上进行固化。在本发明方法的一些实施方案中，步骤5中可以在液滴固化后加入共交联剂，如 三聚磷酸钠、环氧氯丙烷、戊二醛、京尼平等。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的共 交联剂、加入量及加入方式等。在本发明方法的一些实施方案中，还可对自固化微球的表面进行修饰，选择具有 靶向作用的小分子或抗体接枝在微球的表面，使微球具有靶向性，实现对特定部位的靶向
9释药。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的靶向分子及制备工艺，如交联剂、反应温 度和时间等。在本发明方法的一些实施方案中，自固化微球中还可加入保护剂，有利于生物活 性药物的活性保持。保护剂可选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、赖氨酸、明胶、环糊精中的一种或 几种的复配。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的保护剂种类及加入量等。在本发明中使用的术语“均勻乳液”或“均一乳液”是指粒径均一的微球固化前的 乳液。在本发明中使用的术语“膜孔径”是指微孔膜的体积平均孔径。下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是，应当理解，这些举例说明仅仅是 为了便于更好地理解本发明，而绝非对本发明范围的限制。在实施例中所用的“壳聚糖”分子量为78000Da，脱乙酰度为86%;“壳聚糖季铵盐” 分子量为50000Da，季铵取代度为50% ；“疏水处理的SPG膜”是经疏水修饰方法处理后的 SPG玻璃膜(SPG TECHNOLOGYCo.，Ltd生产，型号为PJN06L)。例如，化学修饰的疏水SPG膜 可经如下疏水处理得到将亲水性的SPG膜在纯净水中常温下超声30分钟，然后放入3% (V/V)的修饰剂KP-18C(产地日本)的水溶液中，之后减压(真空度为0. 5MPa)超声2h， 再在120°C下加热4h。疏水的SPG微孔膜也可经如下疏水处理得到将亲水性的SPG膜置 于所用油相中浸泡过夜或超声半小时以上直至膜孔被油相充分湿润。重组人胰岛素(以下 简称胰岛素)由北京甘&李生物技术有限公司提供。Mastersizer 2000E #7 14 iS Χ (Malvern Instruments, United Kingdom) M 于检测微米级微球的粒径大小及其分布，Zeta电位及粒度分析仪ktaPlus (BrooWiaven Instuments Corporation,USA)用于检测纳米级微球的粒径大小及其分布，JEM-6700F扫描 电镜(JE0L SEM Co.，Japan)用于观察微球表面形貌结构，XSZ-H3光学显微镜(重庆光电 仪器有限公司)用于观察微球在水溶液中的粒径大小及分布。自固化微球的制备按图1所示的步骤制备，该过程在图2所示的装置中完成。具 体方法和步骤说明如下1)预乳液的制备将一定量的温敏性材料和药物加入到一定量的溶剂中，并搅拌使温敏性材料和药 物充分溶解作为分散相；将一种以上的乳化剂溶于连续相中。将分散相与连续相均冷却到 所用温敏性材料的低临界溶解温度以下，将分散相与连续相迅速混合后通过磁力搅拌、机 械搅拌、均质乳化或超声分散制备得到预乳液。2)乳液的制备在图2所示的快速膜乳化装置中采用快速膜乳化法将上述步骤1所得到的预乳液 制备成粒径均一的乳液，整个快速膜乳化装置置于恒温箱内(4-保温层)。具体过程如下 将上述所得的预乳液加入到预乳液储存器中(5-预乳液储存器，6-排空阀)，在一定压力 (1-氮气进口，2-压力表，3-排空阀)下迅速通过微孔膜(7-微孔膜)进入到乳液收集器中 (8-乳液收集器)，得到粒径均一的乳液。3)微球的制备将上述步骤2所得到的乳液转入到升温装置中，在缓慢的搅拌下程序升温至或直 接使温度恒定在所用温敏性材料的LCST以上，使乳液滴发生胶凝固化，并进行洗涤，所得微球保存于去离子水中(可添加一定浓度的抑菌剂)。固化时搅拌速度应适中，既可以使乳 液均勻分散，不发生分层，又不致于打碎液滴。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的 搅拌速度和搅拌工艺，如搅拌桨的形状、容器的形状等。在本发明方法的一些实施方案中， 固化时转速为50-300rpm。自固化微球中药物包埋率的测定方法为分别准确称量两份5mg冻干空白微球和 一份5mg载药微球，向其中一份空白微球中加入2. 5mL去离子水和2. 5mL 2mol/L的HCl溶 液(含lmg/mL的NaNO2)并将其标记为“空白液”；向另一份空白微球中加入2. 5mL 100 μ g/ mL的药物溶液和2. 5mL、2mol/L的HCl溶液(含lmg/mL的NaNO2)，将其标记为“标准液”； 在载药微球中加入2. 5mL去离子水和2. 5mL 2mol/L的HCl溶液(含lmg/mL的NaNO2)并 将其标记为“未知液”。将上述三份微球在120°C下回流搅拌，使微球完全降解。以空白液 做参比，将空白液和标准液分别按一定体积混合后以Lowry法测定并制作标准曲线，并以 空白液做参比采用相同方法测定未知液吸光值。通过标准曲线计算未知液中药物含量。药 物包埋率计算公式为药物包埋率=(实测药物装载率/理论药物装载率)X 100%。微球中药物活性检测方法为精确称取20mg载药微球，将其分散在IOmL pH = 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，4°C下120rpm下振荡8h，IOOOOrpm下离心取上清液，用Lowry法 测定上清液中药物含量。并采用高效液相色谱法测定上清液中药物活性，测定时采用线性 梯度洗脱，流动相A为0. 1 %的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0. 1 %三氟乙酸的乙腈，即在 20min内将80% A和20% B线性梯度变化为50% A和50% B，洗脱流速为lmL/min。将上 清液中的药物流出曲线与标准的药物溶液进行对照，根据峰面积计算药物活性大小。药物 活性保留率计算公式为药物活性保留率=(实测微球中包埋药物的活性/等量标准药物的活性)X100%实施例1膜的疏水修饰将孔径为1. 4 μ m的亲水性SPG膜置于液体石蜡与石油醚(石油醚 沸程为60-90°C，体积比5 7)的混合油相中浸泡过夜使膜孔充分湿润。分散相制备温敏性材料选用壳聚糖-甘油磷酸盐体系，其制备方法为准确称取 一定量的壳聚糖溶于9mL醋酸溶液(0. lmol/L)中，磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖醋 酸溶液；另将一定量的甘油磷酸钠溶解于ImL去离子水中。将壳聚糖醋酸溶液及甘油磷酸 钠溶液分别在4°C下保温IOmin后，将甘油磷酸钠溶液缓慢滴加至壳聚糖醋酸溶液中，磁力 搅拌(300rpm，IOmin)将其混合均勻。将此溶液在20000rpm下离心除去不溶性杂质，保留 上清液作为分散相备用。壳聚糖在分散相中的浓度为3. 5wt. %，甘油磷酸钠在分散相中的 浓度为 10. Owt. %，其 LCST % 28°Co连续相制备将油溶性乳化剂P0-500加入到60mL的液体石蜡和石油醚(石油醚 沸程为60-90°C)的混合物(体积比为5 7)中，其浓度为%，搅拌至完全溶解，在 4°C下保温IOmin作为连续相。乳液制备在4°C下，将2mL的分散相与50mL的连续相混合并用均质乳化器在 6000rpm下乳化lmin，形成预乳液。将所得预乳液迅速倒入快速膜乳化装置的预乳液储存 器中，在5. Okgf/cm2的氮气压力下，使其快速通过疏水的SPG微孔膜，得到粒径比较均一的 W/0型乳液，将所得乳液作为预乳液在5. Okgf/cm2的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复 乳化五次，最终得到粒径均一的W/0型乳液；乳化过程耗时约lOmin，乳化完毕后，将W/0型乳液放入35°C的水浴中，机械搅拌QOOrpm)下固化lh。固化反应结束后，在IOOOOrpm下离 心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。微球 的平均粒径和粒径分布采用^ta电位及粒度分析仪^taPlus测量，在水中微球的平均直 径为870纳米，C. V.值为13.8%，光学显微镜照片如图3所示，扫描电镜照片如图4所示， 结果表明所制备的壳聚糖微球粒径均一，表面疏松多孔。实施例2采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所用SPG膜的 膜孔径为10. 2微米，膜的疏水修饰步骤为将亲水性的SPG膜在纯净水中常温下超声30分 钟，然后放入3% (V/V)的修饰剂KP-18C(产地日本)的水溶液中，之后减压(真空度为 0. 5MPa)超声2h，再在120°C下加热4h。分散相壳聚糖在分散相中的浓度为0. 8wt. %，甘油磷酸钠在分散相中的浓度为
8.Owt. %，溶剂为0. lmol/L的盐酸溶液，其LCST为60°C,连续相连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为90_120°C )的混合物(体积 比为2 1)中，乳化剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油，在连续相中的浓度为Iwt. %。分散相与连续相的体积比为1 200。过膜压力为l.Okgf/cm2，过膜4次。固化 反应时的温度为60°C，固化时间为池。所得壳聚糖微球的平均粒径为5. 11微米，C. V.为
9.81%，结果表明所制备得到的壳聚糖微球粒径比较均一。实施例3采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖季铵盐微球，所不同的是分散相的 配方温敏性材料选用壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐体系，其制备方法为准确称取一定量的 壳聚糖季铵盐溶于9mL乳酸溶液(0. lmol/L)中，磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖季铵 盐乳酸溶液；另将一定量的甘油磷酸钠溶解于ImL去离子水中。将壳聚糖季铵盐乳酸溶液 及甘油磷酸钠溶液分别在4°C下保温IOmin后，将甘油磷酸钠溶液缓慢滴加至壳聚糖季铵 盐乳酸溶液中，磁力搅拌(300rpm，IOmin)将其混合均勻。将此溶液在20000rpm下离心除 去不溶性杂质，保留上清液作为分散相备用。壳聚糖季铵盐在分散相中的浓度为3. 5wt. %, 甘油磷酸钠在分散相中的浓度为10. Owt. %，其LCST为25°C。连续相为豆油，乳化剂为失 水山梨醇三硬脂酸酯，在连续相中的浓度为IOwt. %，分散相与连续相的体积比为1 100。 所用疏水SPG膜的孔径为50. 2微米，过膜压力为0. ^igf/cm2，过膜三次。固化反应时的温 度由4°C缓慢升高至40°C，升温速率为1°C /min,当温度升至40°C时，保温30min。所得壳 聚糖季铵盐微球的平均粒径为37微米，C. V.为19. 21%。实施例4采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖季铵盐微球，所不同的是分散相的 配方温敏性材料选用壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐体系，其制备方法为准确称 取一定量的壳聚糖季铵盐溶于9mL盐酸溶液(0. lmol/L)中，磁力搅拌下使其充分溶解得 到壳聚糖季铵盐盐酸溶液；另将一定量的甘油磷酸钠与聚乙二醇6000溶解于ImL去离子 水中。将壳聚糖季铵盐盐酸溶液及甘油磷酸钠与聚乙二醇6000水溶液分别在4°C下保温 IOmin后，将甘油磷酸钠与聚乙二醇6000水溶液缓慢滴加至壳聚糖季铵盐盐酸溶液中，磁 力搅拌GOOrpm，IOmin)将其混合均勻。将此溶液在20000rpm下离心除去不溶性杂质，保 留上清液作为分散相备用。壳聚糖季铵盐在分散相中的浓度为2. 5wt. %，甘油磷酸钠在分散相中的浓度为3. Owt. %，聚乙二醇6000在分散相中的浓度为3. Owt. %，其LCSTS^°C。 连续相为橄榄油，乳化剂为失水山梨醇单油酸酯，在连续相中的浓度为5wt. %，分散相与连 续相的体积比为1 50。所用疏水SPG膜的孔径为四.5微米，过膜压力为0.4kgf/cm2，过 膜5次。固化反应时的温度由4°C缓慢升高至40°C，升温速率为1°C /min,当温度升至40°C 时，保温30min。所得壳聚糖季铵盐微球的平均粒径为14. 2微米，C. V.为17. 58%。实施例5采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，所不同的是分散相的配方 温敏性材料选用聚乙二醇-壳聚糖共聚物体系，其制备方法为准确称取一定量的聚乙二 醇-壳聚糖共聚物加入9mL去离子水中，磁力搅拌GOOrpm，IOmin)下使其充分溶解，冷 却到4°C作为分散相备用。聚乙二醇-壳聚糖共聚物在分散相中的浓度为3. Owt. %，其 LCST为25°C。连续相为葵花子油，乳化剂为失水山梨醇倍半油酸酯，在连续相中的浓度为 0.5wt. %，分散相与连续相的体积比为1 1。所用疏水SPG膜的孔径为11.2微米，过膜压 力为OJkgf/cm2，过膜4次。固化反应时的温度为30°C，保温lh。所得壳聚糖微球的平均 粒径为7. 6微米，C. V.为16. 。实施例6采用与实施例1相同的装置和方法制备泊洛沙姆微球，其中不同的是温敏性材料 选用泊洛沙姆体系，其制备方法为称取一定量泊洛沙姆407加入到9mL去离子水中，磁力 搅拌GOOrpm，IOmin)下使充分溶解，冷却到4°C作为分散相备用。泊洛沙姆407在分散相中 的浓度为20wt. %，其LCST为37°C。连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60-90°C ) 的混合物(体积比为1 2)中，乳化剂为P0-310，在连续相中的浓度为0. Iwt. %，分散相 与连续相的体积比为1 50。所用疏水SPG膜的孔径为5. 2微米，过膜压力为2. Okgf/cm2， 过膜2次。固化反应时的温度为50°C，保温lh。由于泊洛沙姆为可逆性温度敏感材料，因 此在升温固化后需要进行再次交联。向反应体系中加入三乙胺2mL，缓慢加入甲基丙烯酰 氯5mL，反应池后，通氮气保护，加入引发剂(NH4)2S2O8和还原剂NaHSO3溶液，反应30min。 在lOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到泊洛沙姆微球，并将其保存 在去离子水中。泊洛沙姆微球的平均粒径为3. 1微米，C. V.为15.33%。实施例7采用与实施例1相同的装置和方法制备聚乙二醇-聚乙醇酸微球，其中不同的是 温敏性材料选用聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物体系，其制备方法为称取一定量聚乙二醇-聚 乙醇酸共聚物加入到9mL Tris-HCKpH = 8. 6)的缓冲液中，磁力搅拌(400rpm, IOmin)下 使充分溶解，冷却到4°C作为分散相备用。聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物在分散相中的浓度 为35wt. %，其LCST为40°C。连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60_90°C )的混 合物(体积比为3 7)中，乳化剂为P0-500，在连续相中的浓度为8. Owt. %，分散相与连 续相的体积比为1 20。所用膜为孔径为10. 8微米的聚四氟乙烯膜，过膜压力为OJkgf/ cm2，过膜1次。固化反应时的温度为60°C，保温lh。所得聚乙二醇-聚乙醇酸微球的平均 粒径为8. 6微米，C. V.为19. 42%。实施例8采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖-纤维素微球，其中不同的是温敏 性材料选用壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合物体系，其制备方法为称取一定量壳聚糖加入到9mL醋酸溶液(0. lmol/L)中，另将一定量的甘油磷酸钠与羟乙基纤维素溶解 于ImL去离子水中。将壳聚糖酸溶液及甘油磷酸钠与羟乙基纤维素水溶液分别在4°C下保 温IOmin后，将甘油磷酸钠与羟乙基纤维素水溶液缓慢滴加至壳聚糖酸溶液中，磁力搅拌 (400rpm, IOmin)将其混合均勻。将此溶液在20000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液 作为分散相备用。壳聚糖、甘油磷酸钠、羟乙基纤维素在分散相中的浓度分别为1.2wt. 3. 6wt. %,0. 5wt. %，其LCST为40°C。所用连续相为石油醚(沸程为90_120°C )，乳化 剂为失水山梨醇三油酸酯，在连续相中的浓度为10. Owt. %，分散相与连续相的体积比为 1 150。所用膜为孔径为1.4微米的聚丙烯膜，过膜压力为4. m^gf/cm2，过膜3次。固化 反应时的温度为60°C，保温lh。所得壳聚糖-纤维素微球的平均粒径为902纳米，C. V.为 14. 68%。实施例9采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所用连续相为 液体石蜡和石油醚(沸程60-90°C)的混合物(体积比为11 1)，油相乳化剂为P0-310， 在连续相中的浓度为5wt. %。所用膜为经过疏水处理的孔径为0.8微米和2. 8微米的SPG 膜。乳液的制备方法为在4°C下，将2mL的分散相与50mL的连续相混合并用均质乳化器 在6000rpm下乳化lmin，形成预乳液。将所得预乳液迅速倒入快速膜乳化装置的预乳液储 存器中，在3. Okgf/cm2的氮气压力下，使其快速通过2. 8微米的SPG微孔膜，将所得的乳液 作为预乳液在5. Okgf/cm2的氮气压力下再次通过0. 8微米的SPG微孔膜，最终得到粒径均 一的W/0型乳液，乳化完毕后，将W/0型乳液放入37°C的水浴中，机械搅拌QOOrpm)下固 化lh。固化反应结束后，在IOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳 聚糖微球，并将其保存在去离子水中。所得壳聚糖微球的平均粒径为670纳米，C. V.值为 11. 2%。实施例10采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所用膜为孔径 为11.8微米的聚乙烯膜，过膜4次，操作压力为0.6证8€/(^2。得到粒径均一的W/0型乳 液后，将W/0型乳液放入37°C的水浴中，机械搅拌QOOrpm)下固化lh。然后向乳液中加入 一定量的三聚磷酸钠乳液，其中三聚磷酸钠乳液的制备方法为将一定量的三聚磷酸钠溶 于ImL去离子水中，加入到IOmL的液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60_90°C )的混合物 (体积比为5 7，含有%的P0-500)，用均质乳化器在6000rpm下乳化lmin，形成三 聚磷酸钠乳液。加入三聚磷酸钠的用量依据如下比例计算得到，即三聚磷酸钠上的磷酸基 与壳聚糖上氨基的摩尔比为2 1。机械搅拌QOOrpm)下继续固化lh。固化反应结束后， 在lOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳聚糖微球，并将其保存在 去离子水中。所得壳聚糖微球的平均粒径为7. 7微米，C. V.值为14. 71%。实施例11采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所使用的SPG 微孔膜的孔径为0. 8微米，过膜压力为7. Okgf/cm2,所得壳聚糖微球的平均粒径为6 纳 米，C. V.值 19. 66%。实施例12采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔径为2. 8微米，过膜压力为3. Okgf/cm2，所得壳聚糖微球的平均粒径为1. 6微 米，C. V.值 18. 68%。实施例13采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所使用的SPG 微孔膜的孔径为9. 2微米，过膜压力为1. 5kgf/cm2,所得壳聚糖微球的平均粒径为6. 8微 米，C. V.值 17. 28%。实施例14采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所使用的SPG 微孔膜的孔径为50. 2微米，过膜压力为0. ^gf/cm2，所得壳聚糖微球的平均粒径为24. 5微 米，C. V.值 19. 24%。实施例1、实施例11、实施例12、实施例13和实施例14所制备的壳聚糖微球平均 粒径与SPG膜孔径之间的关系如图5所示。由图5可以看出壳聚糖微球平均粒径与SPG膜 孔径之间基本呈线性关系。实施例15采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是在分散相中加 入生物活性物质-胰岛素和保护剂-蔗糖，其制备方法为准确称取一定量的胰岛素和蔗 糖，加入到壳聚糖-甘油磷酸钠混合溶液中，磁力搅拌(150rpm，20min)使其充分溶解，冷 却到4°C作为分散相备用。蔗糖在分散相中的浓度为0. 5wt. %，胰岛素在分散相中的浓度 为100. Omg/mL。所得壳聚糖微球的平均粒径为966纳米，C. V.为15. 4 %，药物包埋率为 94.4%,活性保留率为97. 3%0实施例16采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是在分散相中加 入生物活性物质-胰岛素和保护剂-甘露醇，其制备方法为准确称取一定量的胰岛素和 甘露醇，加入到壳聚糖-甘油磷酸钠混合溶液中，磁力搅拌(150rpm，20min)使其充分溶解， 冷却到4°C作为分散相备用。蔗糖在分散相中的浓度为0. 5wt. %，胰岛素在分散相中的浓 度为0. 5mg/mL。所得壳聚糖微球的平均粒径为921纳米，C. V.为16. 7 %，药物包埋率为 97. 2%，活性保留率为93.9%。实施例17采用与实施例3相同的装置和方法制备壳聚糖季铵盐微球，其中不同的是在分散 相中加入生物活性物质-胰岛素和保护剂-甘氨酸，其制备方法为准确称取一定量的胰 岛素和甘氨酸，加入到壳聚糖季铵盐-甘油磷酸钠混合溶液中，磁力搅拌(150rpm，20min) 使其充分溶解，冷却到4°C作为分散相备用。甘氨酸在分散相中的浓度为l.Owt. %，胰岛素 在分散相中的浓度为5. Omg/mL。所得壳聚糖季铵盐微球的平均粒径为952纳米，C. V.为 16. 2%，药物包埋率为96. 7%，活性保留率为95. 1% ο实施例18采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，准确称取Ig制备得到的壳聚 糖微球，分散在IOmL去离子水溶液中，加入IOmL含有Ig甘草次酸的N，N-二甲基甲酰胺溶 液，磁力搅拌QOOrpm)下向混合体系中缓慢滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐的水溶液，室温下反应24h后，将反应体系倒入800mL丙酮中，静置Mh，在IOOOOrpm下离心，依次用丙酮、乙醇、乙醚、去离子水离心洗涤，得到具有肝靶向效果的甘草次酸修饰 的壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。实施例19采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，准确称取Ig制备得到的壳聚 糖微球，加入IOmL含有IOmg胰岛素的磷酸盐缓冲溶液(pH = 8. 0)中，4°C下振荡(120rpm， Mh)，10000rpm下离心，用去离子水洗涤三次，得到吸附有胰岛素的壳聚糖微球。药物包埋 率为82. 7%，活性保留率为97. 1%。比较例1采用与实施例15相同的配方，采用机械搅拌法制备壳聚糖微球乳液制备在4°C下，将2mL的分散相倒入50mL的连续相中，IOOOrpm下磁力搅拌 30min，得到W/0型乳液；乳化完毕后，将W/0型乳液放入35°C的水浴中，机械搅拌QOOrpm) 下固化lh。固化反应结束后，在IOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得 到壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪测 量，在水中微球的平均直径为27. 2微米，C. V.值为56. 2%，光学显微镜照片如图6所示， 药物包埋率为53. 1%，活性保留率为60. 1%。结果表明所制备的壳聚糖微球粒径非常不均 一，大小乳液滴间的破裂和合并造成药物包埋率较低，并且机械搅拌法中所用的剪切力较 大，导致药物活性保留率较低。比较例2采用与实施例15相同的配方，采用均质乳化法制备壳聚糖微球乳液制备在4°C下，将2mL的分散相倒入50mL的连续相中，3000rpm下均质乳化 2min，得到W/0型乳液；乳化完毕后，将W/0型乳液放入35°C的水浴中，机械搅拌QOOrpm) 下固化lh。固化反应结束后，在IOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得 到壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪测 量，在水中微球的平均直径为11. 2微米，C. V.值为37. 1%，光学显微镜照片如图7所示， 药物包埋率为42. 9%，活性保留率为37. 2%。结果表明所制备的壳聚糖微球粒径非常不均 一，大小乳液滴间的破裂和合并造成药物包埋率较低，并且均质乳化法中所用的剪切力非 常大，导致药物活性保留率较低。比较例3采用与实施例15相同的配方，采用传统膜乳化法制备壳聚糖微球乳液制备在4°C下，将5mL分散相加入到如图8所示的传统膜乳化装置的分散 相储存器中(4’ -分散相储存器)，氮气加压(1-氮气进口，2-压力表，3-排空阀，压力为 3. 5kgf/cm2)，使分散相缓缓通过SPG膜被压入到50mL连续相中(5’ -连续相储存器，6-排 空阀，7-微孔膜，8’-连续相，9-磁子，10-磁力搅拌器)，得到W/0型乳液；待所有的分散相 都被压完后(约需4h)，将W/0型乳液放入35°C的水浴中，机械搅拌QOOrpm)下固化lh。 固化反应结束后，在IOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳聚糖微 球，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪测量，在水中微 球的平均直径为3. 4微米，C. V.值为17. 9%，光学显微镜镜照片如图9所示，药物包埋率为 75. 9%，活性保留率为97. 4%。结果表明所制备的壳聚糖微球粒径较为均一，但粒径偏大， 乳化耗时较长，所得到的壳聚糖微球较少。由于这一方法的制备效率较低，药物在较长时间的乳化过程中容易从液滴中向外泄漏，并且得到的微球产量较少，造成药物包埋率较低。比较例4采用与实施例1相同的装置和方法，采用快速膜乳化法制备戊二醛交联的壳聚糖 微球膜的疏水修饰将孔径为1. 4微米的亲水性SPG玻璃膜置于液体石蜡与石油醚按 体积比57的混合油相中浸泡过夜或超声半小时使膜孔充分湿润。分散相制备准确称取一定量的壳聚糖溶于9mL 0. lmol/L的醋酸水溶液中， 磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖醋酸水溶液，壳聚糖浓度为0. 5wt. %，将此溶液在 20000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液。准确称取一定量的胰岛素和蔗糖，加入到 壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌(150rpm，20min)使其充分溶解，冷却到4°C作为分散相备用。 蔗糖在分散相中的浓度为0. 5wt. %，胰岛素在分散相中的浓度为5. Omg/mL。连续相制备将油溶性乳化剂P0-500加入到60mL的液体石蜡和石油醚的混合物 (体积比为5 7)中，其浓度为%，搅拌至完全溶解作为连续相。乳液制备将2mL的分散相与连续相混合并用均质乳化器在6000rpm下乳化1分 钟，形成预乳液。然后，将所得乳液迅速倒入如图2所示的膜乳化装置中，在5. Okgf/cm2的 氮气压力下，使其快速通过孔径均一的SPG微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，过膜 5次，最终得到粒径均一的W/0型乳液；乳化完毕，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯 溶液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚糖上氨基的摩 尔比为2 1。35°C下交联反应10h，交联反应的搅拌速率为500rpm。交联反应结束后，在 IOOOOrpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，并将其保存在去离子水中。微球的 平均粒径和粒径分布采用^ta电位及粒度分析仪^taPlus测量，在水中微球的平均直径 为360.0纳米，C. V.值为13.8%，扫描电镜照片如图10所示，药物包埋率为89.9%，活性 保留率为64. 7%。结果表明所制备的壳聚糖微球粒径均一，由于共价交联作用力较强，因此 壳聚糖微球粒径偏小，表面非常致密光滑，不利于生物活性大分子的扩散。并且在制备过程 中，戊二醛上的醛基也可以和药物上的氨基反应，导致药物活性降低。通过以上的描述，本领域技术人员将想到本发明的许多改动和其它实施方案，并 根据本发明教导预知其益处。因此，应当理解，以上实施方案和实施例并未限制本发明，并 且对其进行的改动和其它的实施方案也包括在所附权利要求的范围内。虽然本文使用特定 术语，但是它们仅仅以其一般的和描述性意义使用，并不是为了限制权利要求中定义的本 发明的范围。
权利要求
1.一种自固化微球，由具有低临界溶解温度的温敏性材料制备而成，其平均粒径范围 为50nm-100 μ m,其粒径分布系数小于20%，所述粒径分布系数按下式计算C. V. = {[ Σ (Cli-CDVN]172/^ Χ100% 式中C. V.代表粒径分布系数； Cli代表各个微球的直径； d代表微球的数均平均粒径； d = Σ di/N ；N为用于计算粒径的微球数量，且N > 200个； 通过下述方法得到1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分散相；2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预乳液；4)将步骤3中所述预乳液在压力下使其通过微孔膜一次或多次得到乳液；5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以上，使液滴固化得 到微球。
2.如权利要求1所述的自固化微球，其中，粒径分布系数小于15%。
3.一种制备权利要求1所述的自固化微球的方法，主要步骤如下1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分散相，生物 活性物质或功能成分在分散相中的浓度为0-10g/mL，温敏性材料在分散相中的浓度为 0. lwt. % -50wt. % ；2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预乳液，分散相与连 续相的体积比为1 1-1 1000 ；4)将步骤3中所述预乳液通过孔径为0.1-100微米的微孔膜一次或多次得到乳液；5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以上，使液滴固化得 到微球；所述温敏性材料选自具有低临界溶解温度的一种或几种温敏材料的混合物或共聚物， 其低临界溶解温度介于25°C -60°C之间。
4.如权利要求3所述的方法，其中，温敏性材料选自壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚 糖季铵盐-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐混合物、羧甲基壳聚 糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合物、壳聚糖-聚乙烯醇混 合物、壳聚糖-磷酸氢二钾混合物、羟丁基壳聚糖、泊洛沙姆、甲基纤维素、羟乙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖共聚物、聚异丙 基丙烯酰胺-壳聚糖季铵盐共聚物、聚乙二醇-聚己内酯共聚物、聚乙二醇-壳聚糖共聚 物、聚乳酸-聚乙醇酸-壳聚糖共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚乙醇酸共 聚物、聚乳酸-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物中的一种或者几种。
5.如权利要求3所述的方法，其中，分散相与连续相的体积比为1 2-1 200。
6.如权利要求3所述的方法，其中，步骤4中预乳液通过微孔膜的压力为0-10.Okgf/
7.如权利要求3所述的方法，其中，微孔膜的孔径为0.8-50微米。
8.如权利要求3所述的方法，其中，步骤4中预乳液通过微孔膜的速度为0.δ-βπινν1.,
9.权利要求1所述的自同化微球作为生物活性物质载体的应用。
全文摘要
一种自固化微球，由具有低临界溶解温度的温敏性材料制备而成，其平均粒径范围为50nm-100μm，其粒径分布系数小于20％。通过下述方法得到1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分散相；2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预乳液；4)将步骤3中所述预乳液在压力下使其通过微孔膜一次或多次得到乳液；5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以上，使液滴固化得到微球。本发明适于作为生物活性物质载体。
文档编号A61K8/73GK102138904SQ20101911407
公开日2011年8月3日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者吴有斌, 吴颉, 王月琦, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所