专利名称：一种双重靶向的d构型多肽及其递药系统的制作方法
一种双重靶向的D构型多肽及其递药系统技术领域
本发明属药学领域，涉及靶向的D构型多肽及其递药系统，尤其涉及肿瘤新生血管和肿瘤细胞双重靶向的D构型多肽及其递药系统。
背景技术：
目前，随着人类生存环境的恶化，诱发癌症的因素越来越多，癌症的发病率亦呈明显的上升趋势。有关研究揭示成功的肿瘤治疗的一个首要目标就是要将足够量的药物递送到肿瘤部位，与此同时将对于正常组织的损害降低到最低。本领域的研究重点之一在于寻找可特异性与肿瘤细胞或者肿瘤微环境如肿瘤血管系统结合的物质。现有技术公开了噬菌体展示技术被认为是筛选定向靶向肿瘤组织有效配体的重要手段之一，通过该技术筛选出来的多肽已经被成功应用于肿瘤诊断和治疗。现有技术公开了 L-SP5是一条包含12个氨基酸的多肽，是由Lee TY [Cancer Res. 2007 ；67 (22)通过噬菌体展示技术得到，并认为其中PSP三个氨基酸(SVSVGMKPSPRP)为其有效构效序列。有研究经化学合成得到L-SP5， 实验证明其具有肿瘤新生血管靶向性。
研究显示，D-氨基酸构型与L-氨基酸不同，所以相同序列的D肽具有与L肽不同的手性，所以其生物活性也可能不同。后有研究者发现，逆序D肽与顺序L肽除了羧基和氨基的方向不同外，其侧链排布较相似，并且能表现出相似或者更高的生物活性。发明内容
本发明的目的是提供一种与现有技术不同的D构型多肽，具体涉及一种双重靶向的D构型多肽及其递药系统，尤其是肿瘤新生血管和肿瘤细胞双重靶向的D构型多肽及其递药系统。
本发明将L-SP5逆序并以D构型的氨基酸替代后获得D构型多肽(D-SP5)，将 D-SP5与荧光素偶联后，经细 胞学研究，细胞摄取结果表明，D-SP5可以特异性靶向肿瘤新生血管和肿瘤细胞，该D-SP5不仅保留了 L-SP5的肿瘤新生血管靶向作用，而且新增加了对多种肿瘤细胞的靶向作用；经体内外药效学研究表明，将D-SP5修饰到包载抗肿瘤药物的聚合物胶束表面后，显示出有较好的抗肿瘤作用，且与普通抗肿瘤药物聚合物胶束组相比具有极显著统计学差异。
本发明采用的试验用细胞均为本领域公知，可通过市购获得。
具体而言，本发明的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，该多肽D-SP5其氨基酸序列为 D (PRPSPKMGVSVS))。
本发明中，利用固相合成法合成D-SP5，半胱氨酸作为功能基团引入，分别连结在有效构效氨基酸序列的另一端(丝氨酸端)；利用半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺的特异性反应，将D-SP5-cys与MAL-FITC反应，将FITC标记在多肽分子上；将标有荧光素的多肽进行细胞特异性摄取实验。实验表明，经生长因子诱导的HUVEC、KB、SGC和U87等细胞均对 D-SP5-FITC有较高的摄取水平。实验结果证实，所述的多肽D-SP5具有肿瘤新生血管和肿瘤细胞双重靶向性，可介导分子或者纳米递药系统向肿瘤靶向递送药物。
本发明中，所述的多肽D-SP5，与X以共价键连接，获得到的D-SP5-X复合物，其中的X可以是荧光物质FITC或近红外染料IR820 ;该D-SP5-X复合物具有肿瘤靶向特性；可进一步用于体外靶向肿瘤细胞的筛选，体内活体成像以及肿瘤诊断。
本发明中，D-SP5通过引入半胱氨酸不但可以修饰到PEG-DSPE聚合物胶束给药系统，还可以修饰到PEG-PLA、PEG-PLGA, PEG-PCL聚合物胶束系统上，所述的多肽D-SP5， 其N端连接半胱氨酸得巯基化多肽，与含马来酰亚胺-聚乙二醇的两亲性高分子胶束材料连接，获得胶束材料D-SP5-PEG-Y复合物，该复合物中的Y可选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)、或聚己内酯(PCL)，进一步形成聚合物胶束递药系统 D-SP5-PEG-DSPE、D-SP5-PEG-PLA、D-SP5-PEG-PLGA 或 D-SP5-PEG-PCL，包载抗肿瘤药物。
本发明的一个实施例中，将D-SP5-cys与马来酰亚胺反应修饰到PEG-DSPE材料上，制得修饰有D-SP5的载阿霉素的聚合物胶束，药效学实验表明，修饰D-SP5的聚合物胶束可增加递药系统肿瘤细胞的靶向性，显著提升了肿瘤抑制的效果，与普通阿霉素聚合物胶束组相比具有极显著性差异。
本发明中，D-SP5修饰的具有肿瘤靶向特征的的递药系统不仅仅限于包载紫杉醇、 多烯紫杉醇、喜树碱、顺钼、阿霉素或伊曲康唑等抗肿瘤药物，还可以包载贝伐单抗、索菲拉尼等肿瘤新生血管抑制剂；
本发明聚合物胶束递药系统具有肿瘤靶向特征，可携带药物蓄积于肿瘤组织，用于肿瘤的诊断与治疗。
本发明的多肽D-SP5还可直接与上述药物进行化学键合后直接给药用于肿瘤的治疗。
图1 是 D-SP5_cys 的 HPLC 以及 ES1-MS 图谱，
其中色谱方法色谱柱YMC C18 5 μ 150 X 4. 6mm ;流动相A :水(含O.1 %三氟乙酸)；流动相B:乙腈(含O.1 %三氟乙酸)；洗脱程序0 45分钟5%8-65(%8;流速 O. 7ml/ 分钟；柱温40°C ;检测UV214nm, D-SP5_cys :10. 763 分钟。ES1-MS D-SP5_cys 1344. 6。
图2是HUVEC细胞对D_SP5_FITC的摄取荧光照片。
其中，A为HUVEC细胞对D-SP5-FITC的摄取结果；B为经VEGF和bFGF刺激的HUVEC 细胞对D-SP5-FITC的摄取结果。
图3是肿瘤细胞KB、SGC、U87以及正常人肝细胞HL-7702和脑内皮血管细胞BCECs 对D-SP5-FITC的细胞摄取荧光照片，
A、B和C分别为KB、U87和SGC细胞对D-SP5-FITC的摄取结果；D为D-SP5竞争抑制KB细胞对D-SP5-FITC的摄取结果；E和F分别为HL-7702和BCECs细胞对D-SP5-FITC 的摄取结果。
图 4 是 D-SP5-PEG-DSPE 的 HPLC 图谱。
图 5 是 M-micelles-DOX 和 D-SP5-micelles-D0X 透射电镜照片，
A为普通载阿霉素胶束透射电镜照片；BSD_SP5修饰载阿霉素主动靶向胶束透射电镜照片。
图6是体外药效学试验，
D-SP5修饰载阿霉素聚合物胶束在体外对肿瘤细胞KB抑制作用。
图7是体内药效学肿瘤体积随时间的变化曲线图，
D-SP5修饰载阿霉素胶束即D-SP5_micelles组与普通胶束即M-micelles组相比， 抗肿瘤作用具极显著性差异(η = 6，P < O. 01)。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例lD-SP5_cys的制备与表征
采用固相合成法，将PAM-Boc树脂用三氟乙酸(TFA)脱保护I分钟，两次。用Boc 保护氨基酸依次反应，反应完成后，三氟乙酸脱Boc保护后，依次用DMF、DCM/MeOH(l/l)洗涤树脂，真空干燥。将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应Ihr。反应结束后减压抽去管中HF，冰乙醚洗涤沉淀3次，残余沉淀以20%乙腈溶解后旋蒸，用乙腈/水(含O.1 % TFA)体系分离纯化。HPLC和ES1-MS表征D_SP5-Cys的纯度和分子量。其HPLC图谱及质谱图如图1所示，D-SP5-cys与的分子量均为1344. 7，与计算结果相符。
实施例2模型肿瘤新生血管细胞HUVEC对D-SP5_52_FITC的细胞摄取试验
将两种巯基化的多肽分别溶解于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，将MAL-FITC亦溶解在 PH7. 4磷酸盐缓冲液后缓慢滴加到多肽溶液中。室温避光反应2h，用乙腈/水(含0.1% TFA)体系分离纯化，得到D-SP5-FITC。
将未经新生血管生长促进因子刺激的HUVEC细胞接种于48孔板中，待细胞贴壁后，弃去含有血清的DMEM，每孔加入不含血清的DMEM以及D-SP5-FITC荧光素母液，控制荧光素终浓度均为5X 10_6mol/L。.继续培养4h后取出，PBS洗两次，之后每孔加入500ul含血清的DMEM，荧光显微镜拍照。试验结果如图2A所示；
将未经新生血管生长促进因子刺激的HUVEC细胞接种于48孔板中，待细胞贴壁后，加入新鲜培养液及VEGF和bFGF母液，(控制终浓度分别为20ng/ml、2ng/ml)培养48h。 弃培液，加入不含血清的DMEM及D-SP5-FITC荧光素母液，控制荧光素终浓度为5X10_6mol/ L。培养4h后，PBS洗两遍，重新加入含血清DMEM。荧光显微镜拍照。试验结果如图2B所/Jn ο
结果表明新生血管生长促进因子可显著增加HUVEC对D-SP5-FITC的摄取，表明将L-SP5转变成D-SP5后D-SP5仍旧保留了较好的肿瘤新生血管靶向性。
实施例3肿瘤细胞和正常细胞对D-SP5-FITC的细胞摄取试验
将KB、SGC和U87三株肿瘤细胞，以及正常人肝细胞HL-7702以及脑内皮血管细胞BCECs分别接种于48孔板中，待细胞贴壁后，弃去含有血清的DMEM，每孔加入不含血清的 DMEM以及D-SP5-FITC荧光素母液，控制荧光素终浓度均为5 X 10_6mOl/L。继续培养4h后取出，PBS洗两次，之后每孔加入500ul含血清的DMEM，荧光显微镜拍照。试验结果见附图三。结果表明，KB、SGC、U87对D-SP5-FITC均有显著摄取，正常细胞对于D-SP5-FITC摄取量显著显著低于肿瘤细胞，D-SP5经初步推断具有良好的肿瘤靶向作用。
将KB细胞接种于48孔板中，待细胞贴壁后，弃去含有血清的DMEM，每孔加入不含血清的DMEM、多肽D-SP5的DMEM溶液(lmg/ml)、D-SP5-FITC荧光素母液，控制荧光素终浓度均为5X 10_6mOl/L。继续培养4h后取出，PBS洗两次，之后每孔加入500ul含血清的 DMEM，荧光显微镜拍照。试验结果如图3所示。结果表明，，多肽D-SP5可显著抑制KB对 D-SP5-FITC的摄取，对其摄取具有竞争性抑制作用。
实施例4D-SP5-PEG-DSPE的合成与纯化
将实施例1得到的D-SP5_Cys溶于PBS溶液中(pH7. O)，按1. 2 I加入 MAL-PEG-DSPE,磁力搅拌反应，HPLC监测反应，待MAL-PEG-DSPE反应完全后停止反应，粗品用用乙腈/水(含O.1 % TFA)体系分离纯化。
色谱条件为色谱柱Sepax Bio C4 5 μ I 50 X 4. 6mm ;流动相A :水(含O.1 %三氟乙酸)；流动相B:乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脱程序0-45分钟70^8-90% B;流速 O. 7ml/ 分钟；柱温40°C ;检测UV214nm, D-SP5-52-PEG-DSPE :14. 931 分钟。
HPLC结果如图4所示。
实施例OT-SP5修饰聚合物胶束的自组装及表征
15mg MPEG-DSPE1. 5ml氯仿中溶解，加入含3mg DOX的MeOH液O. 6ml,甲醇溶解的D-SP5-PEG-DSPE，37°C成膜，真空干燥过夜，O. 6ml HEPES水化。S印hadex G50凝胶柱分离游离D0X，制得D-SP5修饰的阿霉素聚合物胶束。同法制备载阿霉素的普通胶束。两种胶束的透射电镜照片如图5所示。
实施例6D-SP5修饰载阿霉素聚合物胶束的外药效学实验
用含10%小牛血清的DMEM培养液，在二氧化碳培养箱内(37°C、5% CO2、饱和湿度)培养KB细胞，分别以7. 5X103cells/well接种于96孔板，24h后，将培养液替换为 200 μ I的D-SP5修饰阿霉素聚合物胶束、阿霉素聚合物胶束和游离药物，相同条件共培养 2h后用DMEM培养液替换药物，继续培养46h，后采用MTT法测定细胞存活率。试验结果见附图六。结果表明与普通阿霉素胶束比较，D-SP5修饰的载药胶束有明显的抑制肿瘤细胞生长作用。说明D-SP5修饰的胶束具有一定的肿瘤细胞靶向性。
实施例7D-SP5修饰载阿霉素胶束的体内药效学实验
取对数生长期的KB细胞，以120万/只接种在4 5周龄裸鼠右侧肋下。约14 天后，平均瘤体积达IOOmm3 (瘤体积计算为长径*短径2*0. 52)，皮下瘤模型成功建立。KB 的荷瘤裸鼠随机分组为五组，分别注射D-SP5-micelles、M-micelles、游离DOX以及HEPES 缓冲液。给药组阿霉素总给药剂量为10mg/kg，分为五次，每次给药间隔为两天。隔天测量并计算各组裸鼠肿瘤体积。肿瘤体积随时间的变化曲线如附图七所示与M-micelles组相比，D-SP5-miCelles对肿瘤的具有更为显著的抑制作用，两组之间存在极显著性差异(η = 6, P < O. 01)。
权利要求
1.一种双重靶向的D构型多肽，其特征在于，该D构型多肽为肿瘤新生血管和肿瘤细胞双重靶向的多肽D-SP5，其氨基酸序列为D (PRPSPKMGVSVS)。
2.按权利要求1所述的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，所述的双重靶向的多肽D-SP5，与X以共价键连接，制成D-SP5-X复合物。
3.按权利要求2所述的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，所述的D-SP5-X复合物中的X是荧光物质FITC或近红外染料IR820。
4.按权利要求1所述的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，所述的双重靶向的多肽D-SP5，其N端连接半胱氨酸后，得到巯基化多肽，与含马来酰亚胺-聚乙二醇的两亲性高分子胶束材料连接，制得胶束材料D-SP5-PEG-Y复合物。
5.按权利要求5所述的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，所述的D-SP5-PEG-Y复合物中Y是选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)或聚己内酯(PCL)。
6.按权利要求5所述的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，所述的D-SP5-PEG-Y复合物包载抗肿瘤药物制成聚合物胶束递药系统D-SP5-PEG-DSPE、D-SP5-PEG-PLA、D-SP5-PEG-PLGA 或 D-SP5-PEG-PCL。
7.按权利要求7所述的双重靶向的D构型多肽，其特征在于，所述的抗肿瘤药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、顺钼、阿霉素或伊曲康唑，或贝伐单抗或索菲拉尼。
8.权利要求1的双重靶向的D构型多肽在制备双重靶向治疗肿瘤新生血管和肿瘤细胞药物中的用途。
9.权利要求2所述的制成的D-SP5-X复合物在制备体外靶向肿瘤细胞筛选，体内活体成像以及肿瘤诊断制剂中的用途。
10.权利要求6所述的聚合物胶束递药系统在制备靶向诊断与治疗肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明属于药学领域，涉及肿瘤新生血管和肿瘤细胞的一种双重靶向的D构型多肽及其递药系统。本发明将L-SP5逆序并以D构型的氨基酸替代后获得D构型多肽D-SP5，其与荧光素偶联后，细胞摄取结果表明，D-SP5可以特异性靶向肿瘤新生血管和肿瘤细胞，经体内外药效学研究表明，将D-SP5修饰到包载抗肿瘤药物的聚合物胶束表面后，显示出有较好的抗肿瘤作用，构建的载药聚合物胶束可以显著提高体内外抗肿瘤作用，与普通包载药物聚合物胶束组比较具有极显著统计学差异。
文档编号A61K49/14GK103012562SQ20111028688
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月24日 优先权日2011年9月24日
发明者刘敏, 李莹, 陆伟跃, 谢操, 董青, 雷杨, 王晶 申请人:复旦大学