抗cd160单克隆抗体及其用途的制作方法

专利名称：抗cd160单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了新的抗CD160单克隆抗体，尤其是小鼠-人嵌合的抗CD160抗体。抗 CD160抗体以及含有它们的药物组合物可用于抑制血管形成。
背景技术：
NK细胞的主要效应功能的特征在于细胞溶解活性，和产生细胞因子以及针对敏感靶细胞的趋化因子。NK细胞通过各种活化受体的特异性活动，辩别健康的与异常的肿瘤细胞或病毒感染的细胞。根据它们的信号介导的缔合分子，大多数活化NK细胞受体可以分成三组，但是已经鉴定了一个独特的不同的活化NK细胞受体，⑶160，其是I类MHC依赖的免疫球蛋白(Ig)样分子。⑶160由人和小鼠循环细胞毒素淋巴细胞表达，如NK⑶56dim+CD16+，大部分 TCRy δ T细胞，和细胞毒素效应性TCRa β⑶8Τ细胞，以及在几乎所有的肠上皮内淋巴细胞(ilELs)中(MAIZA 等人，J. Exp. Med.，vol. 178，ρ :1124-6,1993 ；ANUMANTHAN 等人， J. Immunol, vol. 161，ρ :2780-90,1998)。最后，相较于至今描述的其他活化受体，⑶160显示下列独特的特性1)⑶160由 NK基因复合体外面的1号染色体上的基因编码，幻它是一种多体糖基化磷脂酰肌醇(GPI) 锚定分子，幻活化以后它的细胞表面表达下调。血管形成是一种基本过程，通过该过程从以前存在的血管形成新的毛细管。这种过程在许多正常生理现象如繁殖，分化，瘢痕和器官再生中是必需的。在这些正常生物学现象中血管形成处于严格控制下；也即，它在短期几天内被引起，然后被完全抑制。但是，许多病理与侵入的，不受控制的血管形成相关。例如，关节炎是一种由于侵入的新血管对软骨产生的损伤而引起的病理。在糖尿病视网膜病中，新血管侵入视网膜导致患者失明；眼器官的新生血管形成是失明的主要原因，而且这种新生血管形成占眼睛的至少20种疾病。最后，许多肿瘤的生长和转移直接取决于血管形成。肿瘤刺激新血管生长用于它自身的用途。而且，这些新血管提供逃逸路径，通过该路径肿瘤可以到达血液循环系统，并且导致在较远位点如肝、肺或骨骼中的转移。最近，⑶160已经被鉴定为一种血管形成的抑制信号受体(F0NS等人，Blood, vol. 108 (8)，ρ :2608-15,2006)。ABTECH和INSERM的WO 03/018048涉及使用两种可溶性I类HLA分子抑制血管形成，这两种可溶性I类HLA分子结合CD160，被称为sHLA_Gl和sHLA_B7。INSERM的WO 2006/015886涉及使用抗CD160单克隆抗体抑制由内皮细胞上的前血管生成因子如VEGF或FGF2诱导的血管形成和生长。

发明内容
本发明涉及一种能结合CD160的抗体或其片段，其具有包括与含有下列的抗体的多肽序列具有至少90%同源性的多肽序列
a)包括具有下列氨基酸序列的3个轻链互补区(OTR)的轻链i)轻链 CDRl =QSISNH (SEQ ID NO 1)；ii)轻链 CDR2 :YAS ；iii)轻链 CDR3 =QQSNSffPLT(SEQ ID NO 2)；禾口来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；和b)包括具有下列氨基酸序列的3个重链互补区(OTR)的重链i)重链 CDRl GYTFTDYff (SEQ ID NO 3)；ii)重链 CDR2 :IYPO)DDA(SEQ ID NO 4)；iii)重链 CDR3 :ARRGIAAWGGFDY(SEQ IDNO 5)；禾口来自免疫球蛋白重链的重链构架序列。本发明还涉及含有至少一种这种抗⑶160抗体或其片段和药学可接受的载体的药物组合物。另外，本发明涉及一种抑制血管形成的方法，包括给需要其的患者提供这种药物组合物。最后，本发明涉及至少一种这种抗⑶160抗体或其片段用于制备治疗和/或预防与血管形成过程中涉及的内皮细胞增殖相关的病理的药物的用途。


图1 小鼠⑶160抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No. 6)和核苷酸序列 (SEQ ID No. 7)。图2 小鼠⑶160抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No. 8)和核苷酸序列 (SEQ ID No. 9)。图3 通过插入一个另外的半胱氨酸和终止密码子而衍生自人Y 1免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID No. 10)和核苷酸序列(SEQ ID No. 11)。图4 人γ 1免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID No. 12)和核苷酸序列(SEQ ID No. 13)。第一个AGC密码子被修改成GCT以产生克隆位点(Nhel)。图5 人γ 4免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID No. 14)和核苷酸序列(SEQ ID No. 15)。第一个AGC密码子被修改成GCT以产生克隆位点(Nhel)。图6 人κ免疫球蛋白的轻链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID No. 16)和核苷酸序列(SEQ ID No. 17)。图7 :a)包含人VL信号肽(共有的)的小鼠⑶160抗体的轻链的重组可变区的氨基酸序列(SEQ ID No. 18)和核苷酸序列(SEQ ID No. 19)，b)包含人VL信号肽(共有的) 的小鼠⑶160抗体的轻链的重组可变区的氨基酸序列(SEQ ID No. 28)和核苷酸序列(SEQ ID No.29)。图8 包含人VH信号肽(共有的)的小鼠⑶160抗体的重链的重组可变区的氨基酸序列(SEQ ID No. 20)和核苷酸序列(SEQ ID No. 21)。图9 小鼠可变轻链(SEQ ID No. 8)与具有最大同源性的人免疫球蛋白(SEQ ID No. 22 ；登录号AAZ09098)的氨基酸序列之间的序列比对。确定了⑶R区(共有的)。图10 小鼠可变重链(SEQ ID No. 6)与具有最大同源性的人免疫球蛋白之一(SEQID No. 23 ；登录号3FCTB)的氨基酸序列之间的序列比对。确定了⑶R区(共有的)。图11 小鼠可变重链(SEQ ID No. 6)与具有最大同源性的人免疫球蛋白之一(SEQ ID No. 24 ；登录号AAG00910)的氨基酸序列之间的序列比对。确定了 CDR区(共有的)。
具体实施例方式在第一个方面，本发明涉及一种能结合CD160的抗体或其片段，所述抗体具有包括与含有以下的抗体的多肽序列具有至少90%同源性，优选95%，更优选98%同源性的多肽序列a)包括具有下列氨基酸序列的3个轻链互补区(OTR)的轻链i)轻链 CDRl =QSISNH (SEQ ID NO 1)；ii)轻链 CDR2 :YAS ；iii)轻链 CDR3 =QQSNSffPLT(SEQ ID NO 2)；禾口来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；和b)包括具有下列氨基酸序列的3个重链互补区(OTR)的重链i)重链 CDRl GYTFTDYff (SEQ ID NO 3)；ii)重链 CDR2 :IYPO)DDA(SEQ ID NO 4)；iii)重链 CDR3 :ARRGIAAVVGGFDY(SEQ ID NO :5)；禾口来自免疫球蛋白重链的重链构架序列。抗体是相当于包括4条多肽链的四聚物的免疫球蛋白分子，即，之间通过二硫键连接的2条相同的重(H)链(全长时大约50-70kDa)和2条相同的轻(L)链(全长时大约 25kDa)。轻链分为κ和λ。重链分为Υ，μ，α，Δ或ε，而且限定抗体的同种型分别为 IgG, IgM, IgA, IgD和IgE。每条重链都由N-端重链可变区(这里缩写为HCVR)和重链恒定区组成。对于IgG，IgD和IgA，重链恒定区由3个区域(CH1，CH2和CH3)组成；对于IgM 和IgE，重链恒定区由4个区域(CH1，CH2，CH3和CH4)组成。每条轻链都由N-端轻链可变区(这里缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个区域，CL组成。HCVR和LCVR 区可以更进一步划分成超变区，称为互补决定区(CDR)，间隔以更保守的，称为构架区(FR) 的区域。每个HCVR和LCVR由3个⑶R和4个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个区域的氨基酸分配跟公知的惯例一致 (KABAT,“ Sequences of Proteins of Immunological Interest" ,National Institutes of Health, Bethesda, Md.，1987 和 1991 ； CH0THIA 等人，J. MoL Biol. ,vol. 196，ρ :901-17, 1987 ；CHOTHIA等人，Nature, vol. 342，ρ =878-83,1989)。抗体结合特定抗原的功能性能力取决于每对轻/重链对的可变区，而且主要由CDR确定。这里使用的术语“抗体”指单克隆抗体本身。单克隆抗体可以是人抗体，嵌合抗体和/或人源化抗体。这里使用时，当“多肽序列A包括与B的多肽序列具有至少同源性”时，指多肽 A的氨基酸序列与B的氨基酸序列具有至少的同一性。这里使用的2条氨基酸序列之间的“同一性百分数”，表示最佳比对后获得的，待比较的两条序列之间相同的氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹统计学的，而且两条序列之间的差异是随机分布的而且沿着它们的总长度。可以例如使用网址http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/bl2. htmL上可用的BLAST程序进行两条氨基酸序列之间的序列比较，使用的参数是缺省的那些参数(尤其是参数“开放缺口罚分” :5和“延伸缺口罚分” :2，选择的矩阵是例如程序建议的“BL0SUM 62” 矩阵，待比较的两条序列之间的同一性百分数由程序直接计算)。这里使用的术语“片段”指结合⑶160的抗体片段。例如，能结合⑶160的抗体片段包括Fab (例如，通过木瓜蛋白酶消化)，Fab'(例如，通过胃蛋白酶消化和部分还原)和 F(ab' )2(例如，通过胃蛋白酶消化)，facb (例如，通过纤溶酶消化)，pFc'(例如，通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)，Fd(例如，通过胃蛋白酶消化，部分还原和再聚集)，Fv或scFv (例如，通过分子生物学技术)片段都包括在本发明内。这种片段可通过如本领域已知的和/或这里描述的酶促裂解，合成或重组技术产生。还可以使用抗体基因产生各种截短形式的抗体，抗体基因中已经引入一个或多个终止密码子到天然终止位点的上游。例如，编码F(ab' ) 2重链部分的组合基因可以设计为包括编码重链的CH1区域和/或绞链区的DNA序列。抗体的各个部分可以通过传统技术化学地连接到一起，或者可以使用基因工程技术制备为一个连续的蛋白。表达“能结合CD160”指对CD160的Kd小于10_7M，优选小于10、，更优选小于10_9M。优选地，而不是必要地，重组产生本发明中使用的抗体，因为需要对具有合适的特异性的典型鼠或其他非人抗体进行操作，以把它们转变为人源化形式。抗体可以是或可以不是糖基化的，虽然糖基化抗体是优选的。如公知的，抗体通过二硫键正确地交联。如本领域公知的，通过免疫产生抗体的哺乳动物的标准技术，可以容易地产生具有合适的特异性的单克隆抗体。然后可以对这些核苷酸序列进行操作以提供人源化形式的单克隆抗体。“嵌合抗体”指由来自鼠的免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白的恒定区组成的抗体。这些改变简单地包括以人抗体的恒定区取代鼠的恒定区，从而产生人/鼠的嵌合体， 其具有足够低的免疫原性以适于药学用途。至今已经报道了用于生产这种嵌合抗体的许多方法，从而形成了本领域技术人员的普通知识的部分(参见，例如，美国专利号5，225，539)。在一个优选的实施方案中，所述抗体是嵌合抗体，而且轻链和重链构架序列分别来自于小鼠免疫球蛋白轻链和重链。优选地，本发明的抗体包括a)包含3个轻链互补区(OTR)的轻链，该轻链互补区(OTR)具有与下列i)到iii) 的氨基酸序列具有至少90%，优选95%，更优选98%同源性的氨基酸序列i)轻链 CDRl =QSISNH (SEQ ID NO 1)；ii)轻链 CDR2 :YAS ；iii)轻链 CDR3 =QQSNSffPLT(SEQ ID NO 2)；禾口来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；和b)包含3个重链互补区(OTR)的重链，该重链互补区(OTR)具有与下列i)到iii) 的氨基酸序列具有至少90%，优选95%，更优选98%同源性的氨基酸序列i)重链 CDRl GYTFTDYff (SEQ ID NO 3)；ii)重链 CDR2 :IYPO)DDA(SEQ ID NO 4)；
iii)重链 CDR3 :ARRGIAAVVGGFDY(SEQ ID NO 5)；禾口来自免疫球蛋白重链的重链构架序列。在该优选的实施方案的一个特别的实施方案中，所述抗体包含具有图2中所示的氨基酸序列SEQ ID NO 8的轻链可变区(LCVR)。优选地，所述抗体包含由图2中所示的核酸序列SEQ ID NO 9编码的轻链可变区(LCVR)。有利地，所述抗体包含具有图7a中所示的氨基酸序列SEQ ID NO 18或图7b中所示的氨基酸序列SEQ ID N0:28的轻链可变区(LCVI )。优选地，所述抗体包含由图7a中所示的核酸序列SEQ ID NO 19或图7b中所示的核酸序列SEQ ID NO 29编码的轻链可变区 (LCVR)。在该优选的实施方案的另一个特别的实施方案中，所述抗体包含具有图1中所示的氨基酸序列SEQ ID NO 6的重链可变区(HCVR)。优选地，所述抗体包含由图1中所示的核酸序列SEQ ID NO 7编码的重链可变区(HCVR)。有利地，所述抗体包含具有图8中所示的氨基酸序列SEQ ID NO 20的重链可变区 (HCVR)。优选地，所述抗体包含由图8中所示的核酸序列SEQ ID NO 21编码的重链可变区 (HCVR)。在该优选实施方案的仍然另一个特别的实施方案中，所述抗体进一步包含来自人轻链和重链的恒定区。有利地，所述抗体包含来自选自以下的人重链的恒定区 图3中所示的人Y 1免疫球蛋白的重链的重组恒定区，其包含插入一个另外的半胱氨酸和终止密码子(SEQ ID NO: 10)；·图4中所示的人Y 1免疫球蛋白的重链的重组恒定区(SEQ ID NO 12)；和·图5中所示的人Y 4免疫球蛋白的重链的重组恒定区(SEQ ID NO 14)；还有利地，所述抗体包含来自图6中所示的人κ免疫球蛋白的人轻链的恒定区 (SEQ ID NO 16)。然而，鼠抗体和有时嵌合抗体被人宿主识别为外源的，而引起所谓的“人抗鼠抗体”或“HAMA”应答。术语“人源化抗体”涉及一种抗体，其中小鼠可变序列的一种或多种氨基酸已经被同源的人可变序列的相应的一种或多种氨基酸取代，以在把该抗体施用给人个体以后降低所述小鼠可变序列的免疫原性。通过本领域目前公知的技术进行这种抗体可变区和最终的 ⑶R的人源化制备。至今已经报道了用于生产这种人源化抗体的许多方法，从而形成了本领域技术人员的普通知识的部分。举例来说，英国专利申请GB 2188638々和美国专利号5，585，089公开了生产重组抗体的方法，其中抗体被取代的部分仅仅是互补决定区，或“CDR”。CDR嫁接技术已经用于产生由鼠⑶R和人可变区构架和恒定区组成的抗体(参见，例如，RIECHMANN等人，Nature， vol. 332，ρ :323-327,1988)。这些抗体保留Fc依赖的效应功能所需的人恒定区，但是引起 HAMA应答的可能性小得多。另一个例子，可变区的构架区被对应的人构架区取代，同时保留非人CDR基本上完整，或甚至用来源于人基因组的序列取代⑶R(参见，例如专利申请US 2006/258852)。在遗传修饰的小鼠中生产完全地人抗体，该小鼠的免疫系统已经被改变以符合于人免疫系统。如上所述，应用抗体的免疫特异性片段足以用于本发明的方法中，该抗体的免疫特异性片段包括表示单链形式的片段。人源化抗体也指包含人构架，至少一个来自于非人抗体的⑶R的抗体，其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，也即至少大约85或90%，优选至少95% 相同。因此，人源化抗体的所有部分，可能除了 CDR，与一种或多种天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。例如，人源化免疫球蛋白一般将不包含嵌合的小鼠可变区/人恒定区抗体。用于人类治疗，人源化抗体具有至少3个可能的优于非人和嵌合抗体的优点1)由于效应部分是人，它可以与人免疫系统的其他部分较好的相互作用(例如， 通过互补依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)。2)人免疫系统将不会识别人源化抗体的构架或C区为外源的，因此针对这种注射抗体的抗体应答将小于针对完全外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体的抗体应答。3)已经报道注射的非人抗体在人体循环中的半衰期比人抗体的半衰期要短得多。 注射的人源化抗体的半衰期与天然存在的人抗体基本上相同，其允许提供较少和较不频繁的剂量。举例来说，可以如下设计人源化免疫球蛋白当氨基酸属于下列类别时，待应用的人免疫球蛋白的构架氨基酸(受体免疫球蛋白)被来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的构架氨基酸取代(a)受体免疫球蛋白的人构架区中的氨基酸不是人免疫球蛋白的该位置常见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸是人免疫球蛋白的该位置典型的；(b)氨基酸的该位置紧邻一个CDR;或(c)三维免疫球蛋白模型中构架氨基酸的任何侧链原子都在⑶R氨基酸的任何原子的大约5-6埃(中心到中心)内(QUEEN等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88，ρ :2869,1991)。当受体免疫球蛋白的人构架区中的每个氨基酸与供体免疫球蛋白中的相应氨基酸不是人免疫球蛋白的该位置常见的时，用人免疫球蛋白该位置典型的氨基酸取代该氨基酸。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是人源化抗体，而且轻链和重链构架序列分别来自于人源化免疫球蛋白轻链和重链。本发明的人源化抗体的优选轻链可变区(LCVR)具有与SEQ ID NO 8至少有一个氨基酸不同的氨基酸序列。更优选地，本发明的人源化抗体的轻链可变区(LCVI )具有氨基酸序列SEQ ID NO :25，所述氨基酸序列SEQ ID NO 25与SEQ ID NO 8至少有一个氨基酸不同。该人源化序列对应于抗CD160鼠可变轻链，其中与人免疫球蛋白κ可变轻链(SEQ ID N0:22，登录号AAZ09098)比较后，引入一个或多个氨基酸取代到构架中，以降低可能的免疫原性。本发明的人源化抗体的优选重链可变区(HCVR)具有与SEQ ID NO 6至少有一个氨基酸不同的氨基酸序列。更优选地，本发明的人源化抗体的重链可变区(HCVR)具有氨基酸序列SEQ ID NO :26，所述氨基酸序列SEQ ID NO 26与SEQ ID NO 6至少有一个氨基酸不同。
该人源化序列相应于抗⑶160鼠可变重链，其中与人免疫球蛋白可变重链SEQ ID 而23(登录号3 0^)和SEQ ID NO :24(登录号AAG00910)进行比较以后，引入一个或多个氨基酸取代到构架中，以降低可能的免疫原性。优选地，所述人源化抗体更进一步包含来自人轻链和重链的恒定区。举例来说，所述人源化抗体更进一步包含来自前面所述的人轻链和重链的恒定区。其他的序列可能用于本发明的人源化抗体的轻链和重链。免疫球蛋白可具有两对轻链/重链复合物，至少一条链包含一个或多个与人构架区片段功能性连接的小鼠互补决定区。根据第二个方面，本发明涉及包含至少一种如前所述的抗⑶160抗体或其片段和药学可接受的载体的药物组合物，用于诊断和/或预后和/或治疗。所述组合物尤其可用于抑制血管形成，用于治疗血管形成病理，优选用于抑制肿瘤进展。所述组合物可以有适于施用给患者的任何药学形式，包括但不限于溶液，悬浮液， 冻干粉末，胶囊和片剂。本发明的药物组合物可进一步包含任何药学可接受的稀释剂，赋形剂或助剂。本发明的药物组合物可配制用于注射，例如局部注射，经粘膜施用，吸入，口服给药，和本领域技术人员发现适于获得所需的预后和/或诊断和/或治疗的更普遍的任何制剂。本发明的抗CD160抗体以获得预定目的的有效量，和适于选择的给药途径的剂量包含于所述药物组合物中。更具体地说，治疗有效量指能有效预防、减轻或改善治疗个体的疾病或不适的症状的化合物含量，或抑制所述疾病或不适的化合物含量。根据预定应用，本发明的抗⑶160抗体可进一步包含另外的组分。例如，当本发明的抗CD160抗体预定用于预后或诊断时，它可进一步包含可检测标记，如荧光染料，或具有酶活性或放射性的实体，和能检测所述化合物更普遍的任何实体。做为选择，本发明的抗CD160抗体当然可用于检测抗血管形成位点。因此本发明还涉及包含至少一种本发明的抗⑶160抗体的药物组合物或试剂盒， 其计划用于检测抗血管形成位点。当本发明的抗CD160抗体计划用于治疗性施用给需要其的生物体时，它可进一步包含免疫毒素和/或放射性元素。本发明的第三个方面涉及一种抑制血管形成的方法，包括给需要其的患者提供本文所述的药物组合物，其含有至少一种前面所述的抗CD160抗体或其片段。如这里使用的，术语“患者”指哺乳动物，优选人。优选地，需要其的患者相应于遭受与血管形成过程中涉及的内皮细胞增殖相关的病理的患者。这种病理的一个例子，其可引用癌症(例如肿瘤血管形成)，视网膜病(例如，糖尿病视网膜病)，类风湿性关节炎，慢性移植排斥如角膜或肾，异种移植中观察到的急性移植排斥，血管瘤，血管肉瘤如皮肤多发性出血性(Kaposi)肉瘤或Castelman综合征，动脉粥样硬化，与新生血管形成相关的子宫内膜异位，或由于瘢痕而致的组织过量产生。
本发明的第四个方面涉及至少一种前面所述的抗CD160抗体或其片段用于制备治疗和/或预防与血管形成过程中涉及的内皮细胞增殖相关的病理的药物的用途。这种病理选自癌症(例如肿瘤血管形成)，视网膜病(例如，糖尿病视网膜病)，类风湿性关节炎，慢性移植排斥如角膜或肾，异种移植中观察到的急性移植排斥，血管瘤，血管肉瘤如皮肤多发性出血性肉瘤或Castelman综合征，动脉粥样硬化，与新生血管形成相关的子宫内膜异位，或由于瘢痕而致的组织过量产生。下面的非限制性实施例中举例说明了本发明的其他实施方案和优点。实施例DmAb的牛成和纯化通过用GST与CD-160之间的融合蛋白(SEQ ID NO :27.；登录号CAG46665)免疫 BALB/C 小鼠获得 MAb0 用 GOUTTEFANGEAS 等(Eur. J. Immunol, vol. 22，ρ :2681-5,1992)中描述的NSl进行细胞融合。在两个阶段中进行筛选。间接免疫荧光染色和流式细胞术分析以后，保留与 CD160-GST融合蛋白反应的所有杂交瘤上清液。通过有限稀释两次克隆含有选择的mAb的培养物。2)筛诜血管形成抑制活件在胶原中稀释生长降低的Matrigel (BD BIOSCIENCES) (l/6v/v)，并保持于冰中。 把160 μ 1这种溶液添加到用I型大鼠尾胶原预先涂布的8孔培养物载玻片的每个孔中， 37°C放置1小时。凝胶形成以后，HUVEC悬浮液与对照混合或不混合，FGF-2，sHLA-Gl或杂交瘤上清液植到Matrigel/胶原凝胶上，在湿润的5% CO2孵育箱中37°C保持Mh。如RUGGERI 等中所述的定量血管形成(Cancer Res.，vol. 63(18)，ρ :5978-91, 2003)。简言之，除去培养基，细胞用PBS漂洗两次，并在4% PFA溶液中室温下固定 30min。然后，细胞用PBS洗涤两次，并用Masson' s Trichrom染色剂染色。使用自动化计算机辅助的图象分析系统(Imagenia，Biocom, Les Ulis, France)测定微毛细管网络的程度，并测定每个孔中毛细管的总长度。计算每个实验条件的平均微毛细管网络长度(μπι)。 实验进行一式三份，并重复3次。令人惊讶地，所有的杂交瘤上清液中有一个上清液导致抑制FGF-2介导的小管血管发育，其证明这种特异性上清液的抗体能抑制血管形成。3)克隆具有抗血管形成特性的抗CD160抗体的可变区分离产生抑制血管形成的抗体的特异性杂交瘤。用RNeasy试剂盒(QIAGEN)，根据制造商的说明，从所述杂交瘤的细胞提取总RNA。如CHARDES 等(FEBS letters, vol. 452, ρ :386-94,1999)中所述的 50 μ g 总 RNA, 利用分别来自κ轻链和来自Y可变链的恒定区的特异性引物。然后，用CHARDES等(1999， 上述的)中描述的方案筛选和分离目标免疫球蛋白的可变区。该筛选能鉴定目标免疫球蛋白的轻链和重链可变区(图1和2)。通过在IMGT/V-QUEST 地址(http://imgt.cines.fr/IMGT_yquest/share/ textes/index. html)上与其他的免疫球蛋白进行序列比对，对这些序列进行分析，用于鉴定构架区(FR)和⑶R位置。
图1和2分别呈现了鉴定的可变重链和轻链的⑶R位置。4)人源仆Jl有杭血管形成特件的杭CD160杭体的可夺区为了免疫，鉴定的可变区与所述可变区具有最大同源性的人免疫球蛋白进行序列比对。图9中显示了与小鼠可变轻链SEQ ID NO :8具有最大同源性的人免疫球蛋白(SEQ ID NO22 ；登录号 AAZ09098)。鉴于这种比对，测验多种取代以人源化小鼠可变轻链。测验的取代如下* 位置 17 (SEQ ID No. 8 的)N_ > E ；* 位置 18: S-> R* 位置 19:V->A* 位置 41:H_>G* 位置 53:Q-> N* 位置 80:T-> P* 位置 84:G_>A* 位置 100:A_>G图10和11分别显示了与小鼠可变重链SEQ ID No. 1具有最大同源性的人免疫球蛋白(SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 ；登录号分别为 3FCTB 和 AAG00910)。鉴于这种比对，测验多种取代以人源化小鼠可变重链。测验的取代如下* 位置 3 (SEQ ID No. 6 的)=H- > Q ；* 位置 35:Q-> H* 位置 87:A->T5)构建嵌合抗体如LEUNG 等(Hybridoma, vol. 13 (6)，ρ =469-76,1994)中所述的连接人源化的或非人源化的可变重链和轻链的序列与信号肽和它们各自的人κ和IgGl或IgG4恒定区域。如前面所述的检测这些抗体的抗血管形成活性(Cf. 2)。
权利要求
1.一种能结合CD160的抗体或其片段，所述抗体具有与含有以下的抗体的多肽序列具有至少90%同源性的多肽序列a)包括具有下列氨基酸序列的3个轻链互补区(CDR)的轻链i)轻链CDRl =QSISNH (SEQ ID NO 1)；ii)轻链CDR2 =YAS ；iii)轻链CDR3 =QQSNSffPLT (SEQ ID NO 2)；禾口来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；和b)包括具有下列氨基酸序列的3个重链互补区(CDR)的重链i)重链CDRl =GYTFTDYff (SEQ ID NO 3)；ii)重链CDR2 :IYPO)DDA(SEQ ID NO 4)；iii)重链CDR3 :ARRGIAAWGGFDY(SEQ ID NO 5)；禾口来自免疫球蛋白重链的重链构架序列。
2.如权利要求1的抗体，包含a)包含3个轻链互补区(CDR)的轻链，该轻链互补区(CDR)具有与下列i)到iii)的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列i)轻链CDRl =QSISNH (SEQ ID NO 1)；ii)轻链CDR2 =YAS ；iii)轻链CDR3 =QQSNSffPLT (SEQ ID NO 2)；禾口来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；禾口b)包含3个重链互补区(CDR)的重链，该重链互补区(CDR)具有与下列i)到iii)的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列i)重链CDRl GYTFTDYff (SEQ ID NO 3)；ii)重链CDR2 :IYPO)DDA(SEQ ID NO 4)；iii)重链CDR3 =ARRGIAAVVGGFDY(SEQ ID NO 5)；禾口来自免疫球蛋白重链的重链构架序列。
3.如权利要求1或2的抗体，包含a)包括具有下列氨基酸序列的3个轻链互补区(CDR)的轻链i)轻链CDRl =QSISNH (SEQ ID NO 1)；ii)轻链CDR2 =YAS ；iii)轻链CDR3 =QQSNSffPLT (SEQ ID NO 2)；禾口来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；禾口b)包括具有下列氨基酸序列的3个重链互补区(CDR)的重链i)重链CDRl =GYTFTDYff (SEQ ID NO 3)；ii)重链CDR2 :IYPO)DDA(SEQ ID NO 4)；iii)重链CDR3 :ARRGIAAWGGFDY(SEQ ID NO 5)； 禾口来自免疫球蛋白重链的重链构架序列。
4.如权利要求1到3中任一项的抗体，其中所述抗体或其片段能以Kd小于IO-7M,优选小于1(Γ8Μ结合CD160。
5.如权利要求1到4中任一项的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQID NO 8，优选 SEQ ID NO 18 或 SEQ ID NO 28 的轻链可变区(LCVR)。
6.如权利要求1到5中任一项的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQID NO 6，优选SEQ ID NO 20的重链可变区(HCVR)。
7.如权利要求1到4中任一项的抗体，其中所述抗体包含其氨基酸序列与SEQID NO 8至少有一个氨基酸不同的轻链可变区(LCVR)。
8.如权利要求7的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQID N0:25的轻链可变区(LCVR)。
9.如权利要求1到4或8中任一项的抗体，其中所述抗体包含其氨基酸序列与SEQID NO 6至少有一个氨基酸不同的重链可变区(HCVR)。
10.如权利要求9的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQID NO J6的重链可变区(HCVR)。
11.如权利要求1到10中任一项的抗体，其中所述抗体进一步包含来自人轻链和重链的恒定区。
12.如权利要求11的抗体，其中所述抗体包含a)来自选自以下的人重链的恒定区 具有序列SEQ ID NO 10的人γ 1免疫球蛋白的重链的重组恒定区，其序列包含插入一个另外的半胱氨酸和终止密码子； 具有序列SEQ ID NO 12的人、1免疫球蛋白的重链的重组恒定区；和 具有序列SEQ ID NO 14的人Y 4免疫球蛋白的重链的重组恒定区；和b)来自具有序列SEQID NO 16的人κ免疫球蛋白的人轻链的恒定区。
13.如权利要求12的抗体，其中所述抗体包含具有序列SEQID Ν0:10的人Yl免疫球蛋白的重链的重组恒定区和来自具有序列SEQ ID Ν0:16的人κ免疫球蛋白的人轻链的恒定区。
14.一种包含至少一种权利要求1到13的任一项的抗体和药学可接受的载体的药物组合物。
15.如权利要求1到13中任一项限定的至少一种抗体在制备用于治疗和/或预防与血管形成过程中涉及的内皮细胞增殖相关的病理的药物中的用途。
16.如权利要求15的用途，其中所述病理选自癌症，视网膜病，类风湿性关节炎，慢性移植排斥，异种移植中观察到的急性移植排斥，血管瘤，血管肉瘤，动脉粥样硬化，与新生血管形成相关的子宫内膜异位，和由于瘢痕而致的组织过量产生。
17.如权利要求16的用途，其中所述病理选自视网膜病。
18.如权利要求17的用途，其中所述抗体是如权利要求13中所限定的。
全文摘要
本发明涉及一种能结合CD160的抗体或其片段，所述抗体包含a)包括具有下列氨基酸序列的3个轻链互补区(CDR)的轻链(i)轻链CDR1QSISNH(SEQ ID NO1)；(ii)轻链CDR2YAS；(iii)轻链CDR3QQSNSWPLT(SEQ ID NO2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链构架序列；和b)包括具有下列氨基酸序列的3个重链互补区(CDR)的重链(i)重链CDR1GYTFTDYW(SEQ ID NO3)；(ii)重链CDR2IYPGDDDA(SEQ ID NO4)；(iii)重链CDR3ARRGIAAVVGGFDY(SEQ ID NO5)；和来自免疫球蛋白重链的重链构架序列；包含所述抗体的药物，以及所述抗体用于制备治疗和/或预防与血管形成过程中涉及的内皮细胞增殖相关的病理的药物的用途。
文档编号A61K39/395GK102317318SQ201080005082
公开日2012年1月11日 申请日期2010年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者D·迪迪埃劳瑞特, J·卡道徹, O·肖兹 申请人:单克隆抗体治疗所, 国家健康科学研究所