专利名称：转录因子nfatc3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及转录因子NFATC3的ー种新用途，尤其涉及转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
背景技术：
肿瘤是严重危害人类健康的ー类疾病，位居各类死因之首。目前我国患肿瘤人数众多，毎年死于肿瘤的人数超过160万。在我国现已批准上市的抗肿瘤药物大约有200多种，但随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的多药耐药问题凸显，已成为肿瘤化疗失败最常见而又难以解决的问题之一，据统计90%以上的肿瘤患者死于不同程度的耐药。
肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同吋，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降低抗肿瘤药物的疗效。因此，研究MDR的产生机制，寻求有效的耐药逆转措施从而克服MDR现象已成为国内外的研究热点。跨膜蛋白介导的MDR为最经典的MDR产生机制，其中最常见的为P-糖蛋白。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)也称pl70糖蛋白，是由多药耐药基因MDRl所编码的ー种ATP依赖性膜转运蛋白，P-gp为ー种药物泵，能将多种药物泵出细胞外，使胞内药物聚积减少，从而减弱药物的细胞毒作用，最终使肿瘤细胞产生耐药性。P-gp主要介导亲脂性抗肿瘤药物引起的MDR，包括抗生素类如多柔比星/阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)，植物类药物如长春新碱(VCR)、依托泊苷(Vp216)等。根据MDR产生机制，选择特有的靶点设计合成直接作用于耐药肿瘤的新药进行靶向治疗，将对肿瘤的治疗非常有益。近几年，研究者发现了很多与肿瘤多药耐药相关的药物靶点，然而依据这些这些药物靶点研发或筛选出的耐药逆转剂通常具有严重的毒副作用，因而阻碍了它们在临床上的应用，因此，寻找新的肿瘤耐药相关靶点，并在此基础上设计筛选出高效低毒的多药耐药逆转剂亟不可待。NFATCnuclear factor of activated T cells)即活化T细胞核因子，属于一类转录因子家族，在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。NFAT分为NFATC1-NFATC4四种亚型。NFAT在各种类型的免疫细胞(如B细胞、NK细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞)以及肿瘤和构成肿瘤微环境的细胞内均有表达，其活性受到钙离子依赖性的钙调蛋白磷酸酯酶(Calcineurin)的调节,其活化过程分为三步脱磷酸、核易位、对DNA亲和カ的提高。在静止细胞中，NFAT蛋白被磷酸化而存在于细胞浆，对DNA具有低亲和力，在由任何因素弓丨起的细胞外钙内流的情况下(如由瞬时受体电位通道TRPC5介导的细胞外钙内流)，上述钙离子依赖性钙调蛋白磷酸酯酶将促使NFAT蛋白快速脱磷酸化并进入细胞核，入核后的NFAT对DNA的亲和カ增强。NFAT抑制剂如他克莫司(FK-506)、环孢菌素A(CyclosporinA)、VIVIT等可通过抑制上述钙调蛋白磷酸酯酶来阻断NFAT通路。目前，国内外未见有转录因子NFAT作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供转录因子NFATC3的ー种新用途，即转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。所述药物为NFATC3抑制剂，包括他克莫司、环孢菌素A或VIVIT。所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本发明的有益技术效果为
经本发明人研究发现，与敏感型肿瘤细胞(如MCF-7/WT)相比，介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白在多药耐药肿瘤细胞(如MCF-7/ADM)中有更高水平的表达，此外，预测并证实了转录因子NFATC3可与MDRl启动子区域相结合，在瞬时受体电位通道TRPC5介导的细胞外钙内流的激活作用下，转录因子NFATC3的转录活性增强从而上调p-gp的表达 水平，证明该转录因子与肿瘤多药耐药密切相关；实验结果表明，NFATC3抑制剂(FK-506、CyclosporinA, VIVIT)对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且上述抑制剂本身在使用剂量范围内毒副作用很小；因此，本发明为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。
图I为转录因子NFATC3的活化及活化后的NFATC3上调MDRl基因表达的过程示意图。图2为本发明实施例I中多药耐药肿瘤细胞中MDRl mRNA转录水平的检测结果示意图。图3为本发明实施例2中预测并证实转录因子NFATC3与MDRl启动子区域相结合的实验结果示意图。图4本发明实施例3中TRPC5介导的细胞外钙内流对转录因子NFATC3的激活作用的检测结果示意图。图5本发明实施例4中NFATC3抑制剂对肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。具体实施例方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进ー步的说明。如图I所示，转录因子NFATC3的活化过程分为三步脱磷酸、核易位、对DNA亲和カ的提高。在细胞外I丐通过I丐离子通道(ion channel)内流入胞衆(cytosol)的情况下，钙离子依赖性钙调蛋白磷酸酯酶(A B)将促使NFATC3快速脱磷酸化并进入细胞核(nucleus)，入核后的NFATC3与细胞核中MDRl基因的启动子(promotor)区域结合，通过调控该基因的mRNA转录水平来上调P-gp的表达水平。实施例I 实施例4所使用实验材料如下
细胞系野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT购自美国模式培养物寄存库(ATCC);耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM以及能稳定表达TRPC5的人胚胎肾细胞HEK293由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存。上述耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM制备方法为将新复苏的野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT细胞(购自ATCC)于细胞培养常规条件下培养2代 3代，使细胞生长稳定，待细胞汇合时用胰酶进行消化并传代，第二天更新培养基，同时以MCF-7/WT IC50的1/10为起始浓度加入阿霉素，于加药第二天再次换液，并维持阿霉素的浓度进行常规传代培养，待细胞稳定生长后提高药物浓度继续培养，直到细胞可在阿霉素浓度为5 μ g/ml的培养基中稳定生长，即得，整个制备过程历时8个月；上述能稳定表达TRPC5的人胚胎肾细胞HEK293制备方法为按常规实验操作方法，用EcoR I和Not I分别对TRPC5基因(由美国哈佛大学教授D. E. Clapham赠送，Gene ID:7224)和PCDNA6A载体(购自美国Addgene公司)进行双酶切，回收经双酶切的基因和载体片段，构建TRPC5和pCDNA6A的重组表达质粒pCDNA6A_TRPC5，并将该重组表达质粒转染人胚胎肾细胞HEK293 (购自 ATCC)所得。质粒与基因mdrl_luc购自美国Panomics公司，为突光素酶报告基因载体上携带有800bp MDRl启动子序列的质粒；pRL_CMV、pCDNA6A和pCDNA6A_NFATc3购自美国Addgene公司；绿色荧光蛋白GFP基因和NFATC3基因购自美国Addgene公司。试剂及试剂盒TrizolReagent 购自美国 Invitrogen 公司；Hot startFluo-PCR mix购自美国Bio-Rad公司；NFATC3抗体购自美国Abcam公司；VIVIT、FK506 和 CyclosporinA 购自美国 sigma 公司；VIVIT、FK506 及 CyclosporinA 购自美国 sigma 公司；Anti-P-gp (SC-55510)购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L) (A0216)购自上海碧云天生物科技有限公司；反转录试剂盒iScript TM cDNASynthesis Kit购自美国Bio-Rad公司；双突光酶素报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；核酸蛋白质沉淀试剂盒chromatin Immunoprecipitation Assay kit购自美国cellsignaling 公司;定点突变试剂盒 Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit 购自美国 Stratagene 公 ロ]。实验仪器iCycler iQ荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；荧光显微镜购自日本尼康公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司；5%C02恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司；蛋白转印仪购自美国Bio-Rad公司；SDS-PAGE电泳仪系统购自美国Bio-Rad公司。实施例I多药耐药肿瘤细胞中MDRl mRNA的转录水平检测 实验方法
分别取MCF-7/WT和MCF-7/ADM各I X IO5个，并按照Trizol Reagent试剂操作说明书所述方法提取上述细胞的总RNA ;按照反转录试剂盒iScript TM cDNA Synthesis Kit操作说明书所述方法将上述提取得到的细胞总RNA进行反转录，得到cDNA，反转录引物为上述试剂盒自带通用引物。通过 Real-time 荧光定量 PCR 检测 MCF-7/WT 和 MCF-7/ADM 中 Ρ-gp 的 mRNA转录水平。Real-time PCR扩增在iCycler iQ荧光定量PCR仪上进行。荧光定量PCR引物设计上游引物为5’ -GCCGGGAGCAGTCATCTGTGG T-3’，下游引物为5’ -GAT CCATTCCGACCTCGCGCT-3’ ；荧光定量PCR反应条件为95°C 15s，53°C 40s，40个循环；荧光定量PCR反应体系为在20 μ L反应体系中，Hot start Fluo-PCR mix 10 μ L，上游引物(50pmol/ μ L) O. 2 μ L,下游引物(50 pmol/ μ L)0. 2 μ L，无菌去离子水 7·6μ ,上述 cDNA 产物2μ L ;PCR目的产物为251bp ;运用iCycler iQ荧光定量PCR仪软件对实验数据进行分祈。实验结果
实验结果见图2。由图2可知，与MCF-7/WT相比，MCF-7/ADM中P-gp mRNA转录量明显增高。该实验结果表明，与敏感型肿瘤细胞(MCF-7/WT)相比，P-gp在多药耐药肿瘤细胞(MCF-7/ADM)中有更高水平的表达。实施例2预测并证实转录因子NFATC3与MDRl启动子区域相结合 实验方法
运用转录因子结合位点预测软件TESS (Transcription Elemen Search System)预测NFATC3与MDRl启动子区域的结合位点。以MCF-7/WT和MCF-7/ADM为样品，按照核酸蛋白质沉淀试剂盒chromatinImmunoprecipitation Assay kit操作说明书所述方法检测NFATC3与MDRl启动子的结合情況，即先采用染色体免疫共沉淀(CHIP)技术来沉淀与目标蛋白质相结合的染色质片段，然后通过PCR检测所沉淀的染色质片段。设实验组和对照组，实验组采用NFATC3抗体作为孵育抗体，对照组采用新西兰兔免疫前血清IgG (由蛋白G亲和柱纯化获得)作为孵育抗体;PCR引物设计上游引物为5，-ctctctgtgacagctcagtc-3’，下游引物为5，- TTGGTAGGTTACTGGGAAGA-3’ ； PCR目标产物包括由上述转录因子结合位点预测软件TESS所预测的NFATC3与MDRl启动子的结合区域。实验结果
实验结果见图3。由图3-A可知，转录因子结合位点预测软件TESS预测在MDRl转录起始位点上游1500bp处的启动子序列中，有ー个NFATC3结合位点，其结合位点碱基序列为TTTTCC (在图中用下划线标出)；图3-B -542^-537指预测的上述结合位点其碱基序列位于MDRl转录起始位点上游-542 -537区域，-725 -356指在CHIP实验中，PCR产物的碱基序列位于MDRl转录起始位点上游_725'356区域，ATG为P-gp的翻译起始位点，通过琼脂糖凝胶电泳分析表明，在实验组(Anti-NFATC3)中，MCF-7/ADM样品(在图中为ADM)的PCR产物量明显多于MCF-7/WT样品(在图中为WT)的PCR产物量，在对照组(serum)中，两者几乎都没有PCR产物。该实验结果表明，在高水平表达P-gp的MCF-7/ADM中，转录因子NFATC3能与MDRl基因的启动子区域相结合，且该结合位点位于上述TESS所预测的结合区域范围内。实施例3由TRPC5介导的细胞外钙内流对转录因子NFATC3的激活作用 实验方法
将能稳定表达TRPC5的HEK293细胞以每孔3万个细胞的密度接种于24孔板，置于5%C02恒温细胞培养箱中培养12h后进行共转染，共转染体系为0. 2 Ug报告质粒(mdrl-luc 或 NFAT 结合位点缺失质粒 Λ TTTTCCidrl-luc，其中，Δ TTTTCC-mdrl-luc 是运用定点突变试剂盒Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit并按照该试剂盒操作说明书所述方法将实施例2中TESS预测的结合位点区域内的碱基进行缺失突变所得，引物设计上游引物为 5’ -GTAAACAAATGAATTTCCATAAAGCTAATTTATCTTTATAATACTTATTACTTCAAATTCTTGTTACATTT-3'下游引物为 5’ -AAATGAACAA GAATTTGAAGTAATAAGTATTATAAAGATAAATTAGCTTTATGGAAATTCATTTGTTTAC-3’)，O. 2 μ g 表达质粒(pCDNA6A_NFATc3 或空载体对照质粒pO)NA6A) , O. 04 μ g内參质粒(pRL-CMV);用100 μ M氨甲酰胆碱(carbachol)处理上述经共转染的HEK293以激活TRPC5，继续培养48h后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明书所述方法进行检測，以海肾荧光素酶活性作为内參，以萤火虫荧光素酶活性代表转录因子NFATC3的转录活性。
按常规实验方法构建绿色荧光蛋白GFP基因和NFATC3基因的重组质粒，并将该重组质粒转染能稳定表达TRPC5的HEK293，用100 μ M carbachol处理上述经转染的HEK293以激活TRPC5，然后用荧光显微镜观察带有绿色荧光蛋白的NFATC3在上述HEK293中的定位情況。实验结果
实验结果见图4。由图4-A可知，当TRPC5未被carbachol激活时(Vehicle组)，MDRl的转录活性没有显著性差异，当carbachol激活TRPC5活性后(Carbachol组)，转录因子NFATC3的转录活性显著增強，当上述TESS预测的结合位点区域内的碱基缺失时，其转录活性又发生明显下降；由图4-B可知，当carbachol激活TRPC5使细胞外钙内流后，随着时间的延长(0min、10min、30min、50min), NFATC3逐渐由胞衆转移至胞核，即逐渐被激活。该实验结果表明，由TRPC5介导的细胞外钙内流能明显激活NFATC3的转录活性从而上调p_gp的表达水平。实施例4 NFATC3抑制剂对肿瘤细胞多药耐药的逆转作用 实验方法
将MCF-7/ADM按每孔30万个细胞的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后在孔板中分别加入 NFATC3 抑制剂 VIVIT、FK506 及 CyclosporinA，VIVIT 组药物剂量为I μ Μ、2 μ M、0. 1%DMS0 (对照组);FK506 组药物剂量为:、5 μ Μ、10 μ Μ、0· 1%DMS0 (对照组);CyclosporinA组药物剂量为7. 5 μ M、15 μ M、0. 1%DMS0 (对照组)，将细胞置于5%C02恒温细胞培养箱培养过夜后，收集每孔细胞，按照常规操作方法，运用Western blot检测各种NFATC3抑制剂对P-gp表达的影响，其中，孵育ー抗为Anti-P-gp (SC-55510)，孵育二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L) (A0216)。将MCF-7/ADM和MCF-7/WT分别接种于25cm2的细胞瓶中，当MCF-7/ADM细胞汇集80% 时分别加入 NFATC3 抑制剂 VIVIT (2 M)、FK506 (10 M)、CyclosporinA (15 M)及0. 1%DMS0 (对照组)，MCF-7/WT不经任何药物处理，将细胞置于5%C02恒温细胞培养箱中培养过夜，分别收集经上述药物处理的MCF-7/ADM细胞和未经药物处理的MCF-7/WT细胞，按照每孔7000个细胞的密度接种于96孔板，24小时后按照浓度梯度加入阿霉素，培养48小时后，用MTT法检测细胞的药敏性。实验结果
实验结果见图5。由图5-A可知，与对照组相比，随着NFATC3抑制剂浓度的逐渐增加，MCF-7/ADM中P-gp表达水平逐渐下调；由图5-B可知，多药耐药肿瘤细胞(MCF-7/ADM)对阿霉素的敏感性明显低于野生型细胞(MCF-7/WT)，而当多药耐药肿瘤细胞(MCF-7/ADM)经NFAC3抑制剂处理后，其药敏性明显增強。该实验结果表明，NFATC3抑制剂对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，提示转录因子NFATC3可作为新的药物靶点为逆转肿瘤多药耐药提供新的思路。以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
2.根据权利I所述转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐中的应用，其特征在于所述药物为NFATC3抑制剂，包括他克莫司、环孢菌素A或VIVIT。
3.根据权利I所述转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐中的应用，其特征在于所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。
全文摘要
本发明提供转录因子NFATC3的一种新用途，即转录因子NFATC3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用，所述药物为NFATC3抑制剂，包括他克莫司、环孢菌素A或VIVIT，所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本发明的重要之处是发现了转录因子NFATC3与肿瘤多药耐药密切相关，以及NFATC3抑制剂对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且上述抑制剂本身毒副作用很小，因此，本发明为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。
文档编号A61K45/00GK102805867SQ201210318388
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月2日 优先权日2012年9月2日
发明者金坚, 马鑫, 陈蕴, 何冬旭, 蔡燕飞 申请人:江南大学