专利名称：用于治疗呼吸道感染的方法和药物组合物的制作方法
用于治疗呼吸道感染的方法和药物组合物发明领域
本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法和药物组合物。更特别地，本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法中的TLR5激动剂。
发明背景
呼吸道感染是上呼吸道(例如鼻、耳、鼻窦和咽喉)和下呼吸道(例如气管、支气管和肺)的常见感染。上呼吸道感染的症状包括流鼻涕或鼻塞、烦躁、坐立不安、食欲不振、 活动力降低、咳嗽和发烧。
病毒性呼吸道感染引起和/或与喉咙痛、感冒、义膜性喉炎和流感有关。引起上呼吸道和下呼吸道感染的病毒的实例包括鼻病毒和流感病毒A和B。
常见的呼吸道细菌感染引起和/或与例如百日咳和链球菌性喉炎有关。引起上呼吸道和下呼吸道感染的细菌的实例是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。肺炎链球菌(肺炎球菌)在全世界的婴儿和老年人之中引起呼吸道感染。荚膜多糖是主要的毒性因子，并且其组成定义了肺炎球菌的91个血清型。某些血清型无症状地定植代表细菌个体间传播用储库的人鼻咽。在一些个体中，定植可能发展为肺炎球菌肺炎和侵袭性疾病。与此相反，血清型如血清型I虽然几乎与定植无关，但是引起侵袭性感染。
当前呼吸道感染的治疗包括分别施用用于治疗、预防或改善病毒性、细菌性和真菌性呼吸道感染的抗病毒剂、抗细菌剂和抗真菌剂。令人遗憾地，对于某些感染，没有可用的治疗，感染已被证明是难以治疗的，或对受试者施用治疗发生的副作用超过了益处。使用治疗细菌性呼吸道感染的抗菌剂也可能产生副作用或导致耐药菌株。施用抗真菌剂可能引起肾衰竭或骨髓功能障碍，并且可能不能有效对抗免疫系统受抑制的受试者的真菌感染。 另外，微生物(例如病毒、细菌或真菌)引起的感染可能对施用的治疗剂或治疗剂的联合具有耐药性或形成耐药性。事实上，对施用的治疗剂形成耐药性的微生物通常形成多向耐药性或多药耐药性，也就是说，对作用机理不同于该施用药剂的机理的治疗剂的耐药性。因此，由于耐药性，许多感染证明是大量标准治疗方案所难以治疗的。
因此，需要治疗、预防、控制和/或改善呼吸道感染及其症状的新疗法。
激活先天防御对控制肺炎球菌感染是必不可少的。Toll样受体2 (TLR2)、TLR4和 TLR9以及适配器MyD88参与了肺内肺炎球菌的早期检测和清除。包含Nodl和Nod2的胞质受体核苷酸结合寡聚化结构域(Nod)也与肺炎球菌的识别有关。TLR信号转导激活了黏膜的先天应答，所述先天应答使吞噬细胞如多形核中性粒细胞(PMN)和巨噬细胞的募集以及杀微生物剂的产生达到顶点。此过程引发通过吞噬作用以及细胞外杀死而快速消灭该病原体。在MyD88缺失的动物中，肺炎链球菌不能在体内引发任何PMN募集进入气道，增大了动物对肺炎的易感性。最新研究已经强调了人TLR信号转导的作用，表明一些MyD88多态性与 对肺炎球菌感染的易感性增加有关。
通过先天受体的活性调节免疫性是对抗感染引起保护性反应的新兴概念。基本原理是促进在规模、质量和动力上大大超过该病原体本身引起的先天应答的先天应答。已经在若干动物模型中证明了 TLR激动剂治疗传染性疾病的有效性，包括呼吸道感染模型(Brown, K. L. , C. Cosseau, J. L. Gardy and R. E. Hancock 2007. Complexities of targeting innate immunity to treat infection. TrendsTmmunoI 28 :260-266. ；Lembo, A.，M. Pelletier, R.1yer, M. Timko, J. C. Dudda, T. E. West, C. B. Wilson, A. M. Haj jar, and S.J.Skerrett. 2008. Administration of a synthetic TLR4agonist protects mice frompneumonic tularemia. J Tmmunol 180 :7574-7581 ；Romagne, F. 2007. Current and future drugs targeting one class of innate immunityreceptors the Toll-like receptors. Drug Discov Today 12:80-87)。TLR5能检测作为鞭毛主要成分的细菌鞭毛蛋白。包括上皮细胞的各种肺道细胞表达TLR5，但尚未研究TLR5信号通道的调节用于治疗呼吸道感染。
发明简述
本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法和药物组合物。更特别地，本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法中的TLR5激动剂。
发明详述
肺炎链球菌是婴儿肺炎和老年人肺炎的主要原因。先天防御对控制肺炎球菌感染是必不可少的，有缺陷的应答会在易感个体中引发疾病。在这里，本发明人表明，鞭毛蛋白能够局部激活先天免疫，由此增强对急性肺炎的抵抗力。鞭毛蛋白黏膜治疗提高了肺内肺炎链球菌的清除率并促进了对感染增加的存活率。此外，处理感染小鼠之后，肺结构完全修复，表明鞭毛蛋白能重建稳定状态。使用不能通过TLR5发信号的鞭毛蛋白突变体， 他们证实TLR5信号转导对保护是必不可少的。在呼吸道中，鞭毛蛋白诱导中性粒细胞浸润进入气道，并上调编码IL-6、TNF-a、CXCLl、CXCL2和CCL20的基因的表达。使用消耗性抗体，他们证明中性粒细胞是用于保护的主要效应器。此外，他们发现B和T细胞缺失的SCID小鼠清除肺炎链球菌攻击达到与具有免疫能力的动物相同的程度，这表明鞭毛蛋白诱导的保护并不需要这些细胞群。总之，该结果强调，通过不被肺炎链球菌天然接合的 TLR的先天免疫性黏膜刺激能够增强治愈肺炎球菌肺炎的效力。此外，不愿受任何特定理论的约束，本发明人相信通过TLR5的先天免疫性黏膜刺激还提供了治疗呼吸道感染的相应方法。例如,微生物产物如已知通过呼吸道刺激先天免疫性的不可分型的流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)溶解产物，能够防范各种呼吸道感染(Evans SE, Scott BL, Clement CG, Larson DT, Kontoyiannis D, Lewis RE, Lasala PR, Pawlik J, PetersonJff, Chopra AK,Klimpel G, Bowden G, HookM, Xu Y, Tuvim MJ,Dickey BF. Stimulated innate resistance of lung epithelium protectsmice broadly against bacteria and fung1. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010 ；42 :40-50),包括肺炎链球菌感染(Clement CG, Evans SE, Evans CM, Hawke D, Kobayashi R, Reynolds PR, Moghaddam SJ, Scott BL, Melicoff E, Adachi R, Dickey BF, Tuvim MJ. Stimulation oflung innate immunity protects against lethal pneumococcal pneumoniain mice. Am J Respir Crit Care Med. 2008 ； 177 :1322-30.)。这种呼吸道感染包括由细菌、病毒和真菌引起的疾病。
因此，本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法中的TLR5激动剂。
术语“呼吸道感染”具有其在本领域中的一般含义，用来指由活微生物引起的上呼吸道(例如鼻、耳、鼻窦和咽喉)和下呼吸道(例如气管、支气管和肺)感染。
引起病毒感染的病毒的实例包括，但不限于，逆转录病毒(例如，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV) I和II型和人免疫缺陷病毒(HIV))，疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV) I和 II型、Epstein-Barr病毒、HHV6-HHV8和巨细胞病毒)，沙粒病毒(例如拉沙热病毒)，副粘病毒(例如麻疹病毒属病毒、人呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、hMPV和肺炎病毒)， 腺病毒，布尼亚病毒(例如汉坦病毒)，冠状病毒(comaviruses),丝状病毒(例如伊波拉病毒)，黄病毒(例如，丙肝病毒(HCV)、黄热病毒和日本脑炎病毒)，肝炎病毒(例如乙肝病毒(HBV))，正粘病毒(例如，流感病毒A、B和C和PIV)，乳多空病毒(例如乳头瘤病毒)， 细小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠道病毒和甲肝病毒)，痘病毒，呼肠孤病毒(例如轮状病毒)，囊膜病毒(例如风疹病毒)，和棒状病毒(例如狂犬病病毒)。
引起细菌性呼吸道感染的细菌的实例包括，但不限于水螺菌科、固氮螺菌科、固氮菌科、类杆菌科、巴尔通体种、蛭弧菌科、弯曲杆菌种、衣原体种(例如，衣原体肺炎链球菌)、梭状芽胞杆菌、肠杆菌科(例如柠檬酸细菌种、爱德华氏菌、产气肠杆菌、欧文氏菌种、 大肠杆菌、哈夫尼菌种、克雷伯氏杆菌种、摩根氏菌种、普通变形杆菌、普罗维登斯菌、沙门氏菌种、粘质沙雷氏杆菌和弗累克斯讷氏杆菌)，Gardinella科、流感嗜血杆菌、盐杆菌科、 螺杆菌科、Legionallaceae科、李斯特菌种、甲基球菌科、分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌)、奈瑟氏球菌科、海洋螺菌科、巴斯德氏菌科、肺炎球菌种、假单胞菌种、根瘤菌科、螺旋菌科、无毛螺旋体科、葡萄球菌属(例如，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和化脓性葡萄球菌 (Staphylococcus pyrogenes))、链球菌属(例如，肠炎链球菌、粪链球菌(Streptococcus Fasciae)和肺炎链球菌)、VampirovibrHelicobacter科和蝙幅弧菌科。
引起真菌感染的真菌的实例包括，但不限于犁头霉种(例如，伞枝犁头霉和分枝犁头霉)、曲霉种(例如，黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉)、皮炎芽生菌、假丝酵母种(例如，白色假丝酵母、Candida glabrala、Candida kerr、克鲁斯假丝酵母、近平滑假丝酵母、伪热带假丝酵母、Candida quillermondi1、皱裙假丝酵母、类星形假丝酵母和热带假丝酵母)、粗球孢子菌、耳霉种、新生隐球菌、小坎宁安霉种、荚膜组织胞浆菌、微小毛霉、 巴西副球孢子菌、波氏假阿利什菌、肺炎肺囊虫、根霉种(例如，少根根霉、米根霉和小孢根霉)、糖酵母种和申克孢子丝菌。
在一个特定实施方式中，根据本发明的呼吸道感染是细菌性呼吸道感染，更特别是由没有鞭毛的细菌引起的呼吸道感染。通常，没有鞭毛和弓I起呼吸道感染的细菌包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌或肺炎支原体。甚至更优选地，根据本发明的呼吸道感染是肺炎球菌感染。
在此使用的术语“Toll样受体5”或“TLR5”具有其在本领域中的一般含义，用来指任何物种的Toll样受体5，但是优选人Toll样受体。当激活时，TLR5通过转导胞内信号引起细胞应答，所述信号通过一系列从细胞表面到细胞核的信号分子传送。通常，TLR5的胞内结构域募集适配器蛋白，MyD88，其募集丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK(IRAK-1和IRAK-4)。IRAK 形成具有TRAF6的复合物，其然后与参与转导TLR信号的各种分子相互作用。这些分子及其他TLR5信号转导途径组分刺激转录因子的活性，所述转录因子例如fos、jun和NF_kB， 以及fos、jun和NF-kB调节基因的相应基因诱导产物，例如IL_6、TNF_a、CXCLl、CXCL2和 CCL20。
在此使用的术语“TLR5激动剂”是指通过TLR5选择性激活或增加正常信号转导的化合物(天然的或非天然的)。TLR5激动剂能够通过TLR5间接地激活或增加正常信号转导，例如通过修饰或改变TLR5或TLR5配体的天然构象。介导TLR5信号的信号转导分子以及由于TLR5激活生成的分子的活性是可观察或测量的TLR5活性。因此，TLR5活性包括胞内信号转导分子的募集以及由TLR5激活引起的下游事件，例如转录因子的激活和免疫调节分子的生成。TLR5细胞应答介导受试者的先天免疫系统应答，因为TLR5表达细胞释放的细胞因子调节受试者的其它免疫系统细胞以促进免疫应答。因此，在此使用的术语“TLR5 介导的应答”是用来指TLR5激动剂诱导TLR5介导的细胞应答的能力。示例性的TLR5介导的细胞应答包括受试者的转录因子例如fos、jun和NF-kB的激活，细胞因子和趋化因子例如IL-6、TNF- a、CXCLl、CXCL2和CCL20的产生，和免疫应答的刺激。
在一个实施方式中，根据本发明的TLR5激动剂是低分子量激动剂，例如有机小分子。术语“有机小分子”是指大小可与通常用于药物的那些有机分子相比较的分子。该术语排除了生物大分子(例如蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的尺寸范围不超过约 5000Da，更优选不超过2000Da，和最优选不超过约lOOODa。
或者，根据本发明的TLR5激动剂可以是抗体(该术语包括“抗体片段”)。特别地， 该TLR5激动剂可以是针对TLR5的抗体，通过这样的方式所述抗体激活该受体。
可以根据已知方法通过将合适的抗原或表位施用于选自例如猪、牛、马、兔、山羊、 绵羊和小鼠的寄主动物来产生抗体。各种本领域已知的助剂可用于增强抗体产生。虽然可用于实施本发明的抗体可以是多克隆的，但是优选单克隆抗体。可以使用能够在培养中通过连续细胞系产生抗体分子的任何技术制备和分离单克隆抗体。生产和分离的技术包括， 但不限于杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术。或者，描述为生产单链抗体的技术(参见，例如美国专利第4，946，778号)可适合于生产抗TLR5单链抗体。
对实施本发明有用的TLR5激动剂还包括抗TLR5抗体片段，其包括但不限于，可由完整抗体分子的胃蛋白酶消化生成的F(ab' ) 2片段，和可通过还原该F (ab' )2片段的二硫键生成的Fab片段。或者，可以构建Fab和/或scFv表达文库以能够快速识别具有针对 TLR5的期望特异性的片段。
人源化抗体及其抗体片段也可以根据已知的技术来制备。“人源化抗体”是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的非人(例如啮齿动物)嵌合抗体形式。就绝大部分而言， 人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)其中来自该受体的高变区(CDR)的残基被来自例如具有期望特异性、亲合性和接受力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的高变区的残基取代。在某些情况下，该人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人类的残基取代。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，该人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，典型地两个可变区，其中，所有或基本上所有对应于非人免疫球蛋白的那些的高变环，以及所有或基本上所有FR，是人免疫球蛋白序列的那些。该人源化抗体任选还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。制备人源化抗体的方法在例如，Winter (美国专利第5，225，539号)和Boss (Celltech，美国专利第4，816，397 号)中描述。
然后，在产生如上描述的抗体之后，本领域技术人员能够容易地选择出是TLR5激动剂的抗体。
在另一实施方式中，该TLR5激动剂是适体。适体是在分子识别方面代表抗体替换物的一类分子。适体是有能力识别几乎任何种类的高亲合性和特异性的靶分子的低聚核苷酸或低聚肽序列。如Tuerk C.和Gold L.，1990所描述，这种配体可以通过随机序列文库的指数级富集的配体系统进化(SELEX)分离。该随机序列文库可通过DNA的组合化学合成获得。在这个文库中，每个成员都是最终化学修饰的单一序列的线形低聚物。Jayasena S. D.，1999中已经综述了该类分子的可能的修饰、用途和优点。肽适体由通过支架蛋白例如大肠杆菌硫氧还蛋白A展示的构象约束的抗体可变区组成，所述肽适体通过两种混合方法从组合文库中挑选出来。
然后，在如上描述产生针对TLR5的适体之后，本领域技术人员能够容易地选择出是TLR5激动剂的那些适体。
在另一特定实施方式中，根据本发明的TLR5激动剂是多肽，以及更特别是鞭毛蛋白多肽。
在此使用的术语“鞭毛蛋白”是用来指各种革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌菌种中所包含的鞭毛蛋白。鞭毛蛋白的非限制性来源包括，但不限于埃希杆菌属(Escherichia) 例如大肠杆菌(E. coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus);沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门菌 (Salmonella enterica serovar Typhimurium);沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans);志贺氏菌属(Shigella);以及芽胞杆菌属(Bacilli)例如枯草芽抱杆菌(B. subtilis)和地衣芽抱杆菌(B.1icheniformis);假单胞菌属(Pseudomonas) 例如绿脓杆菌(P. aeruginosa);和链霉菌属(Streptomyces)。这些实例是说明性的而不是限制性的。鞭毛蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列可公开地在NCBI基因库中获得，参见例如登录号 AAL20871、NP_310689、BAB58984、AA085383、AAA27090、NP_461698、AAK58560、 ΥΡ_001217666、YP_002151351、ΥΡ_001250079、AAA99807、CAL35450、AAN74969 和 BAC44986。 来自这些及其他菌种的鞭毛蛋白序列被在此使用的术语鞭毛蛋白所包括。因此，菌种之间的序列差异包括在该术语的含义中。
术语“鞭毛蛋白多肽”是用来指保留结合并激活TLR5的能力的鞭毛蛋白或其片段。典型地，根据本发明的鞭毛蛋白多肽包含涉及TLR5信号转导的鞭毛蛋白结构域。术语“鞭毛蛋白结构域”包括天然存在的鞭毛蛋白结构域和其功能保守的变体。“功能保守的变体”是其中在蛋白或酶中指定的氨基酸残基在不改变该多肽的整个构象和功能的情况下就已经发生变化的那些变体，包括但不限于，用具有类似性质(例如，极性、氢结合电位、 酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸置换氨基酸。在蛋白中，除指定为保守的那些氨基酸以外的氨基酸可以不同，因此任意两个类似功能的蛋白之间的蛋白或氨基酸序列相似性百分比可以不同，可以是例如70%至99%，其根据校准方案例如通过聚类方法测定，其中相似性基于MEGALIGN算法。“功能保守的变体”还包括具有通过BLAST或FASTA算法测定的至少60%氨基酸一致性的多肽，优选至少75%，最优选至少85%，并且甚至更优选至少90%，且所述多肽具有与和其比较的天然蛋白或母蛋白相同或基本上类似的性质或功能。涉及TLR5信号转导的鞭毛蛋白的结构域是本领域公知的，参见例如Smith等(2003) Nat.1mmunol. 4 :1247-1253(例如，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白或其同源物或修饰形式的氨基酸 78-129、135-173 和 394-444)。
鞭毛蛋白多肽的实例包括但不限于，美国专利第6，585，980 ;6，130，082 ；5，888，810 ;5，618，533 ;和 4，886，748 号;美国专利公开号 US 2003/0044429A1 ;以及国际专利申请公开WO 2008097016和WO 2009156405所描述的那些，其通过引用的方式引入。
示例性的大肠杆菌O 157 :H7鞭毛蛋白是SEQD ID NO :1。示例性的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白是 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 3具有至少约90%，至少约95%，至少约97%，至少约98%或至少约99% —致性的氨基酸序列可被用作根据本发明的鞭毛蛋白多肽。
在另一特定实施方式中，本发明包括使用国际专利申请W02009156405中描述的鞭毛蛋白重组蛋白，其全部内容通过引用的方式引入。因此，本发明的鞭毛蛋白多肽可以包含a)具有与该氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的N-末端肽，所述氨基酸序列始于位于SEQ ID NO 3的位置I的氨基酸残基，并终止于选自位于SEQ ID NO 3的位置99至173 的任一个氨基酸残基的氨基酸残基；和b)具有与该氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的 C-末端肽，所述氨基酸序列始于选自位于SEQ ID NO 3的位置401至406的任一个氨基酸残基的氨基酸残基，并终止于位于SEQ ID NO :3的位置494的氨基酸残基，其中所述N-末端肽直接连接到所述C-末端肽，或所述N-末端肽与所述C-末端肽通过间隔链一个与另一个间接连接。在另一特定实施方式中，所述N-末端肽·选自SEQ IDNO 3的氨基酸序列1_99、 1-137、1-160和1-173。在另一实施方式中，所述C-末端肽选自SEQ ID NO :3的氨基酸序列401-494和406-494。在另一实施方式中，所述N-末端和C-末端肽分别由SEQID NO 3 的氨基酸序列1-173和401-494组成。在另一实施方式中，所述N-末端和C-末端肽分别由SEQ ID NO 3的氨基酸序列1-160和406-494组成。在另一实施方式中，所述N-末端和C-末端肽分别由SEQ ID NO 3的氨基酸序列1_137和406-494组成。在另一实施方式中，所述N-末端肽和所述C-末端肽通过由NH2-GIy-AIa-AIa-GIy-C00H(SEQ ID NO 4)肽序列组成的中间间隔链一个与另一个间接连接。在另一实施方式中，位于SEQ IDNO 3的位置488的天冬酰胺氨基酸残基被丝氨酸取代。在另一实施方式中，如上描述的鞭毛蛋白多肽包含在N-末端的额外的蛋氨酸残基。
根据本发明的鞭毛蛋白多肽可以通过已转染核酸的重组细胞重组生成，所述核酸编码该鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列，并能使其在该转染细胞内有效生成。
编码本发明的鞭毛蛋白多肽的核酸序列可以被插入到用于克隆(DNA扩增)或用于表达的可复制载体中。各种载体可公开地获得。例如，该载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。合适的核酸序列可以通过各种方法插入到该载体中。通常，利用本领域已知的技术将DNA插入到合适的限制性内切酶位点。
载体组分通常包括，但不限于，一条或多条信号序列(如果该序列是待分泌的)、 复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。使用本领域技术人员已知的标准化连接技术构建包含一种或多种这些组分的适合载体。
本发明的鞭毛蛋白多肽不但可直接重组生成，而且可用异源多肽来生成融合多肽，其可以是信号序列或在成熟蛋白质或肽的N-末端具有特异性切割位点的其它多肽。通常，该信号序列可以是该载体的组分，或其可以是编码被插入到该载体中的目标多肽的DNA 的一部分。该信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、IPP或热稳定的肠毒素Il前导的原核信号序列。用于酵母分泌的信号序列可以是，例如，酵母转化酶前导、α因子前导 (包括糖酵母属和克鲁维酵母属α因子前导，后者在美国专利第5，010，182号中描述)、或酸性磷酸酶前导、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导、或WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可用来直接分泌蛋白质，例如来自相同或相关物种的分泌多肽，以及病毒分泌前导的信号序列。
表达和克隆载体均包含能启动该载体在一个或多个选择的寄主细胞中复制的核酸序列。对于各种细菌、酵母和病毒，这种序列是大家熟知的。来自质粒PBR322的复制起点适合于大部分革兰氏阴性细菌，2. mu.质粒起点适合于酵母，各种病毒(SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)起点适用于在哺乳动物细胞中克隆载体。
表达和克隆载体将典型地包含选择基因，也称为可选择的标记。典型的选择基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的耐药性，(b)补足营养缺陷型的缺失，或(C)供给不能从复合培养基获得的关键营养，例如编码用于芽胞杆菌属的D-丙氨酸消旋酶的基因。
适合用于哺乳动物细胞的可选择的标记的实例是能识别有能力接受编码本发明鞭毛蛋白多肽的核酸的细胞的那些，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，合适的寄主细胞是缺乏DHFR活性的CHO细胞系，其制备和增殖如Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 77 =4216(1980)所描述的那样。适合在酵母中使用的选择基因是存在于酵母质粒 YRp7 中的 trp I 基因。Stinchcomb 等，Nature, 282 :39(1979) ；Kingsman 等，Gene, 7 141(1979) ；Tschemper et al, Gene, 10 :157 (1980)。该 trp I 基因为在色氛酸中缺乏生长能力的酵母突变株提供筛选标记，例如，ATCC No. 44076或PEP4-1. Jones, Genetics, 85 12(1977)。
表达和克隆载体通常包含启动子，所述启动子可操作连接编码该鞭毛蛋白多肽的核酸序列以控制mRNA的合成。通过各种潜在寄主细胞识别的启动子是众所周知的。适合与原核寄主一起使用的启动子包括β_内酰胺酶和乳糖启动子体系(Chang等，Nature, 275 615(1978) ；Goeddel 等，Nature, 281 :544 (1979)),碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子体系 (Goeddel，Nucleic Acids Res. ,8 :4057(1980) ；EP 36，776)，和杂合启动子例如 tac 启动子(deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA，80 :21-25 (1983))。在细菌体系中使用的启动子也将包含可操作连接到编码本发明鞭毛蛋白多肽的DNA的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。
与酵母寄主一起使用的适合的促进序列的实例包括用于3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子(Hitzeman等，J. Biol. Chem.，255 :2073 (1980))，或用于其它糖解酶的启动子(Hess 等，J. Adv. Enzyme Reg. ,7 :149(1968) ；Holland, Biochemistry, 17 :4900 (1978)),所述其它糖解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。
其它酵母启动子是具有通过生长条件控制转录的额外优势的诱导型启动子，是用于乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达的适合载体和启动子进一步描述于EP 73，657。来自哺乳动物寄主细胞的载体的目标核酸转录例如由从病毒基因组中获得的启动子来控制，所述病毒例如多形瘤病毒、禽痘病毒(在1989年7 月5日公开的UK2, 211，504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40);由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子控制；以及由热激启动子控制，只要这种启动子适合于该寄主细胞体系。
可以通过将增强子序列插入该载体来增加通过高级真核生物的编码本发明鞭毛蛋白多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10到300bp，其作用于启动子以增加它的转录。许多增强子序列目前已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、 白蛋白、α-胎蛋白以及胰岛素)。然而，典型地，将使用一个来自真核细胞病毒的增强子。 实例包括在该复制起点(bpl00-270)的最近侧面上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子的增强子、在该复制起点的最近侧面上的多形瘤增强子和腺病毒增强子。所述增强子可以在编码目标多肽的序列的位置5'或3'上拼接到该载体上，但是优选位于该启动子的位点5'。
用于真核生物寄主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞有机体的有核细胞)的表达载体也将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常可以从真核生物或病毒的DNA或cDNA的5'非翻译区和有时候3'非翻译区中获得。这些区域包含转录为编码本发明鞭毛蛋白多肽的mRNA的非翻译部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
此外，在重组脊椎动物细胞培养中适合于适应本发明鞭毛蛋白多肽的合成的其它方法、载体和寄主细胞在 Gething 等,Nature, 293 :620-625(1981) ;Mantei 等，Nature, 281 40-46(1979) ；EP 117，060 和 EP 117，058 中描述。
寄主细胞的选择和转化。用在此描述的表达或克隆载体转染或转化寄主细胞，以生成鞭毛蛋白多肽，并在视情况而定修饰的常规培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。
本领域技术人员不需要过度实验就能选择培养条件，例如培养基、温度、pH 等。通常，最大化细胞培养生产能力的原理、方案和实用技术可在Ma_alian Cell Biotechnology A PracticalApproach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)中找到。
转染方法是本领域普通技术人员已知的，例如CaP04处理和电穿孔。取决于使用的寄主细胞，使用适合于这种细胞的标准技术进行转化。如上述Samtoook等所描述， 使用氯化钙的钙处理或电穿孔通常用于原核生物或包含真正细胞壁屏障的其它细胞。对于没有这种细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham and van der Eb, Virology, 52 456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞寄主体系转化的一般特性在美国专利第 4，399，216号中描述。转化为酵母典型地根据Van Solingen等，J. Bact, 130 =946(1977) 和 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. (USA)，76 :3829 (1979)的方法来进行。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其它方法，例如通过核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞融合、或聚阳离子例如聚凝胺或聚鸟氨酸。关于转化哺乳动物细胞的各种技术参见Keown等， Methods in Enzymology, 185 :527-537 (1990)和 Mansour 等，Nature, 336 :348-352 (1988)。
在这里，用于在该载体中克隆或表达DNA的适合寄主细胞包括原核生物、酵母、或高级真核生物细胞。
适合的原核生物包括，但不限于，真细菌诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，肠杆菌科诸如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是可公开获得的，例如大肠杆菌K12菌株 MM294(ATCC31, 446);大肠杆菌 X1776 (ATCC 31,537);大肠杆菌菌株 W3110 (ATCC 27,325)；和K5772(ATCC 53，635)。其它适合的原核寄主细胞包括肠杆菌科诸如，埃希杆菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属；沙门氏菌属例如鼠伤寒沙门氏菌；沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌；志贺氏菌属；以及芽胞杆菌属例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如，在1989年4月12日公开的DD 266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P)； 假单胞菌属例如绿脓杆菌和链霉菌属。这些实例是说明性的而不是限制性的。
鼠伤寒沙门氏菌(fliC fljB)的菌株SIN41用于生产本发明的鞭毛蛋白多肽是特别有意思的，因为这些原核寄主细胞不分泌任何鞭毛蛋白(Proc Natl Acad Sci U SA.2001 ；98 =13722-7)。然而，鞭毛蛋白是通过专门的分泌体系——所谓的“III型分泌体系”分泌的。有趣地是，菌株SIN41产生最佳鞭毛蛋白分泌所需要的III型分泌体系的所有组分。根据fliC启动子编码新鞭毛蛋白肽的克隆序列能实现在菌株SIN41中分泌大量目标鞭毛蛋白多肽。
菌株W3110也是有趣的，因为它是用于重组DNA产物发酵的常见寄主菌株。优选地，该寄主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以在编码寄主内源性蛋白质的基因中引起遗传突变，这种寄主的实例公开在发布于1990年8月7日的美国专利第4，946，783号中，包括具有完全基因型tonA的大肠杆菌W3110菌株1A2 ;具有完全基因型tonA ptr3的大肠杆菌W3110菌株9E4 ;具有完全基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac) 169 degPompT kan. sup. r 的大肠杆菌 W3110 菌株 27C7 (ATCC 55,244);具有完全基因型 tona ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169degP ompT rbs7ilvG kan. sup. r 的大肠杆菌W3110菌株37D6 ;大肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素耐药性degP缺失突变的菌株37D6 ;和具有突变体周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。大肠杆菌菌株MG1655、MG1655 AfimA-H或MKS12、fliD-和-f/m > A-/-/-缺失的MG1655菌株也是生产重组鞭毛蛋白作为分泌蛋白质的重要候选者(Nat Biotechnol. 2005 ； (4) :475-81)。或者，体外克隆法例如 PCR或其它核酸聚合酶反应，是适合的。
除原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是用作编码根据本发明鞭毛蛋白多肽的载体的适合克隆或表达寄主。酿酒酵母是常用的低级真核寄主微生物。
其它包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe,Beachand Nurse,Nature, 290 140[1981];公开在1985年5月2日的EP139，383);克鲁维酵母属寄主(美国专利第 4，943，529 号；Fleer 等，Bio/Technology, 9 :968-975 (1991))例如乳酸克鲁维酵母(K. lactis, MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等，J.Bacterid.，737[1983])， 脆壁克鲁维酵母(K. fragilis, ATCC 12，424),保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus, ATCC 16，045)，威克克鲁维酵母(K. wickeramii, ATCC 24，178)，克鲁雄酵母(K. waltii, ATCC56, 500)，果妮克鲁维酵母(K. drosophilarum, ATCC 36, 906 ;Vanden Berg 等，Bio/ Technology, 8 :135 (1990))，耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K. marxianus);亚罗酵母属(yarrowia, EP 402,226);巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris, EP 183, 070 ；Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol. ,28 :265-278[1988])； 假丝酵母属；里氏木霉(Trichoderma reesia, EP 244,234);粗糖链抱菌(Neurospora crassa, Case 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 76 :5259-5263 [1979]);许旺酵母属例如许旺酵母(Schwanniomycesoccidenta lis,公开于 1990 年 10 月 31 日的 EP 394,538);和丝状真菌例如脉孢菌、青霉菌、弯颈霉属(公开在1991年I月10日的WO 91/00357)，和曲霉属寄主例如构巢曲霉(A. nidulans, ballance 等,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112 =284-289[1983] ；Tilburn 等，Gene，26 :205-221 [1983] ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,81 :1470_1474[1984])和黑曲霉(A. niger, Kelly and Hynes, EMBOJ.，4 475_479[1985])。在这里，甲醇酵母(Methylotropic yeasts)是适合的，其包括但不限于，能够在甲醇上培养的酵母，所述酵母选自汉逊酵母属、假丝酵母属、克勒克酵母属、毕赤氏酵母属、糖酵母属、球拟酵母属和红酵母属组成的属。用于编码本发明鞭毛蛋白多肽的核酸表达的适合寄主细胞来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞例如果蝇S2和夜蛾属Sf9，以及植物细胞。有用的哺乳动物寄主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的实例包括通过SV40转化的猴肾CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚胎肾脏系(在悬浮液培养物中生长的亚克隆293或293细胞，Graham等， J. Gen. Virol. ,36 :59(1977));中国仓鼠卵巢细胞/_DHFR(CH0，Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 77 :4216 (1980));小鼠支持细胞(TM4, Mather, Biol. Reprod.，23 243-251(1980));人肺细胞(ff138,ATCC CCL75);人肝细胞(Hep G2，HB 8065);小鼠乳房肿瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)。合适寄主细胞的选择被认为在本领域技术人员的掌握范围内。
本发明的鞭毛蛋白多肽可以从培养基或寄主细胞溶解产物回收。如果是膜结合的，它可以利用适合的洗涤剂溶液(例如，TRIT0N-XTM. 100)或通过酶裂解从该膜中释放出来。
可以通过各种物理或化学方法例如冻融循环、超声处理、机械破坏或细胞溶解剂， 破坏用于编码本发明鞭毛蛋白多肽的核酸表达中所使用的细胞。从重组细胞蛋白质或多肽中纯化目标多肽是所期望的。以下方法是示例性的适合的纯化方法通过在离子交换柱上的分馏；乙醇沉淀法；反相HPLC ;在二氧化硅上或在阳离子交换树脂例如DEAE上的色谱法；层析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸铵沉淀法；利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤法；蛋白质A 琼脂糖凝胶柱以去除污染物例如IgG ;和金属螯合层析柱以结合本发明鞭毛蛋白多肽的表位标记形式。
可以使用各种蛋白质纯化方法，这种方法是本领域已知的，例如在D eut s cher， Methods in Enzymology,182(1990) ;Scopes, ProteinPurification !Principles and Practice (Springer-Verlag New York, 1982)中描述。该选择的纯化步骤将取决于，例如， 使用的生产工艺的性质和生成的特定鞭毛蛋白多肽。
在一个优选实施方式中，该鞭毛蛋白多肽由重组鼠伤寒沙门菌SIN41(fliC fljB)的上清液纯化，如 Nempont 等(Nempont, C. C. , D. ；Rumbo, M. ；Bompard, C.； Villeret, V. ；Sirard, J. C. 2008. Deletionof flagellin ' s hypervariable region abrogates antibody-mediatedneutralization and systemic activation of TLR5_dependent immunity. JTmmunoI 181:2036-2043.)中所公开的。具体地，沙门氏菌属在Luria-Bertani (LB)肉汤中在37°C和搅拌下培养6_18小时。过滤该上清液，用60%硫酸铵(Sigma Aldrich, USA)饱和。通过离心、在20mM的pH为7. 5 的Tris/HCl中溶解来回收该沉淀物，然后透析。该蛋白质通过羟磷灰石、阴离子交换和尺寸排阻色谱法(Bio-Rad Laboratories, USA ；GE Healthcare, Sweden)的依次循环进一步纯化。最后，利用多粘菌素B柱(Pierce,USA)的脂多糖(LPS)耗尽该蛋白质。利用Limulus试验(Associates ofCape CodInc.，USA)，测得该残留LPS浓度小于30pg LPS每微克重组鞭毛蛋白。
在另一个实施方式中，根据本发明的鞭毛蛋白多肽可以通过在免疫亲和层析基质上的分离来纯化。
所述免疫亲和层析基质包含已经固定在其上的抗鞭毛蛋白抗体。使用“抗鞭毛蛋白”抗体，其在这里意味着结合天然鞭毛蛋白或结合去除高变区的鞭毛蛋白的抗体，包括本发明所包含的那些。
优选地，该抗鞭毛蛋白抗体由单克隆抗体组成，包括小鼠抗鞭毛蛋白抗体。
在某些实施方式中，本发明的多肽可以通过化学肽合成的常规方法来合成。
例如，本发明的鞭毛蛋白多肽序列可以通过使用固相技术的直接肽合成来生成。
体外蛋白质合成可以使用人工技术或通过自动化来进行。例如，自动化合成可以采用应用生物系统的肽合成仪(AppliedBiosystems Peptide Synthesizer) (Foster City, Calif.)根据厂家的说明书来实现。
目标多肽的各个部分可以单独以化学方法合成，再结合利用化学方法或酶法以生成目标全长肽。
本发明还涉及用于治疗呼吸道感染的方法、包含根据本发明的TLR5激动剂的药物组合物。
通常，根据本发明的TLR5激动剂可以与药学上可接受的赋形剂，和任选的缓释基质例如可生物降解的聚合物相混合，以形成治疗组合物。“药学上”或“药学上可接受的”是指当施用于哺乳动物特别是人时，不产生不利的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊材料或任何类型的制剂辅剂。
本发明的药物组合物配制成与其预定给药途径兼容。给药途径的实例包括，但不限于，胃肠外例如静脉内、皮内、皮下、口服、鼻内(例如吸入)、透皮(例如局部)、跨黏膜和直肠给药。在一个具体实施方式
中，根据常规程序，将该组合物配制成适合于静脉内、皮下、 肌内、口服、鼻内的或局部给药于人的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是无菌等渗水缓冲液形式的溶液。必要时，该组合物还可以包括增溶剂和在注射位点缓解疼痛的局部麻醉剂。
优选地，本发明的药物组合物是局部施用的(即在受试者的呼吸道中)。因此， 该组合物可以配制成膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂的形式，或本领域技术人员熟知的其它形式。对于不可喷雾的局部剂型，一般使用包含载体或一种或多种赋形剂的粘性至半固体或固体形式，所述赋形剂与局部施用兼容，并且具有优选大于水的动力粘度。适合的制剂包括，但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏剂、膏剂、粉剂、 擦剂、油膏剂等，如果需要，所述制剂是无菌的或与影响不同性质例如渗透压力的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其它适合的局部剂型包括可喷射气雾剂制剂，其中将活性成分(优选与固体或液体惰性载体混合)封装在含有加压挥发物(例如，气体推进剂如氟利昂)的混合物中，或封装在压挤瓶中。如果需要，保湿剂或湿润剂也可以加入到药物组合物和剂型中。这种其他成分的实例是本领域熟知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内给药，该组合物可以配制成气雾剂形式、喷雾剂、雾剂或滴剂形式。特别是，根据本发明使用的 预防剂或治疗剂可使用适合的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合气体)，方便地以加压包装或喷雾器呈现的气雾喷雾形式递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门来递送计量的量来确定剂量单位。用在吸入器或吹药器中的胶囊和盒剂(由例如明胶组成的)可以配制成包含该化合物和合适粉状基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明的方法可以包含用雾化剂配制的肺给药组合物，例如，通过利用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号 6，019，968,5, 985，320,5, 985，309,5, 934，272,5, 874，064、 5, 855, 913,5, 290, 540 和 4,880,078;以及 PCT 公开 WO 92/19244、WO 97/32572、 W097/44013、WO 98/31346和WO 99/66903 ;其每个以它们整体通过引用的方式合并于此。在一个具体实施方式
中，本发明的药物组合物使用Alkermes AIR 肺药物递送技术 (Alkermes, Inc. , Cambridge, Mass.)施用。
因此，本发明提供预防、治疗、控制或改善呼吸道感染或一种或多种其症状的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的TLR5激动剂。
根据本发明，术语待治疗的“受试者”或“个体”是用来指患有或可能患有癌症的人或非人哺乳动物(例如啮齿动物(小鼠、大鼠)、猫、犬、或灵长类动物)。优选地，所述受试者是人。
术语“治疗有效量”是指在可适用于任何治疗的合理利益/风险比的情况下，足以治疗癌症的多肽或核酸的量。然而，应理解，本发明的多肽和药物组合物在合理医疗诊断范围内的每日总用量将由主治医师决定。对于任一特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于许多因素，包括待治疗的病症和该病症的严重程度；使用的多肽的活性；使用的具体组合物，受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给药时间，给药途径，治疗的持续时间；与所使用的具体多肽联合使用或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。
将通过以下附图和实施例进一步阐明本发明。然而，这些实施例和附图不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。
图1 :鞭毛蛋白保护BALB/c小鼠抵抗肺炎链球菌的致命性呼吸性攻击只使用在盐水中的4X IO5CFU的肺炎链球菌(Sp)血清型1(黑色方块)，或补充有Iyg鞭毛蛋白 (FliC，黑色圆)或补充有Iyg胰蛋白酶消化的鞭毛蛋白(FliC/T，开圆)鼻内感染BALB/c 小鼠(η = 8)。(A)每天监测小鼠存活率。与盐水组或FliC/T处理组相比，FliC处理组的存活率是统计上显著的。结果是从3个实验中选出的I个代表。(B)攻击24h之后处死小鼠， 并在肺中测定菌落形成单位(CFU)的数目。用星号标注组之间的显著差异；P < 0.05(*)。 结果是从3个实验中选出的I个代表。误差线表示平均值土平均值标准误差(SEM)。
图2:抵抗肺炎链球菌感染的鞭毛蛋白介导的保护需要TLR5信号转导只使用在盐水中的4X IO5CFU的肺炎链球菌(Sp)血清型I (黑色方块)，或补充有Iyg FliC Δ 174-400 (黑色圆)，或补充有I μ g缺少TLR5信号转导基序的FliQ174-400/89-96* (开圆)鼻内感染BALB/c小鼠(η = 8)。每天记录小鼠存活率。与未处理组或FliC,174-400/89-96*处理组相比，FliCA 174-400处理组的存活率是统计上显著的(P < O. 05)。结果是从2个实验中选出的I个代表。实施例
材料&方法
细菌制备肺炎链球菌血清型I (临床分离物E1586)是从乌拉圭(39)卫生部国家参比实验室中获得的。工作储液是如下制备的。将生长在血琼脂平板上的肺炎链球菌新菌落接种到 ToddHewitt 酵母发酵液(THYB) (Sigma-Aldrich, St. Louis-MO, USA)中，在 37°C 下培养，直到该培养物达到O. 7-0. 9单位的0D6(l(lnm。将培养物在_80°C下储存在THYB+甘油 12% (v/v)中达到3个月。对于小鼠感染，使工作储液解冻，用无菌的生理盐水溶液(盐水)洗涤，并稀释到合适的浓度。储液中细菌的数量通过将连续稀释物涂在血琼脂平板上来确定。
蛋白质如之前所描述制备来自鼠伤寒沙门菌SIN22或重组鞭毛蛋白(FliCM74_4QQ 和FliCM74_4TO/89_96J的天然鞭毛蛋白(FliC)。？1扣，174_4(|(|/89_96*携带阻止TLR5信号转导的氨基酸代替物(89-96)。所有蛋白质均包含少量LPS (小于30pg LPS每μ g，采用鲎试验测定)。在一些实验中，胰蛋白酶水解的FliC(FliC/T)用作对照。在用于确保蛋白质为主要单体之前，在65°C下加热天然的FliC 5分钟。除非具体说明，Iyg FliC、FliC/T、FliCM74_4(l(l 或FliC,174-400/89-96* 与所述肺炎链球菌悬浮液共同鼻内施用。为了排除鞭毛蛋白对细菌生存能力的任何直接影响，在与相同浓度用于体内试验的鞭毛蛋白一起培养肺炎链球菌之前和之后测定活菌数。与对照情况相比，与鞭毛蛋白培养之后，在恢复细菌的数目上没有显著差巳
动物感染雌性BALB/c、C57BL/6J和远系杂交NMRI品系(6_8周大)从国家部门兽医实验室(乌拉圭)或Janvier实验室(法国)获得。雌性SCID小鼠(C. B-17SCID)从 Institut Pasteur de Lille培育基地获得。这些小鼠的特点在于缺少B和T淋巴细胞以及血内无丙种球蛋白。在单个通风笼中供养动物，并在垂直式生物安全操作台(class II A2 ESCO, Pensylvania-USA)中处理动物使其感染。所有实验符合目前国家和制度性规定和伦理准则(CHEA-Universidad de la Repiiblica,Uruguay 和 #A59107_InstitutPasteur de Lille)。通过腹膜内(1. p.)注射总体积200 μ I的2. 2mg氯胺酮(Richmond-Vet Pharma, Bs. As. -Argentina)和 O.1lmg 甲苯噻嗪(Portinco, Montevideo-Uruguay),或利用麻醉非重复呼吸系统(DRE-Compact 150, DRE Veterinary, Louisville-US)吸入异氟烧 (Belamont, SAS,France)来使小鼠麻醉。以20到50 μ I盐水的方式，将细菌和鞭毛蛋白施用到小鼠的鼻孔上。每天记录小鼠的存活率。
为了消耗粒性白细胞，在用肺炎链球菌(24)鼻内攻击之前24小时，腹膜内施用 100 μ g的抗-Gr-1 (RB6-8C5)或同型对照(HB 152)。鞭毛蛋白鼻内处理之后，在支气管肺泡灌洗(BAL)中发现该抗-Grl注射消耗了 96. 8±1. 2%的PMN。
肺和脾中细菌接种量的测定鼻内攻击之后在选定时间点采集肺和脾，再用 UltraTurrax均质器(IKA-Werke, Staufen-Germany)均质化。通过将连续稀释物涂在血琼脂平板上来测定活菌数。
定量的RT-PCR (qRT-PCR):使用 UltraTurrax 均质器在 Trizol 试剂(Invitrogen, California-USA)中使肺均质化，然后在_80°C下储存。按照厂家说明书进行RNA萃取。在 cDNA 合成之前，用 DNAse-1(Invitrogen)处理 IygS RNA,利用随机引物(Invitrogen)和M-MLV反转录酶(Invitrogen)进行第一链互补DNA(cDNA)合成。根据以下方案，在 Rotor-Gene 6000 (Corbett, Sydney-Australia) 中利用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，Hilden-Germany)进行实时PCR :95°C下15分钟，然后是40个95°C下 15秒和60°C下I分钟的循环。以O. 9μ M的最终浓度使用引物。使用β-肌动蛋白作为管家基因使目标基因的表达标准化。与盐水处理组相比，给出的结果表明mRNA水平成倍增加。
浸润入气道和肺的PMN的测定为了支气管肺泡灌洗(BAL)，插入抽样气管，滴入Iml的PBS和ImM EDTA六次，通过轻轻吸取回收；重复该过程两次。将细胞悬浮在 FACS-EDTA缓冲液(PBS，0. 1%叠氮化物，1%来自Sigma-Aldrich的牛血清白蛋白加上5mM EDTA)中。如上所述的胶原酶/脱氧核糖核酸酶处理(34)之后，分离肺细胞，再通过40 μ m 细胞过滤器过滤。在两层的Percoll (Sigma-Aldrich)梯度中分离免疫细胞。简言之，将细胞悬浮在35%等渗Percoll溶液中，小心地放置到70%等渗Percoll溶液上面，在2600g 和室温下不减速离心30分钟。清除主要对应于上皮细胞的顶部细胞层，从最靠近70 % Percoll层的细胞层中回收免疫细胞。使用100 μ m细胞过滤器过滤细胞，洗涤，染色以进行 FACS 分析。通过 FSC-SSC 和阳性染色来自 BD Biosciences 或 BioLegend, California-USA 的 PE-或 Alexa Fluor 647-结合的抗 _Ly_6G(克隆 1A8)、PerCP_Cy5. 5-结合的抗-Ly-6C (克隆HKl. 4)或PE-结合的抗-CD Ilb (克隆M1/70)来识别中性粒细胞。用PFA 4% 固定之后，在带有 CellQuest 3. 3 软件(BD Biosciences)的 FACS CaliburCytometer 上进行流式细胞术数据采集。
组织学分析在4%福尔马林(Sigma-Aldrich)中固定肺24小时，然后嵌入石蜡油中。使用 Leica 切片机(Leica Microsystems, ffetzlar-Germany)在 5μηι 处将肺块切片，粘附到硅烷化的载玻片上。用Nikon Eclipse 80i显微镜和Nikon DS-Ril数码照相机分析苏木精/伊红染色的切片，通过实验室成像使用NIS-Elements BR 3. O软件处理。
统计分析进行对数秩(Mantel-Cox)检验来分析存活曲线。为了在两组之间进行对比，进行Mann-Whitney检验。在所有情况下，P值< O. 05认为是显著的。用GraphPad Prism 程序(GraphPadSoftware, San Diego California USA)进行统计分析。
结果
鞭毛蛋白的鼻内递送保护小鼠抵抗肺炎链球菌的致命性攻击我们首先测定了鼻内(1. η.)施用时引起BALB/c小鼠100%死亡率的肺炎链球菌的最小量。用增加剂量的肺炎链球菌血清型I的临床分离物感染动物，并每天评价存活率。我们定义4X IO5CFU为在 72-120小时内杀死全部动物的最小致死量(MLD)。
然后，通过比较肺炎链球菌鼻内攻击的小鼠的存活率与滴入鞭毛蛋白(FliC)和肺炎链球菌的小鼠的存活率来评价鞭毛蛋白控制肺炎球菌肺炎的能力。作为对照，还用肺炎链球菌和预先用胰蛋白酶水解的鞭毛蛋白(FliC/T)攻击小鼠。如图1A所示，FliC处理的小鼠具有75%的存活率，而未处理的或FliC/T处理的动物在攻击之后的3到4天内死亡。不同独立实验之间从75%到100%变化的鞭毛蛋白诱导该保护。与只接受肺炎链球菌的动物相比，鞭毛蛋白和肺炎链球菌的联合施用导致在24小时内肺内细菌数减少了 80倍 (图1B)。我们还评价了鞭毛蛋白在感染之前和之后施用时，是否能发挥抵抗肺炎球菌感染的保护应答。肺炎球菌攻击之前12至24小时鼻内接受鞭毛蛋白的所有动物存活下来，而到第4天，所有对照小鼠都死亡。此外，当攻击之后24小时施用鞭毛蛋白时，也实现了 100% 保护。因此，鞭毛蛋白显示出对肺炎球菌肺炎的预防和治疗作用。
此外，评价了在C57BL/6和远系杂交品系NMRI中鞭毛蛋白诱导保护的能力。发现对于这两种品系，肺炎链球菌血清型I的MLD均是2 X IO6CFU,并用5倍MLD评价了鞭毛蛋白介导的保护。细菌攻击之前12小时施用鞭毛蛋白在C57BL/6小鼠中诱导了 80%的保护；类似地，当攻击之前32-6小时施用鞭毛蛋白，在NMRI动物中实现了 100%的保护。当在C57BL/6和NMRI品系中与肺炎链球菌联合施用时，虽然程度较低(40% )，但是鞭毛蛋白仍具保护性。总而言之，这些结果表明鞭毛蛋白处理在不同的小鼠品系中是保护性的。
其次，我们研究了 TLR5信号转导对于由鞭毛蛋白处理引起的保护是否必需。为此，我们使用重组鞭毛蛋白FliCA174__和FliCA174_4QQ/89_9W(27)。FliCA174-.具有与天然鞭毛蛋白相同的促进黏膜TLR5信号转导的能力，而FliC,174-400/89-96*携带阻止TLR5信号转导的突变。尽管接受FliCM74_4(l(l和肺炎链球菌的全部小鼠经历攻击之后存活下来，但接受突变体FliC,174-400/89-96* 的小鼠中没有一个存活下来(图2)。这些结果强有力的表明保护需要TLR5信号转导。
鞭毛蛋白处理促进促炎基因表达，并在肺炎球菌肺炎期间加剧了短暂的细胞浸润入肺然后，我们分析鞭毛蛋白处理是否改变了肺对肺炎球菌感染的转录反应。如前所述， 用肺炎链球菌或肺炎链球菌加上鞭毛蛋白攻击小鼠。另一组只接受鞭毛蛋白作为对照。处理和感染二十四小时后，收集肺，通过qRT-PCR分析选择基因的表达。与肺炎球菌攻击相比较，单独施用鞭毛蛋白或与肺炎链球菌联合施用引起了 Cxcll、Cxcl2和Ccl20mRNA水平的急剧增加。鞭毛蛋白处理还增加了 Tnf的表达；虽然该差异是相容的，但其不是统计学显著的。在受攻击并用鞭毛蛋白处理的动物中116表达增加了，但是在只接受鞭毛蛋白或肺炎链球菌的那些动物中116表达并未增加，这表明鞭毛蛋白和肺炎球菌感染之间在116表达上具有协同效应。与模拟动 物相比，在全部组中，TgfbU 1117a、I117f、1123和114基因的 mRNA水平保持不变。
为了评价促炎基因的表达是否与发炎和细胞浸润入气道有关，我们进行了鞭毛蛋白处理和感染后24小时获得的肺组织的组织学分析。肺炎链球菌诱导局限于某些细支气管和接近于这些细支气管的血管周围区域的中等细胞浸润。相反地，鞭毛蛋白处理，单独或与肺炎球菌一起，诱导水肿以及影响不仅血管周围和支气管周围(peribroncheal)区域而且围绕肺实质的一些区域的细胞大量浸润。值得注意地，在第7天，来自接受鞭毛蛋白和肺炎球菌的小鼠的肺显示出炎症的完全消退，没有明显的细胞浸润或水肿。这些结果表明， 鞭毛蛋白诱导了强烈但短暂的促进细菌清除的炎症反应，不引起肺形态或功能的永久性改变。
鞭毛蛋白诱导的保护需要Gr-1表达细胞，但与B和T淋巴细胞无关中性粒细胞募集进入气道是肺炎球菌感染和鼻鞭毛蛋白处理的标志，在这里我们表明鞭毛蛋白处理和感染激活了涉及中性粒细胞募集的基因表达。因此，我们的目的在于，比较在用肺炎链球菌攻击、或鞭毛蛋白处理或未用鞭毛蛋白处理的动物中的中性粒细胞浸润的动力学。在攻击后的不同时点收集BAL和肺，用抗-Ly6G抗体染色。肺炎球菌攻击在所有动物中诱导PMN 的募集。然而，与只用肺炎链球菌攻击的小鼠比较，在攻击时用鞭毛蛋白处理的小鼠显示出更快速和明显的PMN浸润入气道。无论哪个组，在24小时时，PMN浸润到达最高点，并且各组之间的差异最大。然而，到48小时，各组之间的PMN的数目已不再是明显不同。因此，鞭毛蛋白与肺炎球菌的联合施用引起大量的中性粒细胞快速且短暂的募集进入气道。
随后，我们确定中性粒细胞对于鞭毛蛋白介导的保护而言是否关键。为此目的，攻击之前24小时将粒性白细胞受体-1 (Gr-1或Ly6G/Ly6C)特异性的单克隆抗体或同型对照抗体腹膜内注入动物。接受同型对照并且用FliC处理的动物经历攻击之后存活下来。与此相反，抗-Gr-1处理消耗了来自该气道的>95%的中性粒细胞，取消了鞭毛蛋白介导的抵抗肺炎链球菌的保护。这些结果表明，Gr-1表达细胞如PMN，是肺炎球菌感染中鞭毛蛋白诱导的保护的关键效应器。
由于在肺炎球菌感染的早期阶段已经涉及B和T淋巴细胞，我们评价它们在鞭毛蛋白诱导的保护中的作用。用2 X IO7CFU的肺炎链球菌或肺炎链球菌和鞭毛蛋白攻击SCID 小鼠(抗体、B和T细胞缺失的)以及具有免疫能力的BALB/c小鼠。感染36小时之后收集肺和脾，测定细菌数。鞭毛蛋白联合施用在SCID小鼠肺中促进细菌清除，达到与BALB/c 小鼠中类似的程度。此外，当鞭毛蛋白处·理时，SCID和BALB/c小鼠都显示出脾内较低的细菌数，这意味着它们不仅能控制局部感染，而且能控制全身感染。与BALB/c小鼠相比，鞭毛蛋白滴注后16小时，SCID小鼠募集了类似数量的PMN进入肺和肺泡腔。总之，这些结果表明，Gr-1表达细胞引发鞭毛蛋白诱导的保护，既不需要B细胞,也不需要T淋巴细胞。
讨论:
如根据预防肺炎链球菌对呼吸道早期定植的TLR以及MyD88要求所示，先天免疫性是控制肺炎球菌感染必不可少的(Albiger, B. , Sandgren A. , Katsuragi H., Meyer-Hoffert U. , Beiter K. , Wartha F. , Hornef M. , Normark S. and NormarkB.H. 2005. Myeloiddifferentiation factor 88-dependent signalling controls bacterial growth during colonization and systemic pneumococcal disease inmice. Cell Microbiol 7 1603-1615. ；Khan, A. Q. , Q. Chen, Z. -Q. ffu, J. C. Paton, and C. M. Snapper. 2005. Both innate immunity and type lhumoral immunity to Streptococcus pneumoniae are mediated byMyD88 but differ in their relative levels of dependence on Toll-LikeReceptor 2.1nfect. Tmmun. 73 :298-307.)。对气道肺炎球菌感染的免疫应答的特点在于，大量和快速的募集中性粒细胞进入肺，通过PMN吞噬性杀死肺炎球菌被认为是主要的防卫机理。尽管如此，肺炎链球菌可以通过抑制或延迟补体沉积和吞噬细胞的呼吸爆发来躲避寄主的先天防御。因此，在血清型特异性抗体产生和绕过增强调理吞噬的补体沉积抑制之前，中性粒细胞涌入在清除感染中经常是无效的。 在该研究中，我们评价外源性施用不被肺炎链球菌天然接合的TLR激动剂，即TLR5激动剂鞭毛蛋白，是否能增强先天免疫性以控制急性呼吸性肺炎球菌感染。我们发现局部施用鞭毛蛋白通过增强局部和全身的细菌清除来提升用致死量的肺炎链球菌血清型I攻击的小鼠的存活率。在BALB/c、C57BL/6和NMRI小鼠中感染建立之前、期间和之后进行鞭毛蛋白处理是有效的。
已经证明体内施用鞭毛蛋白上调了促炎细胞因子的表达。在这里，我们表明，在肺炎链球菌攻击的时候，联合施用鞭毛蛋白也上调了肺内PMN特异性趋化因子/活化基因 CxclUCxcl2以及Tnf和Ccl20的表达，而仅仅肺炎链球菌不能充分诱导这些基因。与该趋化因子和细胞因子表达模式一致，肺组织切片的分析显示在气管周围和血管周围区域中大量的细胞浸润，这在鞭毛蛋白处理动物的肺中比感染的未处理动物的肺中更加明显。值得注意的是，虽然通过鞭毛蛋白诱导了明显的炎症反应，但是到第7天，肺组织完全恢复了， 而未处理的动物死于感染。BAL样品的分析表明，在肺炎球菌攻击的时候施用TLR5激动剂， 诱导加速和更明显的PMN募集。PMN浸润是短暂的，在24小时到达最高点，在40小时退回到稳定状态。Gr-1表达细胞(很可能是PMN)的消耗取消了该保护，表明这些细胞是控制肺炎球菌肺感染所必需的。鞭毛蛋白介导的炎症反应的自我限制性质是非常相关的发现，因为加剧的炎症可能与肺屏障与功能的衰竭有关。控制TLR5反应的分子机制不仅仅上调促炎基因，而且引发反应终止。因此，鞭毛蛋白黏膜处理可以被认为是针对肺炎球菌肺炎的疗法，其增强了中性粒细胞的浸润并同时增强了对炎症的限制，值得在临床试验中进一步评估。
除PMN之外，还有若干研究已经报道，T和B淋巴细胞以及天然抗体可能在肺炎球菌肺炎的早期控制中起重要作用。已表明，T淋巴细胞在免疫应答早期积聚在支气管周围炎症区域，并且T淋巴细胞与对抗肺炎球菌的防御有关，因为与它们的野生型对应物相比， 缺乏CD4+T细胞的MHC II类缺失的小鼠对感染更敏感。已表明，CD19缺失的小鼠，其具有发育受阻的Bla细胞和自然抗体生产，对肺炎球菌感染的易感性增加。然而，在这里提供的结果表明，T和B细胞都不是鞭毛蛋白诱导的局部和全身的细菌清除所需要的。综合起来， 我们的结果强有力的表明改变PMN动力学导致有效杀死肺炎球菌，即使在不存在B和T淋巴细胞的情况下。
我们的结果还表明，TLR5信号转导是鞭毛蛋白诱导的保护所需要的。在气道中， TLR5通过肺泡巨噬细胞和上皮细胞表达，表明这些常驻细胞可能是鞭毛蛋白处理时抵抗肺炎链球菌的保护性先天防御诱导中的关键角色。与此一致，近来研究表明，气道上皮细胞是 TLR5激活的组织，其涉及响应于鞭毛细菌的趋化因子生产和PMN募集。另一方面，鼠科中性粒细胞表达TLR5，因而TLR5信号转导也可以直接激活PMN并增强它们杀死肺炎链球菌的能力。通过类似方式，之前已证实，热杀死的流感嗜血杆菌能够以Nodl-相关的方式特异性增强PMN杀死肺炎球菌的能力。
预防和治疗肺炎链球菌感染的当前疗法在预防或治愈肺炎球菌疾病上有限制，因而还需要免疫干预的新策略。一些报告已表明，细菌溶解产物和全部热杀死的细菌的施用会刺激抵抗感染的保护性反应。然而，在设计人用药物时，这些制剂的不明确性质通常是问题。我们的结果表明，单个和良好表征的分子特别是鞭毛蛋白的局部刺激足以增强肺先天免疫防御并控制肺炎球菌肺炎，突出了使用微生物相关分子模式作为基础形成抗菌疗法的益处。
参考文献
贯穿本申请，各种参考文献描述了本发明所属技术领域的目前状况。因此，这些参考文献的公开内容通过引用的方式结合到本说明书中。
权利要求
1.TLR5激动剂，其用于治疗呼吸道感染的方法。
2.根据权利要求1的TLR5激动剂，其选自有机小分子、抗体、适体或多肽。
3.根据权利要求1或2的TLR5激动剂，其是鞭毛蛋白多肽。
4.根据权利要求3的TLR5激动剂，其中所述鞭毛蛋白多肽是从细菌中分离出来的，所述细菌选自埃希杆菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属；沙门氏菌属例如鼠伤寒沙门菌；沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌、志贺氏菌属；芽胞杆菌属例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；假单胞菌属例如绿脓杆菌；和链霉菌属。
5.根据权利要求3或4的TLR5激动剂，其中所述鞭毛蛋白多肽的所述氨基酸序列选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3，或与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 或 SEQ IDNO 3具有至少约90 %，至少约95 %，至少约97 %，至少约98 %或至少约99 %一致性的氨基酸序列。
6.根据权利要求3的TLR5激动剂，其中所述鞭毛蛋白多肽包含a)具有与该氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的N-末端肽，所述氨基酸序列始于位于SEQ ID NO 3的位置I的氨基酸残基，并终止于选自位于SEQ ID NO 3的位置99至173的任一个氨基酸残基的氨基酸残基；和b)具有与该氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的C-末端肽，所述氨基酸序列始于选自位于SEQ ID NO 3的位置401至406的任一个氨基酸残基的氨基酸残基，并终止于位于SEQ ID NO 3的位置494的氨基酸残基，其中所述N-末端肽直接连接到所述C-末端肽，或所述N-末端肽与所述C-末端肽通过间隔链一个与另一个间接连接。
7.根据权利要求6的TLR5激动剂，其中所述N-末端肽选自SEQIDNO 3的氨基酸序列 1-99、1-137、1-160 和 1-173。
8.根据权利要求6或7的TLR5激动剂，其中所述C-末端肽选自SEQID NO 3的氨基酸序列 401-494 和 406-494。
9.根据权利要求6-8任一项的TLR5激动剂，其中所述N-末端和C-末端肽分别由SEQID NO 3的氛基酸序列1-173和401-494组成。
10.根据权利要求6-8任一项的TLR5激动剂，其中所述N-末端和C-末端肽分别由SEQID NO 3的氨基酸序列1-160和406-494组成。
11.根据权利要求6-8任一项的TLR5激动剂，其中所述N-末端和C-末端肽分别由SEQID NO 3的氨基酸序列1-137和406-494组成。
12.根据权利要求6-11任一项的TLR5激动剂，其中所述N-末端肽和所述C-末端肽通过由NH2-GIy-AIa-AIa-GIy-COOH(SEQ IDNO 4)肽序列组成的中间间隔链一个与另一个间接连接。
13.根据权利要求6-12任一项的TLR5激动剂，其中所述位于SEQID NO 3的位置488的天冬酰胺氨基酸残基被丝氨酸取代。
14.根据权利要求6-13任一项的TLR5激动剂，其中所述鞭毛蛋白多肽包含在N-末端的额外蛋氨酸残基。
15.根据前述权利要求任一项的TLR5激动剂，其中所述呼吸道感染选自病毒感染、细菌感染或真菌感染。
16.根据权利要求15的TLR5激动剂，其中所述病毒感染由病毒引起，所述病毒选自逆转录病毒例如人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV) I和II型和人免疫缺陷病毒(HIV)，疱疹病毒例如单纯疱疹病毒(HSV) I和II型、Epstein-Barr病毒、HHV6-HHV8和巨细胞病毒，沙粒病毒例如拉沙热病毒，副粘病毒例如麻疹病毒属病毒、人呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、hMPV和肺炎病毒，腺病毒，布尼亚病毒例如汉坦病毒，冠状病毒、丝状病毒例如伊波拉病毒，黄病毒例如丙肝病毒(HCV)、黄热病毒和日本脑炎病毒,肝炎病毒例如乙肝病毒(HBV),正粘病毒例如流感病毒A、B和C、PIV，乳多空病毒例如乳头瘤病毒，细小核糖核酸病毒例如鼻病毒、肠道病毒和甲肝病毒，痘病毒，呼肠孤病毒例如轮状病毒，囊膜病毒例如风疫病毒，和棒状病毒例如狂犬病病毒。
17.根据权利要求15的TLR5激动剂，其中所述细菌感染由细菌引起，所述细菌选自水螺菌科，固氮螺菌科，固氮菌科，类杆菌科，巴尔通体种，蛭弧菌科，弯曲杆菌种，衣原体种例如衣原体肺炎链球菌，梭状芽胞杆菌，肠杆菌科例如朽1檬酸细菌种、爱德华氏菌、产气肠杆菌、欧文氏菌种、大肠杆菌、哈夫尼菌种、克雷伯氏杆菌种、摩根氏菌种、普通变形杆菌、普罗维登斯菌、沙门氏菌种、粘质沙雷氏杆菌和弗累克斯i内氏杆菌，Gardinella科,流感嗜血杆菌，盐杆菌科，螺杆菌科，Legionallaceae科,李斯特菌种，甲基球菌科，分枝杆菌属例如结核分枝杆菌，奈瑟氏球菌科，海洋螺菌科，巴斯德氏菌科，肺炎球菌种，假单胞菌种，根瘤菌科，螺旋菌科，无毛螺旋体科，葡萄球菌属例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和化脓性葡萄球菌，链球菌属例如肠炎链球菌、粪链球菌和肺炎链球菌，Vampirovibr Helicobacter科，和編幅弧囷科。
18.根据权利要求17或18的TLR5激动剂，其中所述细菌感染由不具有鞭毛的细菌例如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、或肺炎支原体所引起。
19.根据权利要求17-19任一项的TLR5激动剂，其中所述细菌感染是肺炎球菌感染。
20.根据权利要求15的TLR5激动剂，其中所述真菌感染由真菌引起，所述真菌选自犁头霉种例如伞枝犁头霉和分枝犁头霉，曲霉种例如黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉，皮炎芽生菌，假丝酵母种例如白色假丝酵母、Candida glabrala、Candida kerr、克鲁斯假丝酵母、近平滑假丝酵母、伪热带假丝酵母、CandidaquiIlermondi1、皱裙假丝酵母、类星形假丝酵母和热带假丝酵母，粗球孢子菌，耳霉种，新生隐球菌，小坎宁安霉种，荚膜组织胞浆菌，微小毛霉，巴西副球孢子菌，波氏假阿利什菌，肺炎肺囊虫，根霉种例如少根根霉、米根霉和小孢根霉，糖酵母种，和申克孢子丝菌。
21.用于治疗呼吸道感染的方法的药物组合物，其包含根据权利要求1-14任一项的TLR5激动剂。
22.根据权利要求21的药物组合物，其配制成与局部施用例如鼻内施用或肺施用兼容。
23.根据权利要求22的药物组合物，其配制成气雾剂形式、喷雾剂、雾剂或滴剂形式。
24.预防、治疗、控制或改善呼吸道感染或一种或多种其症状的方法，其包含向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-14任一项的TLR5激动剂。
全文摘要
本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法和药物组合物。更特别地，本发明涉及用于治疗呼吸道感染的方法中的TLR5激动剂。
文档编号A61P11/00GK103037887SQ201080067699
公开日2013年4月10日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者J-C·西拉德, J·A·沙巴瓜蒂 申请人:国家医疗保健研究所, 里尔巴斯德研究所